Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Podsumowanie

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Streszczenie

Odkrywanie nowych biomateriałów zoptymalizowanych pod kątem konkretnych zastosowań biologicznych jest łatwo osiągalne dzięki zastosowaniu polimerowych mikrotablic, które umożliwiają przesiewanie kombinatorycznej biblioteki materiałów w równoległym formacie wysokoprzepustowym¹. W niniejszym opracowaniu opisano tworzenie i charakterystykę polimerowej mikrotablicy z wykorzystaniem techniki fotopolimeryzacji na płytce (on-chip)². Proces ten polega na mieszaniu monomerów w różnych proporcjach w celu wytworzenia biblioteki roztworów monomerowych, przenoszeniu roztworów na szkiełko przedmiotowe za pomocą robotycznego urządzenia drukującego oraz utwardzaniu poprzez naświetlanie promieniami UV. Format ten jest łatwo dostosowany do wielu testów biologicznych, w tym badania adhezji i proliferacji komórek macierzystych, sortowania komórek oraz niskiej adhezji bakteryjnej, co pozwala na szybką identyfikację materiałów typu „hit”, które spełniają określone kryterium biologiczne^3-5. Ponadto zastosowanie wysokoprzepustowej charakterystyki powierzchni (HTSC) pozwala powiązać wyniki biologiczne z właściwościami fizykochemicznymi, co wyjaśnia mechanizm oddziaływania biologiczno-materiałowego⁶. HTSC wykorzystuje pomiary kąta zwilżania wodą (WCA), mikroskopię sił atomowych (AFM), spektroskopię fotoelektronów emitowanych rentgenowsko (XPS) oraz spektrometrię mas jonów wtórnych w czasie przelotu (ToF-SIMS). W szczególności ToF-SIMS zapewnia bogatą chemicznie analizę próbki, która może być wykorzystana do powiązania reakcji komórkowej z konkretną grupą molekularną. W niektórych przypadkach wydajność biologiczna może być przewidziana na podstawie widm ToF-SIMS, co wykazuje zależność chemiczną oddziaływania biologiczno-materiałowego i dostarcza informacji niezbędnych do opracowywania materiałów typu hit^5,3.

Protokół

1. Przygotowanie tła o niskim poziomie niespecyficznego wiązania

1. Odważ 2 g poli(metakrylanu hydroksyetylu) (pHEMA) (Sigma - testowany w hodowlach komórkowych) do probówki wiriówek o pojemności 50 mL. Rozpuść w 50 mL 95% (v/v) etanolu w wodzie. Zazwyczaj wymaga to 24 h sonikacji.
2. Wykonaj powłokę metodą dip-coatingu na szkiełku przedmiotowym z funkcjonalizacją epoksydową (Genetix), używając roztworu pHEMA. Grupy epoksydowe szybko utworzą wiązania kowalencyjne z powłoką pHEMA. Proces dip-coatingu przeprowadza się, trzymając szkiełko pęsetą i zanurzając je w roztworze. Zazwyczaj 5 mm szkiełka pozostawia się niepowleczone, co ułatwia orientację szkiełka i może służyć jako pozytywna kontrola powierzchni adhezyjnej. Następnie szkiełko wyciąga się z roztworu pHEMA w ciągu 1 s, odwraca i pozostawia do wyschnięcia w pozycji niemal poziomej przez 10 min przed umieszczeniem w uchwycie do szkiełek.
3. Powleczone pHEMA szkiełka pozostawia się w warunkach atmosferycznych przez 1 tydzień, aby umożliwić całkowite odparowanie rozpuszczalnika.

2. Przygotowanie roztworu monomeru

1. Odważ 120 mg fotoinicjatora 2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonu i dodaj do 3 mL dimetyloformamidu (DMF), aby przygotować 4% (w/v) roztwór fotoinicjatora. Najlepiej przygotować go bezpośrednio przed każdym procesem drukowania, dzięki czemu masę i objętość roztworu można dostosować do potrzebnej ilości roztworu fotoinicjatora. Roztwór jest stabilny do miesiąca.
2. Roztwory monomerów przygotowuje się poprzez dodanie 1 części roztworu fotoinicjatora do 3 części czystego monomeru. Osiąga się to poprzez pipetowanie 5 μL roztworu fotoinicjatora i 15 μL monomeru do płytki źródłowej z 384 dołkami. Objętość całkowita 20 μL jest idealna do tworzenia plamek. Większe objętości wymagają dodatkowego odsączania przed uzyskaniem jednorodnych plamek. Mniejsze objętości mogą skutkować niepełnym napełnieniem pinu.
3. Metoda ta jest obecnie ograniczona do stosowania monomerów akrylanowych/metakrylanowych rozpuszczalnych w DMF, ponieważ były to jedyne badane kombinacje; akrylamidy i inne rozpuszczalniki prawdopodobnie również będą odpowiednie dla procesu drukowania. Aby uzyskać sugerowane stężenie monomeru (75% w/w), wymagane są monomery w formie ciekłej, choć w przypadku monomerów stałych można stosować niższe stężenia (zmniejszone stężenie monomeru nie wydaje się niekorzystnie wpływać na chemię powierzchni otrzymanego polimeru, jednak prawdopodobnie ulega zmianie masa cząsteczkowa i temperatura przejścia szklistego). Monomery bardzo lotne są trudne w zastosowaniu ze względu na szybkie odparowywanie przed etapem utwardzania UV podczas polimeryzacji. W zależności od liczby roztworów monomerów proces może trwać do 6 godzin, a pod koniec cyklu lotne monomery odparują z płytki źródłowej. Stosowanie lotnych monomerów jest możliwe poprzez chłodzenie platformy drukującej i przeprowadzanie wyłącznie krótkich serii drukowania.
4. Z wyjątkiem kilku silnie hydrofilowych monomerów, takich jak akrylan poli(glikolu etylenowego), nie zaobserwowano rozpuszczania otrzymanych plamek polimeru w buforach wodnych, zatem stosowanie monomeru sieciującego nie jest wymagane, choć nie jest wykluczone.

3. Tworzenie polimerowej mikroarray

Typowy przebieg procedury tworzenia polimerowej mikromacierzy przedstawiono schematycznie na Rysunku 1.

1. Tworzenie mikromacierzy odbywa się za pomocą robota kontaktowego (Biodot) z wykorzystaniem stolika XYZ (Rycina 2). Stosowane są piny z nacięciami o średnicy 220 μm (Arrayit 96B). Wszystkie piny oraz uchwyt pinów należy oczyścić w myjce ultradźwiękowej w dichlorometanie przez 10 min przed rozpoczęciem drukowania.
2. Piny są umieszczane w uchwycie, ładuje się szkiełka do odsączania i szkiełka do macierzy, a następnie całą komorę napełnia się argonem, aby obniżyć poziom tlenu poniżej 2000 ppm, co jest wartością wystarczająco niską, by zapobiec wygaszaniu rodników polimeryzacji przez tlen. Wilgotność utrzymuje się na poziomie 30-40%. Utrzymanie wilgotności pozwala na pęcznienie pHEMA, co umożliwia utworzonemu polimerowi przenikanie przez warstwę pHEMA i fizyczne związanie z powierzchnią ².
3. Rozpoczyna się proces drukowania. Każdy cykl składa się z:
   • Pobrania próbki z płytki źródłowej. Piny są opuszczane do roztworów z prędkością 25 mm/s, utrzymywane w roztworze przez 2,5 s, a następnie wycofywane z prędkością 25 mm/s (Rycina 2).
   • Przed drukowaniem piny muszą zostać odsączone, aby usunąć roztwór monomeru z zewnętrznej powierzchni pinu. W rezultacie dozowanie monomeru odbywa się z części naciętej pinu, co zapewnia powtarzalne tworzenie plamek. Zastosowana sekwencja odsączania składa się z 33 kontaktów z czystym szkiełkiem szklanym. Dla pierwszych czterech pozycji liczba kontaktów wynosi odpowiednio 10, 5, 4 i 3. Dla kolejnych czterech pozycji wykonuje się 2 kontakty, a dla ostatnich 3 pozycji – 1 kontakt. Całkowity czas każdego kontaktu wynosi 10 ms, a prędkość zbliżania i wycofania to 175 mm/s. Na tym etapie utworzone plamki powinny mieć jednolity kształt i geometrię. Niepowodzenie na tym etapie wskazuje na zanieczyszczenie pinów lub obecność pyłu w roztworach monomerów.
   • Następnie roztwory monomerów są nanoszone na szkiełka szklane powlekane pHEMA (Rycina 2). Dla każdej plamki wykonuje się jeden kontakt przy prędkości ruchu pinu 175 mm/s i czasie kontaktu 10 ms, co w zależności od lepkości i energii powierzchniowej roztworu monomeru daje średnicę plamki ok. 400 μm. Zazwyczaj na każdym szkiełku drukuje się 3 powtórne macierze, a w jednym cyklu drukuje się łącznie 10 szkiełek. Odpowiada to 30 plamkom na cykl.
   • Piny są płukane w DMF. Na cały cykl płukania dostarczane jest 2,5 L świeżego DMF. Piny są płukane w kąpieli przepływowej z mieszaniem.
   • Równolegle z płukaniem, świeżo wydrukowane szkiełka są naświetlane krótkofalowym źródłem UV (365 nm) o gęstości 30 mV/cm² przez czas trwania okresu płukania, który wynosi 30 s.
4. Po naniesieniu wszystkich roztworów monomerów macierze są naświetlane UV (365 nm) przez dodatkowe 10 min.
5. Świeżo wydrukowane macierze są przechowywane pod niskim ciśnieniem (<50 mTorr) przez 1 tydzień w celu usunięcia nieprzereagowanego monomeru i rozpuszczalnika.

4. Wysoko wydajna charakterystyka powierzchni (HTSC)

Ogólny schemat technik HTSC przedstawiono na rysunku 3. Kluczowym elementem zautomatyzowanego podejścia o wysokiej przepustowości jest wyrównanie mikromacierzy polimerowej z aparaturą charakteryzującą. W każdym przypadku jest to osiągane za pomocą kamery, która zapewnia widok z góry na macierz. Początkowo macierz jest obracana, aby wyrównać ją z ruchem platformy w osiach X-Y. Następnie lokalizuje się punkt narożny macierzy i przypisuje mu określone współrzędne. Pozycję każdego punktu polimerowego można wówczas przewidzieć na podstawie wymiarów macierzy.

1. Pomiary kąta zwilżania wodą (WCA)
   1. Pomiary WCA są wykonywane metodą kropli osiadłej przy użyciu zautomatyzowanego instrumentu Krüss DSA 100. Pojedyncza kropla wody o objętości ~400 pL jest dozowana za pomocą głowicy drukującej sterowanej piezoelektrycznie na każdą plamkę polimeru. Średnica plamki polimeru wynosi zazwyczaj 300 μm, a średnica podstawy kropli wody na plamce polimeru zazwyczaj 100 μm, w związku z czym z każdej plamki polimeru można uzyskać tylko jeden pomiar.
   2. Stół X-Y umożliwia zautomatyzowane pozycjonowanie każdej plamki polimeru pod głowicą drukującą ⁷. Jest to realizowane za pomocą kamery znajdującej się nad próbką, która zapewnia widok z góry na macierz. Początkowo należy dostosować pozycję kamery, aby zrównać dozowanie kropli wody z centrum pola widzenia kamery, a następnie można wyrównać macierz względem głowicy drukującej.
   3. Kamera o wysokiej szybkości rejestruje profil boczny kropli w momencie uderzenia o powierzchnię i jej późniejszego odparowania. Klatka utrwalająca początkowy moment uderzenia kropli jest wykorzystywana do pomiaru kąta zwilżania. Do profilu kropli dopasowywany jest okrąg, na podstawie którego wyznaczany jest kąt zwilżania.
2. Wtórna spektrometria mas z pomiarem czasu przelotu (ToF-SIMS)
   1. Próbkę ładuje się na stół. Polega to najpierw na wyłożeniu stołu czystą folią Al, co pomaga w kompensacji ładunku, a następnie na unieruchomieniu szkiełka za pomocą metalowych zakładek z wkrętami.
   2. Stół z próbką jest umieszczany w komorze transferowej urządzenia ToF-SIMS i odpompowywany do ciśnienia 1,6 × 10^-6 mbar. Następnie próbka jest przenoszona do głównej komory analitycznej, w której ciśnienie próżni wynosi zazwyczaj 1,0 × 10^-8 mbar.
   3. Pomiary ToF-SIMS są przeprowadzane przy użyciu instrumentu ION-ToF IV z monoizotopowym źródłem jonów pierwotnych Bi₃₊ pracującym przy napięciu 25 kV w trybie paczkowym („bunched mode”). Impulsowa wiązka jonów pierwotnych o natężeniu 1 pA jest skanowana rastrowo po obszarze analizy, przy czym dodatnie i ujemne jony wtórne są zbierane z obszaru 100 × 100 μm każdej plamki polimeru w mikro macierzy przez 10 sekund czasu akwizycji. Masy jonów wyznaczano za pomocą analizatora czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości, co umożliwiło dokładne przypisanie masy. Typowa rozdzielczość masy (przy m/z 41) wynosiła nieco ponad 6000. Do kompensacji ładowania powierzchni spowodowanego dodatnio naładowaną wiązką jonów pierwotnych na powierzchniach izolacyjnych stosowano elektrony o niskiej energii (20 eV) ⁸.
3. Skaningowa mikroskopia sił atomowych (AFM)
   1. Do analizy macierzy na szkiełku przedmiotowym wymagany jest AFM z dużym stołem i automatycznym pozycjonowaniem. Do tego celu idealny jest mikroskop Dimension lub ICON.
   2. Próbkę umieszcza się na stole, a pozycję stołu ustawia się na prawym górnym rogu macierzy.
   3. Wyznaczana jest pozycja lewego dolnego rogu macierzy, co pozwala na interpolację pozycji wszystkich pozostałych plamek.
   4. Generowana jest lista pozycji, która jest wprowadzana do funkcji automatycznego próbkowania oprogramowania.
   5. Pomiary AFM są wykonywane przy użyciu instrumentu Nanoscope 3000A w trybie stukowym (tapping mode). Stosowane są końcówki krzemowe o częstotliwości rezonansowej około 300 kHz i stałej siły 40 N/m (Tap300Al, Budget Sensors). Pomiarom podlegają obszary polimeru o wymiarach 5x5 μm ⁹.
   6. Chropowatość średnio kwadratowa (RMS) w tym obszarze dla każdego obrazu jest mierzona przy użyciu oprogramowania do przetwarzania wsadowego SPIP. Każdy obraz jest początkowo spłaszczany przed pomiarami chropowatości.
   7. Wszystkie obrazy wymagają ręcznego przeglądu w celu zidentyfikowania artefaktów obrazowania, które mogą wymagać usunięcia z pomiarów chropowatości. Na tym etapie obrazy mogą być również kategoryzowane na podstawie wspólnych cech powierzchni ⁹.
4. Rentgenowska spektroskopia fotoelektronów (XPS)
   1. Szkiełko z mikro macierzą jest mocowane do listwy na próbki za pomocą dwustronnej taśmy, a następnie ładowane do komory próbkowej instrumentu Kratos Axis Ultra XPS.
   2. Próbkę wprowadza się do komory i oczekuje, aż ciśnienie spadnie poniżej 10^-8 Torr.
   3. Wybierane są odpowiednie parametry operacyjne, takie jak monochromatyczne źródło promieniowania X (Al, 1486,6 eV), potencjał i prąd anody (10 kV i 15 mA), rozmiar przysłony (110 μm), energia przejścia (80 eV dla skanu szerokiego i 20 eV dla skanu o wysokiej rozdzielczości). Źródło promieniowania X jest ogniskowane przy użyciu dwóch przeciwległych rogów mikro macierzy i optymalizacji sygnału tlenu z próbki. Następnie wyznaczane i zapisywane w formie listy pozycji są współrzędne x i y poszczególnych plamek.
   4. Tworzony jest wykres programu, który jest następnie uruchamiany w celu akwizycji danych, w tym skanów szerokich i skanów o wysokiej rozdzielczości dla konkretnych pierwiastków.
5. Spektroskopia Ramana
   1. Widma Ramana dla każdej plamki polimeru są rejestrowane przy użyciu mikroskopu Ramanowskiego LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Początkowo sygnał Ramana jest kalibrowany przy użyciu wafla krzemowego i przesunięcia Ramanowskiego Si przy 520,7 cm^-1.
   2. Następnie próbkę umieszcza się na stole i dostosowuje ogniskowanie lasera (długość fali = 523 nm), aby zmaksymalizować przesunięcie Ramanowskie C-H przy 2950 cm^-1.
   3. Pozycja centrum lewej górnej plamki w mikro macierzy jest ustawiana jako punkt początkowy, a mapa mikro macierzy jest konfigurowana przy użyciu funkcji macierzy w oprogramowaniu labRAM HR.
   4. Dla każdej próbki kumulatywnie rejestrowanych jest 10 widm z czasem naświetlania 0,5 s.

5. Analiza bakteryjna

Układ ten może być wykorzystywany w wielu różnych testach biologicznych, w tym do badania adhezji i proliferacji komórek macierzystych, innych typów komórek oraz bakterii ^3,10,4. W niniejszym rozdziale opisujemy test adhezji bakteryjnej, który został przedstawiony schematycznie na Rysunku 4.

1. Szczep bakteryjny transformowany plazmidem ekspresyjnym GFP hoduje się przez noc w temperaturze 37 °C w 10 mL pożywki LB w probówce typu Falcon o pojemności 50 mL, wytrząsając z prędkością 200 rpm.
2. Pomiar OD₆₀₀ kultury bakterii i przeniesienie odpowiedniej ilości hodowli nocnej do 15 mL zdefiniowanej pożywki RPMI-1640 w celu uzyskania końcowego OD₆₀₀ wynoszącego 0,01.
3. Macierze poddaje się wstępnemu płukaniu w sterylnej wodzie destylowanej przez 10 min, aby usunąć z nich wszelkie rozpuszczalne składniki (nieupolimeryzowany monomer, oligomery i rozpuszczalnik).
4. Wypłukane szkiełka z macierzami umieszcza się w czystej szalce Petriego i sterylizuje promieniami UV przez 10 min.
5. Szkiełko z macierzą umieszcza się w szalce Petriego i dodaje 15 mL zaszczepionej pożywki RMPI-1640. Równolegle drugie szkiełko umieszcza się w szalce Petriego i inkubuje z niezaszczepioną pożywką RPMI-1640 jako kontrolę.
6. Szkiełka inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, wytrząsając z prędkością 60 rpm.
7. Szkiełka płucze się dwukrotnie 15 mL sterylnego PBS.
8. Szkiełka płucze się dwukrotnie 15 mL sterylnej wody destylowanej.
9. Szkiełka suszy się na powietrzu.
10. Obrazy szkiełek wykonuje się przy użyciu skanera GenePix Autoloader 4200AL (Molecular Devices, US) z laserem wzbudzającym o długości fali 488 nm i standardowym niebieskim filtrem emisyjnym (510-560nm). Reprezentatywny obraz autofluorescencji polimeru przedstawiono na Rysunku 2. Należy to zrobić jak najszybciej, aby uniknąć degradacji GFP. Jeśli nie jest to możliwe, komórki powinny zostać poddane fiksacji. Ponadto, w celu normalizacji wyników i zapewnienia ilościowej porównywalności eksperymentów przeprowadzonych w różne dni, niezbędne jest zastosowanie odpowiednich kontroli pozytywnych o znanej odpowiedzi bakteryjnej. Całkowitą intensywność fluorescencji plamek polimerowych rejestruje się przy użyciu oprogramowania GenePix Pro 6 (Molecular Devices, US). Procedurę tę wykonuje się zarówno dla szkiełek inkubowanych z bakteriami, jak i tylko z pożywką. Aby wyznaczyć fluorescencję wynikającą ze wzrostu bakterii, od fluorescencji zmierzonej na szkiełku inkubowanym z bakteriami odejmuje się fluorescencję z kontroli z samą pożywką.
11. Szkiełka można również barwić barwnikiem kwasów nukleinowych SYTO17 o stężeniu 20 μM (Invitrogen, UK) w temperaturze pokojowej przez 30 minut i obrazować za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego Carl Zeiss LSM 700 z oprogramowaniem do obrazowania ZEN 2009 (Carl Zeiss, Germany). Stopień pokrycia powierzchni przez bakterie określa się przy użyciu darmowego oprogramowania Image J 1.44 (National Institute of Health, US).

6. Reprezentatywne wyniki

Warunki drukowania zostały zoptymalizowane w celu uzyskania polimerowych mikrotablic najwyższej jakości. Wilgotność powinna być utrzymywana w przedziale 30-40%. W przypadku tablic drukowanych przy wilgotności poniżej 30% często obserwowano delaminację plamek polimerowych w środowiskach wodnych, co sugeruje, że taka wilgotność jest niewystarczająca do napęcznienia warstwy pHEMA i umożliwienia fizycznego uwięzienia polimeru na podłożu. Wilgotność można dalej zwiększać w celu zmiany średnicy plamek polimerowych, jednak zależy to od chemii monomeru. Na przykład, przy drukowaniu równych objętości roztworu polimeryzacyjnego i zwiększaniu wilgotności z 40 do 80%, średnica plamki zmniejszyła się z 430 μm do 370 μm dla monomeru zawierającego hydrofilową grupę glikolu etylenowego, podczas gdy dla monomeru zawierającego hydrofobową alifatyczną strukturę pierścienia węglowego średnica plamki zwiększyła się z 290 μm do 350 μm (Rysunek 5).

Stopień polimeryzacji można monitorować za pomocą spektroskopii Ramana, mierząc przesunięcie Ramanowskie wiązania C=C wykrywane przy 1640 cm^-1, które należy znormalizować względem przesunięcia Ramanowskiego wiązania C=O przy 1720 cm^-1. Widma Ramanowskie zmierzono dla plamek polimeru polimeryzowanych przy różnym czasie naświetlania UV (rycina 6). Stosunek C=C:C=O malał wraz ze wzrostem czasu naświetlania UV od 0 do 50 s, po czym przy dalszym naświetlaniu UV nie zaobserwowano już spadku tego stosunku (rycina 6). Widma Ramanowskie zmierzono również dla plamek polimeru polimeryzowanych przy różnych poziomach O₂; zaobserwowano przesunięcie Ramanowskie C=C wraz z obniżaniem poziomu O₂ do 2000 ppm, jednak dla poziomu O₂ poniżej tej wartości nie odnotowano dalszej redukcji (rycina 7A). Spektroskopia Ramana wykazała również zdolność etapu ekstrakcji próżniowej do usuwania nieupolimeryzowanego monomeru. Przed ekstrakcją próżniową przesunięcie Ramanowskie C=C było większe dla polimeru polimeryzowanego przy 3300 ppm w porównaniu do 2000 ppm (rycina 7A), natomiast po ekstrakcji próżniowej wysokość przesunięcia Ramanowskiego jest nieodróżnialna (rycina 7B), co sugeruje, że podczas etapu ekstrakcji próżniowej usunięto cały nieupolimeryzowany monomer. Podsumowując, warunki polimeryzacji obejmują wilgotność 30-40%, naświetlanie UV dłuższe niż 50 s przy poziomie O₂ poniżej 2000 ppm oraz etap ekstrakcji próżniowej po drukowaniu przez 7 dni.

Po drukowaniu i ekstrakcji próżniowej sukces polimeryzacji plamek polimerowych można ocenić za pomocą zwykłej mikroskopii świetlnej w celu zidentyfikowania anomalnych morfologii plamek. Zazwyczaj plamki powinny być okrągłe i jednorodne, jak pokazano na rycinie 8 po lewej stronie. Prawdopodobną przyczyną zmiany geometrii jest uszkodzona lub nieczysta igła. Dla niewielkiej liczby kombinacji monomerów zaobserwowaliśmy zdeformowane plamki, na przykład plamkę centralną z satelitami małych plamek, pokazane na rycinie 8 po prawej stronie, lub kształt „sadzonego jajka”, gdzie plamka centralna znajduje się na większej, bardziej płaskiej plamce. Może to być spowodowane separacją faz przed drukowaniem, wynikającą z różnic w lepkości, hydrofilowości, lotności lub napięciu powierzchniowym monomerów, co sugeruje, że dana kombinacja monomerów nie jest kompatybilna z tym formatem. Dodatkowe mapowanie chemiczne plamek polimerowych za pomocą technik takich jak ToF-SIMS jest również ważnym i niekiedy niezbędnym etapem kontroli jakości w celu określenia rozkładu składu chemicznego materiałów w obrębie plamek i całej macierzy. Technika ta pozwala zidentyfikować nadmierne rozprzestrzenianie się niektórych materiałów, niewidoczne w mikroskopii świetlnej, oraz wykryć separację faz wewnątrz poszczególnych plamek polimerowych.

Rycina 1. Schemat przedstawiający poszczególne etapy tworzenia plamki polimerowej.

Rysunek 2. Schemat metodologii drukowania igłowego (pin printing), obejmujący początkowe załadowanie igły monomerem z płytki źródłowej, a następnie naniesienie monomeru na podłoże poprzez kontakt. Igła jest sterowana przez robotyczne ramię X-Y-Z. Wstawka przedstawia typowy obraz autofluorescencji macierzy po procesie produkcji.

Rysunek 3. Schemat przedstawiający techniki związane z HTSC oraz testy biologiczne stosowane w badaniach polimerowych mikromacierzy.

Rysunek 4. Schemat testu przylegania bakterii.

Rysunek 5. Średnica plamki polimeru wydrukowanego przy różnej wilgotności dla dwóch różnych monomerów: akrylanu 4-tert-butylcykloheksylu oraz metakrylanu eteru etylowego diglikolu etylenowego.

Rysunek 6. Stosunek intensywności Ramana dla przesunięcia Ramanowskiego C=C przy 1640 cm^-1 i przesunięcia Ramanowskiego C=O przy 1720 cm^-1 z plamek polimeru akrylanu 4-tert-butylcykloheksylu przy różnym czasie ekspozycji na UV. Słupki błędów odpowiadają jednemu odchyleniu standardowemu (n = 3).

Rycina 7. Widma Ramanowskie zmierzone dla plamek polimeru akrylanu 4-tert-butylcykloheksylu nadrukowanych przy różnych poziomach O₂, wskazanych po lewej stronie każdego widma, (A) przed i (B) po ekstrakcji próżniowej. Stosunek intensywności sygnału Ramanowskiego dla przesunięcia C=C przy 1640 cm^-1 do przesunięcia C=O przy 1720 cm^-1 jest przedstawiony po prawej stronie każdego widma.

Rycina 8. Obraz z mikroskopii świetlnej dwóch plamek polimerowych. Plamka po lewej stronie przedstawia dobrze uformowaną plamkę, natomiast plamka po prawej jest przykładem plamki zawierającej bardzo niernomierny rozkład monomeru. Pasek skali wynosi 500 μm.

Dyskusja

Mikromacierzy polimerowe z powodzeniem wykorzystuje się do odkrywania nowych materiałów poprzez przesiewanie setek nowych polimerów w testach biologicznych i identyfikację materiałów typu „hit”, które mogą być następnie skalowane do przydatnych urządzeń. W tym przypadku opisana charakterystyka powierzchni może zostać zastosowana po teście biologicznym i wyłącznie w odniesieniu do materiałów typu „hit” w celu dokładniejszego zbadania tych substancji. Strategia ta może być interesująca, jeśli badacz stosujący to podejście nie ma dostępu do HTSC. Jednakże, aby w pełni wykorzystać mikromacierzy polimerowe do badania oddziaływań biologiczno-materiałowych, cała macierz obejmująca setki materiałów powinna zostać przeanalizowana przed testami biologicznymi przy użyciu metodologii HTSC, co może w dalszej kolejności służyć do obserwacji ogólnych trendów zależności struktura-funkcja.

Druk kontaktowy opiera się na swobodnym przesuwaniu się metalowego pinu w górę i w dół wewnątrz uchwytu pinu. Czystość pinu oraz uchwytu pinu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pomyślnego przebiegu druku i powinna być rygorystycznie przestrzegana. Przed rozpoczęciem serii drukowania można sprawdzić prawidłowość ruchu pinu w uchwycie, wykonując próbny rozruch na sucho, bez obecności monomerów. Etap czyszczenia należy powtarzać do momentu uzyskania powtarzalnego ruchu pinu.

Znaczna uwaga powinna zostać poświęcona projektowaniu mieszaniny monomerów. W celu łatwego wytworzenia kombinatorycznej biblioteki polimerów, setki kopolimerów tworzy się poprzez mieszanie kilku monomerów w różnych proporcjach. Zazwyczaj przygotowuje się biblioteki składające się z 576 elementów, ponieważ tworzą one macierz 24 x 24, która jest dopasowana do geometrii szkiełka przedmiotowego. Aby stworzyć bibliotekę kombinatoryczną eksplorującą największą przestrzeń kombinatoryczną, najprostszą metodą jest parowe mieszanie 24 monomerów w stosunku 2:1. Alternatywnie, wprowadzenie gradientów składu w obrębie macierzy jest przydatne do obserwacji trendów, co pozwala na wyznaczenie optymalnych składów monomerów. Jako przykład, 22 monomery mogą zostać użyte jako pierwszy składnik mieszaniny ko-monomerów, która jest sekwencyjnie rozcieńczana jednym z 6 drugich składników. Jeśli zastosuje się 5 rozcieńczeń, na przykład mieszając pierwszy i drugi składnik w stosunkach 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 i 10:90, zaowocuje to 488 unikalnych roztworów kopolimerów. Aby zwiększyć łączną liczbę do 576, można wprowadzić powtórzenia homopolimerów z użytych monomerów, co często stanowi istotną próbkę referencyjną. 576 roztworów monomerów należy rozdzielić do dwóch płytek 384-dołkowych. W celu zaprogramowania robota łatwiej jest zastosować dwie identyczne płytki pod względem rozmieszczenia monomerów, zatem roztwory monomerów powinny zostać rozdzielone równomiernie pomiędzy obie płytki.

Znaczną ilość czasu podczas przygotowywania płytek źródłowych można zaoszczędzić dzięki zastosowaniu pipet wielokanałowych, dlatego układ płytek źródłowych powinien zostać zaplanowany w sposób umożliwiający wykorzystanie tych pipet.

Aby przeprowadzić zautomatyzowaną analizę HTSC macierzy, pozycja plamki musi zostać prawidłowo zsynchronizowana z aparaturą charakteryzującą. Zazwyczaj rozstaw macierzy akrylowej wynosi 500-1000 μm, a średnica polimerowej plamki to 300 μm. Większość stołów X-Y posiada rozdzielczość poniżej 10 μm, zatem istnieje odpowiednia tolerancja, aby aparatura do charakteryzacji powierzchni mogła niezawodnie uzyskać dostęp do pozycji w macierzy po wprowadzeniu prawidłowych wymiarów do oprogramowania pozycjonującego próbkę. Ograniczeniem w automatycznym pozycjonowaniu jest w rzeczywistości precyzyjny druk macierzy. Aby zapewnić dokładność druku, ważne jest zapobieganie przesuwaniu się podłoża na stole drukującym, stosując ssanie próżniowe lub zaciski sprężynowe wraz z odpowiednimi wymiarami szkiełka (należy pamiętać, że istnieją standardowe rozmiary szkiełek według normy amerykańskiej i europejskiej).

ToF-SIMS jest techniką niezwykle czułą powierzchniowo, która pozwala wykryć wszelkie zanieczyszczenia na próbkach. W związku z tym należy zachować najwyższą ostrożność, aby uniknąć kontaktu z powierzchnią. Próbki należy przenosić w czystych rękawiczkach (najlepiej polietylenowych) i za pomocą świeżo oczyszczonych pincet, unikając jednak dotykania badanej powierzchni. Zazwyczaj przemywamy narzędzia chloroformem i heksanem. Przechowywanie próbek przed pomiarami najlepiej realizować w uchwycie, który oddziela od siebie szkiełka, na przykład w uchwycie na 5 lub 20 szkiełek.

Macierze zostały zaprojektowane specjalnie tak, aby były kompatybilne z wieloma formatami analiz biologicznymi i metodami odczytu; zastosowanym podłożem jest zatem szkiełko przedmiotowe, idealnie dostosowane do skanerów fluorescencyjnych i mikroskopów świetlnych. Oznacza to, że format ten doskonale nadaje się do badania wielu oddziaływań materiałowo-biologicznych. Ponadto format ten umożliwia równoległe przesiewanie setek materiałów. Pozwala to na przeanalizowanie znacznie większej liczby materiałów niż w przypadku metod konwencjonalnych, w których każdy nowy skład chemiczny materiału jest badany indywidualnie. Rozszerzony zakres oddziaływań biologiczno-materiałowych pozwala na wyjaśnienie mechanizmów interakcji powierzchniowych z układami biologicznymi, a także na znalezienie optymalnego materiału dla danej aplikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lamelki epoksydowe	Genetix	K2652
Drukarka kontaktowa	Biodot	XYZ3060 Platform
Metalowa igła	ArrayIt	946MP6B
Instrument ToF-SIMS	ION-TOF
Instrument XPS	Kratos Analytical
Aparat WCA	Krüss	DSA 100
AFM	Bruker Corporation	Dimension Icon
Pożywka do hodowli komórkowych RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
SYTO17	Invitrogen	S-7579