Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Podsumowanie

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Streszczenie

Choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD) stanowi główną barierę ograniczającą szerokie zastosowanie przeszczepu szpiku kostnego jako terapii leczniczej w różnorodnych niedoborach hematologicznych. GVHD jest wywoływana przez dojrzałe, alloreaktywne limfocyty T obecne w przeszczepie szpiku kostnego, które po wlewieniu do biorcy powodują uszkodzenie narządów gospodarza. Jednak u myszy do inokulum szpiku kostnego należy dodać limfocyty T, aby wywołać GVHD. Choć podjęto szeroko zakrojone prace nad charakterystyką odpowiedzi limfocytów T po przeszczepie, obrazowanie bioluminescencyjne jest nieinwazyjną metodą monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo.

Po letalnym napromieniowaniu myszy biorcze poddawane są przeszczepowi komórek szpiku kostnego i splenocytów od myszy dawców. W przeszczepie uwzględniono subpopulacje limfocytów T pochodzących od myszy L2G85.B6 (myszy transgeniczne konstytutywnie ekspresujące lucyferazę). Poprzez przeszczepienie jedynie wybranych subpopulacji limfocytów T możliwe jest śledzenie konkretnych grup tych komórek in vivo, a na podstawie ich lokalizacji można formułować hipotezy dotyczące roli określonych subpopulacji limfocytów T w promowaniu GVHD w różnych punktach czasowych. W ustalonych odstępach czasu po przeszczepie myszy biorcze są obrazowane przy użyciu kamery Xenogen IVIS CCD. Intensywność światła można skwantyfikować za pomocą oprogramowania Living Image w celu wygenerowania obrazu w pseudokolorach na podstawie intensywności fotonów (czerwony = wysoka intensywność, fioletowy = niska intensywność).

Między 4. a 7. dniem po przeszczepie myszy biorcze zaczynają wykazywać kliniczne objawy GVHD. Cooke et al.¹ opracowali system punktacji do ilościowej oceny progresji choroby na podstawie tekstury futra, integralności skóry, aktywności, utraty masy ciała oraz postawy myszy biorczych. Myszy są oceniane codziennie i poddawane eutanazji w stanie agonalnym. Myszy biorcze zazwyczaj wchodzą w stan agonalny 20-30 dni po przeszczepie.

Modele mysie są cennymi narzędziami w badaniu immunologii GVHD. Selektywne przeszczepianie konkretnych subpopulacji limfocytów T pozwala na dokładną identyfikację roli, jaką odgrywa każda z tych subpopulacji. Nieinwazyjne śledzenie odpowiedzi limfocytów T in vivo stanowi dodatkową wartość modeli mysich GVHD.

Protokół

1. Naświetlanie letalne

1. Umieść do 10 myszy biorców w klatce mikroizolacyjnej kompatybilnej z używanym irradiatorem.
2. Naświetlaj w 2 równych dawkach, sumując dawkę całkowitą (dawka całkowita = 9 cGy dla biorców BALB.B). Druga irradiacja powinna odbyć się 3 hr po pierwszej. Iniekcję należy wykonać w ciągu 4-6 hr po końcowej irradiacji. Naświetlaj myszy przy użyciu źródła Cs¹³⁷ lub irradiatora RS2,000.
3. Po drugiej dawce promieniowania przechowuj myszy w klatce mikroizolacyjnej z zakwaszoną wodą do momentu transplantacji.

2. Przygotowanie splenocytów

1. Uśmiercić jedną mysz dawcy zgodnie ....

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół indukcji GVHD u myszy stanowi klinicznie istotny model mysiej GVHD. Pierwotnie opracowana przez zespół Bergera et al. w 1994 roku kombinacja szczepów C57Bl/6 do BALB.B jest dopasowana pod kątem MHC, a śmiertelność w przebiegu GVHD jest pośredniczona przez efektory CD4-zależne oraz CD8 T², co jest bardzo zbliżone do najczęstszego scenariusza klinicznego³. Znane jest, że sam przeszczep komórek T CD8 nie wywołuje GVHD w tym modelu; jednak progresja choroby jest zna.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Invitrogen	12633-012
Płódycowa surowica bydlęca	Invitrogen	10439016
Sito do komórek 40 μM	BD Biosciences	352340
CD3e-Biotyna	Miltenyi Biotec	130-093-021
Mikrokulki przeciwbiotynowe	Miltenyi Biotec	130-091-147
Mikrokulki CD8a	Miltenyi Biotec	130-049-401	Stosowane do usuwania limfocytów T CD8 ze śledziony.
Koktajl przeciwciał do oczyszczania CD8a	Miltenyi Biotec	130-095-236	Stosowany do oczyszczania limfocytów T CD8 ze śledziony.
D-lucyferyna	Caliper Life Sciences	122796