Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.
Artykuł metodologiczny
Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komary są wektorami dla różnorodnej grupy patogenów, w tym arbrowirusów, pierwotniaków i nicieni. Badanie transkryptów oraz regulatorów genów wykazujących ekspresję w tkankach, w których dochodzi do interakcji między gospodarzem (komarem) a patogenem, a także w narządach zaangażowanych w rozród, jest niezwykle istotne dla opracowania strategii ograniczania transmisji chorób przenoszonych przez komary oraz zaburzania rozwoju jaj. W celu zbadania i walidacji czasowej oraz tkankowo specyficznej regulacji ekspresji genów zastosowano szereg narzędzi. W niniejszym materiale opisujemy protokoły opracowane w celu uzyskania informacji przestrzennych, co pozwala lepiej zrozumieć, gdzie ekspresjonowane są określone geny i gdzie akumulują się ich produkty. Opisany protokół został wykorzystany do walidacji ekspresji oraz określenia wzorców akumulacji transkryptów w tkankach związanych z transmisją patogenów przenoszonych przez komary, takich jak gruczoły ślinowe samic, a także w przedziałach subkomórkowych jajników i embrionów, co odnosi się do rozrodu i rozwoju komarów.
Poniższe procedury stanowią zoptymalizowaną metodologię, która zwiększa wydajność poszczególnych etapów protokołu bez utraty specyficznych sygnałów hybrydyzacji z celem. Wytyczne dotyczące przygotowania sond RNA, preparatyki tkanek miękkich oraz ogólną procedurę fiksacji i hybrydyzacji opisano w Części A, natomiast kroki specyficzne dla zbierania, fiksacji, prehybrydyzacji i hybrydyzacji embrionów komarów szczegółowo omówiono w Części B.
Protokół
A. Hybrydyzacja in situ dla tkanek miękkich: gruczoły ślinowe i jajniki komara
Przepisy na roztwory i bufory wymagane do następujących procedur przedstawiono w Tabeli 1.
1. Przygotowanie i analiza jakości sond RNA
- Zaprojektuj startery do amplifikacji PCR docelowego transkryptu. Zaleca się, aby amplikon miał długość ≥600 nukleotydów, a co ważniejsze, aby sekwencja amplikonu była unikalna dla docelowego transkryptu. Należy unikać sekwencji nieunikalnych, aby wyeliminować możliwość generowania krzyżowo reagujących sond RNA.
- Sklonuj produkt PCR do wektora pCR4-TOPO lub podobnego wektora klonującego. Wektor klonujący pCR4-TOPO zawiera miejsca przyłączania polimerazy RNA T7 i T3, które umożliwiają produkcję produktów transkrypcji typu run-off zarówno w sensie, jak i antysensie z jednego klonu.
- Przeprowadź sekwencjonowanie sklonowanego amplikonu, aby zweryfikować wierność sekwencji oraz orientację w obrębie plazmidu wektora.
- Przeprowadź reakcję trawienia restrykcyjnego enzymem odpowiednim do wytworzenia antysensowego produktu transkrypcji in vitro. Linearyzację plazmidu ułatwia wybór miejsca restrykcyjnego znajdującego się w regionie wielokrotnego klonowania wektora pCR4-TOPO, takiego jak SpeI, PstI lub NotI. Upewnij się, że wybrany site restrykcyjny nie występuje w sklonowanym fragmencie. Ten sam klon można wykorzystać do wygenerowania sondy RNA w sensie, która służy jako kontrola tła. Hybrydyzacja in situ z sondą sensowną powinna dawać słaby lub żaden sygnał w porównaniu z komplementarną sondą antysensowną.
- Zweryfikuj za pomocą elektroforezy żelowej, czy klon pCR4-TOPO został całkowicie zlinearyzowany.
- Oczyść zlinearyzowane DNA plazmidowe, wykonując ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie precypitację etanolem. Podczas precypitacji DNA plazmidowego zaleca się zastosowanie końcowego stężenia 2 M octanu amonu z 2,5 objętością etanolu, aby zmniejszyć przenoszenie resztkowych soli do reakcji transkrypcji in vitro.
- Przygotuj znakowaną digoksigeniną (DIG) jednoniciową sondę RNA, przeprowadzając reakcję transkrypcji in vitro typu run-off, używając 1 μg zlinearyzowanego DNA plazmidowego jako matrycy. Przygotuj reakcję z polimerazą RNA, buforem transkrypcyjnym i mieszanką do znakowania RNA DIG zgodnie z instrukcjami producenta.
- Oczyść produkty transkrypcji in vitro znakowane DIG poprzez precypitację etanolem i resuspenduj osad RNA w wodzie destylowanej traktowanej DEPC.
- Zweryfikuj jakość i oczekiwaną masę cząsteczkową oczyszczonej sondy RNA znakowanej DIG za pomocą elektroforezy w żelu z formaldehydem. Przygotowaną sondę RNA można podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Disekcja gruczołów ślinowych i jajników komara
- Przeprowadzić dysekcję gruczołów ślinowych komara za pomocą sondy i pęsety, zgodnie z metodą opisaną wcześniej dla Ae. aegypti.1,2 W przypadku An. gambiae gruczoły ślinowe można dysekować tak jak opisano dla Ae. aegypti lub alternatywnie zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku MR4 Methods for Anopheles Research.3
- Przeprowadzić dysekcję jajników komara za pomocą pęsety, zgodnie z metodą opisaną wcześniej dla Ae. aegypti.4 W skrócie: jedną pęsetą należy uchwycić klatkę piersiową, podczas gdy drugą pęsetą odciąga się przedostatni segment odwłoka, aby uwolnić jajniki.
- Zebrane gruczoły ślinowe lub jajniki umieścić w probówkach mikrocentryfugowych Ambion RNAse-free o pojemności 1,5 ml zawierających 50 μl PBS.
- Próbki przechowywać w lodzie do momentu utrwalenia.
3. Fixacja
- Utkwić wypreparowane tkanki w świeżo przygotowanym roztworze do utrwalania tkanek miękkich (Tabela 1) w temperaturze pokojowej z nutacją przez 30 min do 1 h. Roztwór do utrwalania należy przygotować na świeżo, aby zapobiec utlenianiu formaldehydu. W przypadku gruczołów ślinowych zaleca się utrwalanie przez 1–1,5 h. Do utrwalania tkanek w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml zaleca się minimalną objętość 1 ml.
- Pozostawić tkanki do czasu ich osiadania na dnie probówki mikrocentryfużowej. Jest to ważny krok, który należy wykonać po każdej zmianie roztworu w protokole, aby zminimalizować znaczną utratę próbek.
- Odlać roztwór utrwalający poprzez ostrożne pipetowanie, pozostawiając w probówce mikrocentryfużowej objętość 50–100 μl, a następnie przemyć 3× po 5 min każdym z PBT.
- Opcjonalne kroki równoważenia w celu przechowywania tkanek. Stopniowo wypłukać PBT za pomocą etanolu lub metanolu. Wykonać stopniowe przemywania PBT/alkoholem (3:1, 1:1 oraz 1:3, po 5 min każde). Przechowywać w 100% (200 proof) alkoholu w temperaturze -20 °C. Tkanki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy bez degradacji ultrastruktury tkanki. Przed wykonaniem kolejnych kroków protokołu tkanki muszą zostać przywrócone do PBT poprzez stopniowe równoważenie alkoholem/PBT (3:1, 1:1, 1:3, po 5 min każde).
- Wykonać przemywania PBT 3×, po 5 min każde.
- Przeprowadzić trawienie białek za pomocą 0,01 mg/ml Proteinazy K/PBT przez 5 min w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, jeśli pożądana jest zarówno immunolokalizacja docelowych białek, jak i hybrydyzacja in situ RNA, jajniki można inkubować w 80% acetonie/H2O w temperaturze -20 °C przez 10 min zamiast traktowania Proteinazą K.
Traktowanie Proteinazą K pomija się w przypadku przygotowania gruczołów ślinowych. Należy przejść bezpośrednio do kroku 3.10. - Natychmiast odlać roztwór trawiący poprzez ostrożne pipetowanie. Przemyć 2×, po 5 min każde, lodowatym PBT, aby zatrzymać trawienie.
- Wykonać dodatkowe przemywania PBT 2×, po 5 min każde, w temperaturze pokojowej.
- Przeprowadzić potrwalanie w roztworze do utrwalania tkanek miękkich w temperaturze pokojowej z nutacją przez 30 min. Kroków potrwalania nie wykonuje się dla gruczołów ślinowych.
- Wykonać przemywania PBT 5×, po 5 min każde.
4. Hybrydyzacja
- Przeprowadź equilibrację tkanek w roztworze do hybrydyzacji (Hyb), inkubując je w temperaturze pokojowej z 1 ml Hyb/PBT (1:1) przez 30 min przy zastosowaniu nutacji.
- Odlej jak największą ilość Hyb/PBT. Do każdej probówki z próbką dodaj 1 ml Hyb.
- Zawiń probówkę z próbką w szczelną folię ochronną (folię bąbelkową) i umieść w butelce do hybrydyzacji. Zamknij butelkę korkiem do hybrydyzacji.
- Etapy przedhybrydyzacji i hybrydyzacji można łatwo przeprowadzić w piecu do hybrydyzacji. Przeprowadź przedhybrydyzację w 55 °C przez 30 min przy zastosowaniu rotacji.
- Odczekaj odpowiedni czas, aż tkanki opadną na dno probówki do mikrowirówki, ponieważ roztwór Hyb jest gęstszy niż PBT. Ostrożnie odlej roztwór do przedhybrydyzacji. Tkanki mogą stać się półprzezroczyste i trudne do zauważenia. Stratę próbek można ograniczyć, pozostawiając 50-100 μl roztworu w każdej probówce.
- Do probówki z próbką dodaj 50 μl Hyb i utrzymuj w bloku grzewczym w 55 °C.
- Zdenaturuj sondę RNA w 85 °C przez 5-10 min. Natychmiast umieść zdenaturowaną sondę w lodzie na 5 min.
- Pipetuj sondę RNA do probówki z próbką. Sonda RNA będzie unosić się na powierzchni Hyb. Wymieszaj, delikatnie potrząsając probówką.
- Przeprowadź hybrydyzację w całkowitej objętości 50-100 μl Hyb na próbkę. Inkubuj próbki w stałym statywie do mikrowirówek w piecu do hybrydyzacji lub w pływającym statywie do probówek w kąpieli wodnej, w 55 °C przez 16-24 hr.
5. Obróbka RNazą A
- Usunąć bufor Hyb zawierający sondę. Ważne jest utrzymywanie próbek w temperaturze 55 °C podczas etapów płukania, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie pozostałej niezwiązanej sondy. W przypadku hybrydyzacji kilku próbek zaleca się przechowywanie probówek w bloku grzewczym ustawionym na 55 °C, aby utrzymać temperaturę hybrydyzacji przez cały czas trwania etapów płukania.
- Przeprowadzić szybkie płukanie buforem Hyb, pipetując 1 ml roztworu do probówki do mikrocentryfugi i odwracając probkę z próbką 5-6 razy.
Wszystkie kolejne szybkie płukania w protokole wykonuje się w ten sam sposób, dodając wymagany roztwór i kilkukrotnie odwracając probkę z próbką. - Przeprowadzić dwa dodatkowe płukania buforem Hyb w 55 °C, po 30 min każde, z rotacją w inkubatorze do hybrydyzacji.
- Przeprowadzić równoważenie w PBT poprzez inkubację w temperaturze pokojowej w mieszaninie Hyb/PBT (1:1) przez 15 min z nutacją.
- Przeprowadzić płukania w PBT 5×, po 5 min każde.
- Przygotować świeży bufor RNAse A. Przeprowadzić traktowanie RNazą A poprzez inkubację w 20 μg/ml RNAse A/PBT w 37 °C przez 30 min. RNaza A przecina jednoniciowe RNA, co spowoduje degradację niezhybrydyzowanej sondy RNA.
- Odlać bufor RNAse A i przeprowadzić szybkie płukanie w PBT.
- Przeprowadzić płukania w PBT 3×, po 5 min każde.
6. Inkubacja przeciwciał
- Przygotować świeży roztwór blokujący (5% surowicy z kurczaka/1% Western Blocking Reagent/PBT) i zablokować próbki, inkubując je w 1 ml roztworu przez 30 min w temperaturze pokojowej podczas nutacji.
- Dodać 200 μl przeciwciała anty-DIG sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (AP) w rozcieńczeniu 1:1000 w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc podczas nutacji.
7. Barwienie na fosfatazę alkaliczną
- Usunąć przeciwciało i roztwór blokujący.
- Przeprowadzić szybkie płukanie w PBT.
- Przeprowadzić dodatkowe płukanie w PBT 5×, po 10 min każde. Alternatywnie próbki można płukać 3× przez 10 min każdorazowo, a następnie poddać przedłużonemu płukaniu w 4 °C przez noc z użyciem nutatora.
- Przygotować świeży bufor do barwienia AP.
- Przeprowadzić szybkie płukanie w buforze do barwienia AP.
- Przeprowadzić dodatkowe płukania w buforze do barwienia AP 3×, po 5 min każde, z użyciem nutatora.
- Zgodnie z instrukcją producenta przygotować świeży roztwór barwiący AP zawierający substrat AP NBT/BCIP.
- Inkubować każdą próbkę z 500 μl roztworu barwiącego AP w temperaturze pokojowej z użyciem nutatora, w ciemności. Próbki można inkubować, przykrywając probówki nieprzezroczystym pojemnikiem lub folią aluminiową. Postęp reakcji należy monitorować co 1-2 minuty pod kątem powstawania fioletowego osadu. W zależności od stężenia sondy, stężenia docelowego RNA oraz obecności celów nieswoistych, barwienie może trwać od kilku minut do kilku godzin.
- Usunąć jak najwięcej roztworu barwiącego. Niesatysfakcjonujące odlanie prowadzi do powstania białego kłaczkowatego osadu podczas kolejnych etapów płukania.
- Barwienie całkowicie zatrzymuje się poprzez wykonanie dwóch szybkich płukań w PBT.
- Przeprowadzić dodatkowe płukania w PBT 3×, po 5 min każde.
8. Montowanie w glicerolu
- Używając końcówki do pipety 200 μl o szerokim otworze, przenieś próbki z probówek do wirówki do poszczególnych okrągłych dołków płytki Pyrex.
- Ostrożnie usuń z próbki jak największą ilość PBT.
- Nanieś pipetą na próbkę 70% glycerol/H2O. Pozostaw do przeniknięcia glicerolu do tkanek próbki w temperaturze 4 °C przez noc. Obróbka glicerolem zapobiega wysychaniu tkanek podczas montowania na szkiełku.
- Przygotuj szkiełka przedmiotowe, wycierając ich powierzchnię chusteczkami Kimwipes. Naklej na szkiełko dwa kawałki przezroczystej taśmy klejącej równolegle do siebie, tak aby utworzyły wąski kanał (Rysunek 2).
- Za pomocą pędzla artystycznego podnoś próbki jedna po drugiej i układaj je wzdłuż kanału, pozycjonując każdą próbkę w tej samej orientacji względem osi przednio-tylnej oraz grzbietowo-brzusznej.
- Po ustawieniu każdej próbki użyj tamponu z chusteczki Kimwipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu glicerolu otaczającego tkanki (Rysunek 3). Usunięcie nadmiaru glicerolu jest ważne, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas zamykania zamontowanych próbek na szkiełku pod szkiełkiem nakrywką.
- Wycentruj i ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe nad kanałem zawierającym wyrównane próbki. Przymocuj szkiełko nakrywkowe półtrwale do szkiełka przedmiotowego, nakładając przezroczysty lakier do paznokci na narożniki nakrywki.
- Używając pipety 200 μl, powoli wpuść na jeden koniec kanału odpowiednią ilość 70% glicerolu, aby siły kapilarne wypełniły całą przestrzeń kanału oraz obszar pod szkiełkiem nakrywkowym.
- Trwale zamknij zamontowane próbki, nakładając lakier do paznokci wzdłuż wszystkich czterech boków szkiełka nakrywkowego. Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia przed wykonaniem zdjęć zhybrydyzowanych tkanek w preparatach całych. Zaleca się fotografowanie próbek bezpośrednio po ich zamontowaniu.
B. Hybrydyzacja in situ dla embrionów komarów
Rozwiązania i bufory wymagane do hybrydyzacji in situ zarodków komarów zostały opisane (Tabela 1). Procedury fiksacji i hybrydyzacji przedstawione w niniejszym opracowaniu zostały zmodyfikowane na podstawie metod opisanych pierwotnie dla Anopheles gambiae,5,6 Aedes aegypti7 oraz Culex quinquefasciatus.8
1. Pobieranie zarodków
- Zarodki pobiera się od 300 zapłodnionych, dorosłych samic komarów (którym pozwolono na kopulację z samcami przez 48 h, 3 dni po wyjściu z poczwarki) 72 h po żerowaniu na krwi. Komary utrzymuje się na 3 M roztworze sacharozy, aby zapobiec składaniu jaj przed zamierzonym okresem zbioru.
- Przygotować pojemniki do zbierania zarodków, wyścielając papierowy kubek o pojemności 16 oz. siatką Saatilene Hitech w taki sposób, aby wewnętrzna powierzchnia kubka była całkowicie zakryta. Siatkę można przymocować za pomocą jednego zszywki. Zastosowanie tej siatki znacznie ogranicza zanieczyszczenia włókniste, które pojawiają się przy użyciu papieru filtracyjnego Whatman lub ręczników papierowych.
- Wypełnić pojemnik do połowy wodą destylowaną.
- Zarodki zbiera się przez 1 h, umieszczając pojemnik zbiorczy w klatce, którą następnie przykrywa się ciemnym materiałem, aby stymulować składanie jaj.
- Zebranym zarodkom pozwala się dojrzeć do pożądanych stadiów rozwojowych poza klatką, w standardowych warunkach hodowlanych (85% wilgotności względnej/ 26 °C). Dojrzewanie zarodków do poszczególnych stadiów można skorelować z czasem (godziny po złożeniu jaj), postępując zgodnie z przybliżonym przebiegiem czasowym zdarzeń embrionalnych opisanym w (Table 2). Tabela ta podsumowuje główne zdarzenia w rozwoju embrionalnym Aedes aegypti zgłoszone przez Raminaniego i Cuppa,9,10 Anopheles gambiae opisane pierwotnie przez Ivanovą-Kazas11 i dalej opracowane przez Goltseva i współpracowników,12,13 oraz Culex quinquefasciatus zgłoszone przez Davisa.14 Opisane przebiegi czasowe mają służyć jako wstępne szacunki, a nie absolutne punkty czasowe, dla zbioru zarodków na konkretnych etapach rozwoju.
2. Dechorionizacja, utrwalanie i rozrywanie endochorionu
- Przenieś embriony z naczynia zbierającego do rurki wyłapującej do dechorionacji z siatką Saatilene (Rycina 3).
Dla Aedes zarodki, umieść probówkę chwytną w zlewce wypełnionej wystarczającą ilością wody destylowanej, tak aby objętość probówki chwytnej była wypełniona w połowie. Do odseparowania zarodków z siatki Saatilene i przeniesienia ich do wypełnionej wodą probówki chwytnej można użyć pędzla artystycznego.
Dla Anopheles zarodków, odłącz siatkę Saatilene od pojemnika zbiorczego i ostrożnie złóż ją w kształt lejka. Trzymając lejek z siatki jedną ręką, drugą ręką dozuj wodę destylowaną z polietylenowej butelki z atomizerem wzdłuż ścianek lejka, aby wypłukać zarodki do probówki zbiorczej. Metodę tę można zastosować do Anopheles zarodki, ponieważ nie posiadają one substancji adhezyjnej obecnej na powierzchni Zarodki Aedes, co umożliwia przywieranie jaj do podłoży składania jaj. - Przygotuj 40 ml roztworu do usuwania błon szyjnych (1 objętość 5,25% podchlorynu sodu : 3 objętości wody destylowanej). Wlej roztwór do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
- Przygotować zlewkę o pojemności 100 ml zawierającą 50 ml wody destylowanej i odstawić ją na bok. Etap usuwania osłon chorionowych jest zależny od czasu; bezpośrednio poy obróbce podchlorynem sodu zarodki zostaną zanurzone w tej wodzie w celu rozcieńczenia roztworu do usuwania osłon chorionowych.
- Przeprowadź dechorionację zarodków znajdujących się w probówce z siatką wychwytującą, umieszczając probówkę w szalce Petriego wypełnionej roztworem do dechorionacji. Używając jednorazowej polietylenowej pipety transferowej lub pipety Pasteura, przemywaj zarodki, jednocześnie obracając probówkę wychwytującą tak, aby zarodki pozostały zanurzone i w ruchu w roztworze do dechorionacji.
Dekorionizacja wymaga maksymalnie 35 s dla Aedes zarodki, podczas gdy 75 s jest wystarczające dla Anopheles i Culex zarodki (Tabela 3). Dechorionizacja jest jednym z najwrażliwszych etapów protokołu, a zbyt długi czas ekspozycji na podchloryn sodu, szczególnie w przypadku embrionów Aedes, uniemożliwi prawidłowe pękanie chorionu. - Natychmiast zanurz fiolkę chwytną w zlewce zawierającej wodę.
- Zmyj pozostały roztwór do dechorionacji z embrionów, wyjmując probówkę zbiorczą z wypełnionego wodą zlewki i płucząc wewnętrzne oraz zewnętrzne ścianki probówki wodą destylowaną z butelki z atomizerem lub z kranu wyposażonego w przewód.
- Poprawność zdechorionizacji można zweryfikować, obserwując embriony pod mikroskopem stereoskopowym przy małym powiększeniu. Zdechorionizowane Aedes embriony są pozbawione przypominającej siatkę egzochorion, a widoczna jest jedynie gładka, wypolerowana powierzchnia czarnego endochorion. Dla dechorionowanych Anopheles zarodki, brak jest pławików pozaowodniowych oraz struktur grzebieniowych (Rysunek 4).
- Za pomocą pędzla artystycznego przenieść zdechorionowane zarodki do fiolki scyntylacyjnej zawierającej 5 ml wody destylowanej (Rycina 5-1). W przypadku przygotowywania wielu próbek należy przechowywać probówki do przechwytywania w wodzie, aby zapobiec wysuszeniu embrionów.
- Pozostaw embriony do czasu, aż osiądą na dnie fiolki scyntylacyjnej, a następnie odlej z fiolki jak najwięcej wody.
- Do fiolki do syntyglacji należy dodać 5 ml heptanu (Rysunek 5-2). Usunąć resztki wody pozostające w fiolce scyntylacyjnej.
- Do fiolki scyntylacyjnej należy dodać 5 ml świeżo przygotowanego roztworu do fiksacji zarodków (Tabela 1).
- Utrwal embriony przez 30 min, odwracając probówki, aby faza organiczna i wodna wymieszały się dokładnie, ale nie gwałtownie.
- Usunąć roztwór fixujący za pomocą szklanej pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć interfazy zawierającej embriony (Rycina 5-3).
- Wypłucz pozostałości roztworu utrwalającego, napełniając fiolkę scyntylacyjną taką ilością wody destylowanej, jaka się w niej zmieści. Odwróć fiolkę 5 razy, a następnie usuń całą wodę destylowaną.
- Napełnić fiolkę scyntylacyjną 20 ml wody destylowanej i mieszać poprzez odwracanie fiolki przez 30 min.
- Usuń całą wodę z fiolki scyntylacyjnej.
- Dodać do fiolki scyntylacyjnej odpowiednią ilość wrzącej wody destylowanej, tak aby nieorganiczna faza heptanu osiągnęła górną krawędź fiolki.
- Inkubować przez 30 s, a następnie usunąć całą wrzącą wodę.
- Dolewać lodowatej wody destylowanej, aż faza nieorganiczna osiągnie górną krawędź probówki. Inkubować probówkę w lodzie przez 10 min.
- Najpierw usuń fazę wodną, a następnie organiczną. Na tym etapie heptan będzie wyglądał na mętny (Rycina 5-4).
- Dodać 5 ml świeżego heptanu do fiolki. Usunąć z fiolki całą pozostałą wodę.
- Do fiolki należy dodać 5 ml metanolu. Fiolką należy energicznie zakręcić 1–2 razy, nie potrząsając nią (Rycina 6). Jeśli nieorganiczna faza heptanu i organiczna faza metanolu zostaną energicznie wstrząśnięte, zarodki zostaną zniszczone podczas pękania endochorionu. Warto wspomnieć, że zaobserwowaliśmy różnice w efektywności rozrywania endochorionu dla różnych szczepów Aedes aegypti zarodki.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15–20 min. Na tym etapie fazy staną się mętne z powodu uwalniania składników żółtka (Rysunek 5-5).
- Usunąć obie fazy, organiczną i nieorganiczną, a następnie przemyć metanolem 3 razy, aby usunąć cały pozostały heptan.
- Zarodki można przechowywać w metanolu w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
3. Obieranie
- Umieść kawałek dwustronnej taśmy do peruk w centrum szalki Petriego o średnicy 3 cm. Taśma do peruk jest stosowana ze względu na stabilność jej kleju w obecności metanolu i etanolu.
- Używając końcówki do pipety o dużej średnicy otworu (około 3 mm) i objętości 200 μl, przenieś embriony z metanolu na dwustronną taśmę.
- Odczekaj 1-2 min, aż embriony osiądą i przywrą do powierzchni taśmy.
- Odlej nadmiar metanolu i pozwól powierzchni lekko wyschnąć przez 1-2 min.
- Dodaj 4 ml 95% (190 proof) etanolu do szalki Petriego.
- Pipetuj 600 μl wody destylowanej do etanolu i zamieszaj poprzez delikatne kręcenie szalką. Taśma stanie się nieprzezroczysta. Dodanie wody destylowanej sprawi, że taśma stanie się lepka, co unieruchomi embriony podczas oddzielania. Krok ten można pominąć, jeśli jest taka potrzeba.
- Użyj igły o rozmiarze 27.5 G przymocowanej do korpusu strzykawki 1 ml, aby oddzielić pęknięty endochorion (Rycina 7). Po uwolnieniu białego embrionu z czarnych pozostałości endochorionu, przenieś embriony z taśmy do zbiornika z etanolem w szalce Petriego, używając cienkiego pędzla artystycznego. Używając końcówki do pipety o średnicy otworu 3 mm, przenieś embriony do probówki Ambion 1.5 ml zawierającej 500 μl 200 proof etanolu.
Oddzielone embriony nie powinny pozostawać na taśmie przez dłuższy czas, ponieważ mogą do niej trwale przywrzeć. - Wykonaj 2-3 szybkie przemycia 100% (200 proof) etanolem i przechowuj embriony w czystym etanole w temperaturze -20 °C. Oddzielone embriony mogą być przechowywane w -20 °C przez kilka miesięcy bez wpływu na morfologię lub późniejszy sygnał hybrydyzacji.
4. Klarowanie żółtka
- Przeprowadź szybkie płukanie etanolem o stężeniu 200 proof. Czysty etanol należy stosować we wszystkich kolejnych etapach płukania oraz do przygotowania roztworu do klarowania żółtka z P-ksylenem.
- Przeprowadź jedno płukanie etanolem przez 5 min z nutacją.
- Inkubuj w mieszaninie P-ksylen/etanol (9:1) w temperaturze pokojowej przez 1-1,5 h z nutacją. Etap z ksylenem umożliwia klarowanie masy żółtka w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.
- Usuń roztwór ksylen-etanol i wykonaj dwa szybkie płukania etanolem.
- Przeprowadź jedno płukanie etanolem przez 5 min z nutacją.
- Przeprowadź dwa szybkie płukania metanolem, a następnie jedno płukanie metanolem przez 5 min z nutacją.
- Równoważ przez płukanie raz roztworem metanol/formaldehyd (1:1) przed przeniesieniem do 4% roztworu utrwalającego z formaldehydem.
5. Fixacja i hybrydyzacja in situ
Procedury fiksacji i hybrydyzacji in situ są identyczne z tymi opisanymi w sekcji A protokołu.
C. Reprezentatywne wyniki
Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ prowadzi do powstania kolorowych wzorów barwienia, które wskazują na obecność i lokalizację docelowego mRNA. Należy podkreślić, że za pomocą hybrydyzacji in situ nie można określić względnych poziomów obfitości transkrypcyjnej. Wyniki hybrydyzacji zależą od konkretnej sondy mRNA użytej w procedurze hybrydyzacji, obfitości docelowego mRNA w hybrydyzowanej tkance, a także od stężenia sondy i temperatury hybrydyzacji. Porównanie tkanek poddanych hybrydyzacji z sondami mRNA antysensownymi i odpowiadającymi im sondami sensownymi umożliwia dokładną interpretację wzorów barwienia.
Hybrydyzacja in situ całych gruczołów ślinowych samic Aedes aegypti z sondami mRNA skierowanymi przeciwko amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) i D7L2 (AAEL006424) wskazuje na akumulację tych transkryptów odpowiednio w płatach proksymalno-bocznych, dystalno-bocznych oraz dystalno-bocznych/środkowych (Rycina 8).1 Całe jajniki trzech gatunków komarów poddano hybrydyzacji z sondami mRNA specyficznie skierowanymi przeciwko odpowiednim ortologicznym transkryptom oskar (Rycina 9).7,8 Hybrydyzację in situ całych embrionów Ae. aegypti, An. gambiae i Cx. quinquefasciatus przeprowadzono z użyciem antysensownych sond RNA skierowanych przeciwko odpowiednim ortologicznym transkryptom oskar komarów (Rycina 10).7,8
Rycina 1. Schematyczny rysunek zestawu do montażu po hybrydyzacji.
Rycina 2. Przygotowanie mopu z chusteczki Kimwipe używanego podczas montowania próbek. Chusteczkę Kimwipe skręca się ciasno, aby utworzyć mop z cienką końcówką służący do wchłaniania nadmiaru medium montującego z próbek i szkiełka.
Rycina 3. Schemat rurki do wychwytywania podczas dechorionacji z użyciem siatki Saatilene. A) Dno polistyrenowej rurki stożkowej o pojemności 50 ml zostaje odcięte, aby uzyskać pustą rurkę o długości 4,5 cm, otwartą z obu stron. W pokrywie rurki stożkowej wycina się okrągły otwór, aby umożliwić przepłukiwanie cieczy przez kwadratowy fragment siatki Saatilene o powierzchni 6,5 cm2. Ekran z siatki o gęstości 330 nici na cal i średnicy nici 34 mikrony zatrzymuje embriony komarów. B) Zmontowana rurka do wychwytywania.
Rycina 4. Jaja Aedes aegypti i Anopheles gambiae przed i po dechorionacji. A) Jaja Aedes aegypti przed dechorionacją. Siateczkowy egzochorion znajduje się nad czarnym endochorionem, nadając jajom teksturowany wygląd (powiększenie na wstawce). Po usunięciu egzochorionu pozostaje jedynie gładki i błyszczący endochorion (B i powiększenie na wstawce). C) Jaja Anopheles gambiae przed dechorionacją. Widoczne są struktury egzochorionu, takie jak wyporniki (strzałki). D) Po dechorionacji widoczna jest gładka i błyszcząca powierzchnia endochorionu. Pasek skali = 100 μm.
Rycina 5. Seria następujących po sobie etapów fiksacji i rozrywania endochorionu jaj Ae. aegypti. A) Widok pod kątem z przodu oraz B) widok z boku fiolek scyntylacyjnych zawierających jaja Ae. aegypti podczas kolejnych etapów fiksacji i rozrywania endochorionu. 1) Embriony w wodzie destylowanej. 2) Embriony unoszą się w interfazie między górną fazą heptanu a dolną fazą wodną. 3) Po fiksacji embriony zbierają się w kolistą masę. Embriony pozostają w interfazie między fazą heptanu a fazą roztworu fiksującego. 4) Po potraktowaniu wrzącą wodą i inkubacji w lodzie faza heptanu staje się lekko mętna. 5) Embriony z rozrywanym endochorionem widoczne w interfazie między mętną fazą heptanu a przezroczystą fazą metanolu.
Rycina 6. Przerwanie endochorionu utrwalonych jaj Ae. aegypti. A) Bezpośrednio po energicznym mieszaniu faz heptanu i metanolu można zaobserwować tworzenie się pęcherzyków i przerwanie endochorionu. B) Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej.
Rysunek 7. Jaja komarów po uszkodzeniu i usunięciu endochorionum. Jaja Ae. aegypti (A), An. gambiae (B) oraz Cx. quinquefasciatus (C) po fiksacji i uszkodzeniu endochorionum. Wewnątrz pękniętego endochorionum widoczne są białe, półprzezroczyste embriony. Po usunięciu endochorionum półprzezroczyste embriony Ae. aegypti (D), An. gambiae (E) oraz Cx. quinquefasciatus (F) są wyraźnie widoczne. Pasek skali = 100 μm.
Rycina 8. Hybrydyzacje in situ trzech genów eksprymowanych w różnych płatach całych gruczołów ślinowych samicy Ae. aegypti. Barwienie wskazuje na lokalizację i akumulację amylase1 (AAEL006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) oraz D7L2 (AAEL006424) (B). Pasek skali = 100 μm.
Rycina 9. Hybrydyzacja in situ z użyciem antysensownych sond RNA dla genu oskar komarów w całych oocytach i komórkach pielęgnacyjnych komarów. Oocyty w stadium IV (ooc) wyizolowane z jajników An. gambiae (A), Ae. aegypti (B) oraz Cx. quinquefasciatus (C), poddane hybrydyzacji z sondami RNA skierowanymi przeciwko odpowiednim mRNA oskar komarów. Pęcherzyki pierwotne są zorientowane z końcem przednim po lewej stronie. Barwienie na biegunie tylnym (niebieska grot strzałki) wskazuje na nagromadzenie mRNA oskar. Przedstawiono pęcherzyki wtórne (f2) i trzeciorzędowe (f3), a barwienie (czarna grot strzałki) wskazuje na akumulację mRNA oskar w cytoplazmie komórek pielęgnacyjnych (ncc). Barwienie nie występuje w jądrach komórek pielęgnacyjnych (ncn). Pasek skali = 50 μm.
Rycina 10. Hybrydyzacja in situ z użyciem antysensownych sond RNA dla genu oskar komara w całych zarodkach komara. Zarodki są zorientowane z końcem przednim po lewej stronie. Zarodki w stadium blastodermy komórkowej An. gambiae (A) oraz Cx. quinquefasciatus (C) poddano hybrydyzacji z odpowiednimi, specyficznymi dla gatunku sondami RNA oskar. B) Zarodek Ae. aegypti w stadium blastodermy syncytialnej poddany hybrydyzacji z sondami RNA skierowanymi przeciwko transkryptowi oskar Ae. aegypti. Barwienie jest widoczne w komórkach bieguna tylnego we wszystkich zarodkach, co wskazuje na lokalizację i akumulację mRNA oskar komara w tych komórkach. Pasek skali = 50 μm.
Tabela 1. Roztwory i bufory do elektroforezy w żelu formaldehydowym, fiksacji i hybrydyzacji in situ.
Tabela 2. Zdarzenia rozwojowe i obserwacje morfologiczne odpowiadające kolejnym etapom embriogenezy komara.
Tabela 3. Podsumowanie kluczowych różnic w etapach przed hybrydyzacją dla różnych typów tkanek.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół hybrydyzacji in situ i barwienia kolorymetrycznego dla całych tkanek i embrionów komarów jest użyteczną techniką lokalizacji transkryptów w konkretnych organach i typach komórek. Procedury te stanowią udoskonalenie naszych wcześniej opisanych metod, zarówno pod kątem usprawnienia rozbudowanych etapów płukania, jak i dostarczenia dodatkowych szczegółów technicznych oraz źródeł odczynników.
W naszym doświadczeniu kolorymetryczna detekcja sygnałów hybrydyzacji charakteryzuje się wyższą czułością i wyraźniejszym sygnałem hybrydyzacji w porównaniu do metod detekcji opartych na fluorescencji. Ponadto detekcja kolorymetryczna pozwala uniknąć problemów związanych z rozróżnianiem sygnałów w embrionach, które wykazują naturalną autofluorescencję. Ograniczenia w wykrywaniu sygnałów hybrydyzacji pojawiają się w przypadku celowania w rzadkie transkrypty oraz przy widocznym barwieniu tła. Stwierdzono, że zwiększenie temperatury hybrydyzacji do 65 °C redukuje tło sygnałów hybrydyzacji, jednak nie jest to zalecana alternatywa dla projektowania unikalnych sond RNA specyficznych dla danego celu.
Niniejszy protokół był stosowany do przeprowadzania hybrydyzacji in situ w całych gruczołach ślinowych Aedes aegypti oraz w jajnikach i embrionach Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti oraz Culex quinquefasciatus. Metoda ta ma zastosowanie również do innych tkanek komarów, a prawdopodobnie także do tkanek innych owadów. Dodatkowo opracowaliśmy po raz pierwszy porównawcze wytyczne dotyczące etapowania rozwoju embrionalnego u trzech gatunków komarów wektorowych: Ae. aegypti, An. gambiae i Cx. fatigans. Opisano obserwacje dla konkretnych szczepów tych trzech gatunków, w określonych warunkach hodowli. Należy zauważyć, że przebieg czasowy rozwoju może się różnić w zależności od szczepu gatunku komara oraz warunków hodowlanych. Hybrydyzacje in situ uzupełniają prowadzone obecnie prace nad analizą transkryptomów komarów i innych stawonogów i mogą dostarczyć lepszego obrazu regulacji ekspresji genów w tych organizmach.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Marice Walters za pomoc w opracowaniu metod hybrydyzacji in situ dla tkanek miękkich oraz Yurymu Goltsevowi za omówienie protokołów hybrydyzacji in situ zarodków Anopheles gambiae, które zostały następnie zaadaptowane i zmodyfikowane w celu opracowania opisanego tutaj protokołu hybrydyzacji in situ zarodków Aedes i Culex. Dziękujemy również Adamowi Paré oraz Davidowi Kosmanowi za pomocne rekomendacje. Dziękujemy Osvaldo Marinotti za dyskusję naukową i redakcję tekstu protokołu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| 1 M Tris-HCl | Ambion | AM9855G | pH 8,0 |
| 10X PBS | Ambion | AM9625 | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | |
| Probówki do mikrowirówki 1,5 ml | Ambion | AM12400 | Mniej nieprzezroczyste niż standardowe probówki; ułatwia wizualizację próbek |
| Dejonizowany formamid | Ambion | AM9342 | Przechowywać w 4 °C |
| Woda z DEPC | Ambion | AM9932 | |
| Proteinaza K | Ambion | AM2546 | |
| 5,25% podchloryn sodu | Austin’s | Marka A-1 | |
| T3 RNA Polimeraza-Plus | Ambion | AM2733 | Przechowywać w -20 °C |
| T7 RNA Polimeraza | Ambion | AM2082 | Przechowywać w -20 °C |
| 95% etanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Jednorazowe polietylenowe pipety transferowe Fisherbrand | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 37% formaldehyd | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metanol klasy HPLC | Fisher Scientific | A452-1 | |
| Chlorek magnezu | Fisher Scientific | M87-500 | |
| Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu | Fisher Scientific | 12-542A | 18 x 18 mm |
| n-Heptan | Fisher Scientific | H350-1 | |
| p-ksylen | Fisher Scientific | O5082-500 | |
| 9-dołkowa płytka do nakrapiania Pyrex | Fisher Scientific | 13-748B | 100 x 85 mm |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | AC32730-0025 | |
| Wodorotlenek sodu | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Kapturki do mikroskopu Superfrost/Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1,0 mm |
| Taśma Davlyn Red Clear-liner Toupee | Hair Direct | RED-75R12 | Materiał bazowy Poly/Skin, rolka taśmy 0,75 cala x 12 jardów |
| Zestaw do klonowania TOPOTA do sekwencjonowania z chemicznie kompetentnymi E. coli One Shot Top10 | Invitrogen | K457501 K457540 | 20 reakcji 40 reakcji |
| Sonikowane DNA z plemników łososia | Invitrogen | 15632-011 | Przechowywać w -20 °C |
| Fragmenty Fab anty-digoksigenina-AP | Roche Applied Science | 1093274 | Przechowywać w 4 °C |
| Mieszanina do znakowania RNA DIG | Roche Applied Science | 1277073 | Przechowywać w -20 °C |
| Roztwór zapasowy NBT/BCIP | Roche Applied Science | 1681451 | Przechowywać w 4 °C |
| Odczynnik blokujący Western | Roche Applied Science | 11921673001 | Przechowywać w 4 °C |
| Siatka poliestrowa Saatilene Hitech (330.130) | Saati Print | 330.34 UO PW | 330 nici/cal, średnica nici 34 mikrony, kolor pomarańczowy |
| Glicerol | Sigma | G6279-1 | 70% w PBT |
| Sód heparyny | Sigma | H3393 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500 | |
| 37% formaldehyd | Ted Pella | 18508 | Alikwoty 10 ml w bursztynowych ampułkach |
| Pojemniki Solo Paper 16 oz. z pokrywkami | The Paper Company | SOLOKH16AJ8000 | |
| Borokrzemianowa fiolka scyntylacyjna z oddzielną zakrętką | VWR International | 66022-128 | Opakowanie 500 sztuk po 20 ml |
| Komórkowy materiał amortyzujący Sealed Air Bubble wrap | VWR International | 500018-081 | Rolka 10 stóp, grubość 0,188 cala |
| Surowica kurzyca | Krew pełną pobrano z żyły skrzydłowej lub poprzez punkcję serca młodego kurczaka. Krew inkubowano w 37 °C przez 1 h aż do koagulacji, a następnie umieszczono w lodzie na 30 min. Zebrano surowicę i odwirowano przy 3000 x g przez 10 min. Otrzymany nadosad (klarowna surowica) został zebrany i przechowywany w -20 °C do momentu użycia. | ||
| Tabela 4. Wykaz specyficznych odczynników i sprzętu do hybrydyzacji in situ. |
Bibliografia
- Juhn, J. Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Parasit. Vectors. 4, 1(2011).
- Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e228(2007).
- Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).
- Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , Chapman & Hall. London. (1997).
- Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos. Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).
- Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).
- Juhn, J., James, A. A. oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).
- Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus. Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).
- Raminani, L. N., Cupp, E. W. Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).
- Raminani, L. N., Cupp, E. W. Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis. Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).
- Ivanova-Kazas, O. M. Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg. Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).
- Goltsev, Y. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).
- Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles. PLoS Biol. 9, e1000584(2011).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development. Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).
Przedruki i uprawnienia
