Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Streszczenie

In vivo obrazowanie funkcji kory mózgu wymaga dostępu optycznego do mózgu bez naruszania środowiska wewnątrzczaszkowego. Przedstawiamy metodę tworzenia polerowanego i wzmocnionego okna z cieńszej czaszki (PoRTS) w czaszce myszy, które osiąga średnicę kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy. Czaszka jest cieńszona do grubości od 10 do 15 μm za pomocą wiertarki ręcznej w celu uzyskania przejrzystości optycznej, a następnie pokrywana klejem cyjanoakrylowym i szkiełkiem podstawowym, aby: 1) zapewnić sztywność, 2) zapobiec odrastaniu kości oraz 3) zredukować rozpraszanie światła spowodowane nierównościami powierzchni kości. Ponieważ czaszka nie zostaje przebita, znacznie ograniczony jest każdy stan zapalny, który mógłby wpłynąć na badany proces. Głębokość obrazowania do 250 μm poniżej powierzchni kory można osiągnąć przy użyciu dwufotonowej mikroskopii skaningowej. Okno to jest dobrze dostosowane do badania przepływu krwi w mózgu oraz funkcji komórkowych zarówno w preparatach z narkozą, jak i u zwierząt przebudzonych. Oferuje ono ponadto możliwość manipulowania aktywnością komórek za pomocą optogenetyki lub zakłócania przepływu krwi w wybranych naczyniach poprzez naświetlanie krążących fotosensybilizatorów.

Protokół

1. Przygotowanie do operacji ⁱ

1. Oczyść narzędzia chirurgiczne, poddając je sonikacji w mieszaninie Maxizyme i Surgical Milk w myjce ultradźwiękowej. Przed każdym eksperymentem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie.
2. Upewnij się, że wszystkie niezbędne odczynniki i materiały jednorazowe są dostępne. Lista odczynników i materiałów jednorazowych znajduje się w Tabeli 2. Odczynniki i materiały jednorazowe mające kontakt z odsłoniętą tkanką powinny być, w miarę możliwości, sterylne.
3. Zwiez zwierzę. Typowe środki znieczulające odpowiednie do badań przeżywalności opisano w Tabeli 1. Upewnij się, że osiągnięto chirurgiczną głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchu na uciśnięcie palca u nogi. Optymalny wiek myszy to od 3 do 6 tygodni. Czaszki młodszych myszy są miększe i trudniejsze do ścieńczenia. Starsze mysze mają grubsze czaszki, które bardziej krwawią podczas procedury ścieńczania.
4. Zabezpiecz zwierzę w aparacie stereotaktycznym ¹. Lista sprzętu chirurgicznego znajduje się w Tabeli 2.
5. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37°C, korzystając z sondy rektalnej z regulacją sprzężenia zwrotnego i mata grzewczego.
6. Nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.
7. Krótko ogol skórę głowy za pomocą małej maszynki elektrycznej.
8. Oczyść skórę głowy Betadine, a następnie przemyj 70 % (v/v) alkoholem izopropylowym.
9. W razie potrzeby sprawdź za pomocą pulsoksymetru, czy tętno i częstotliwość oddechów mieszczą się w normie. W przypadku myszy wartości te powinny oscylować odpowiednio wokół 10 Hz i 2 Hz.
10. Podgrzej porcję sterylnie przefiltrowanego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) do 37°C (125 mM NaCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl₂, 1,3 mM MgCl₂, pH 7,4) (wszystkie odczynniki firmy Sigma)².

2. Montaż ramy głowy

1. Za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych usunąć skórę z całej grzbietowej powierzchni czaszki. Przyciąć skórę bocznie do krawędzi mięśni skroniowych po obu stronach czaszki oraz tylnie do mięśni szyi (Rys. 1A).
2. Za pomocą ostrza skalpela usunąć cienką okostną z powierzchni czaszki.
3. Oczyścić czaszkę wilgotnym aplikatorem z watką i osuszyć jej powierzchnię strumieniem powietrza z puszki do przedmuchiwania. Następnie nałożyć cienką warstwę kleju cyjanoakrylanowego na całą powierzchnię czaszki. Pozostawić klej do całkowitego wyschnięcia. Warstwa ta jest niezbędna do właściwego przylegania cementu stomatologicznego w kolejnych krokach. Klej cyjanoakrylanowy nie wymaga sterylizacji.
4. Przymocować metalowy łącznik do powierzchni czaszki, z dala od obszaru planowanego okna. W przypadku preparatów znieczulonych do czaszki można przymocować małą nakrętkę za pomocą kropli kleju cyjanoakrylanowego, którą później można przykręcić do zestawu obrazującego za pomocą śruby (Rys. 1B, 1L i 1N). Tylną stronę nakrętki należy zakleić taśmą, aby zapobiec dostaniu się kleju do gwintu podczas mocowania do czaszki. Nakrętka i taśma powinny zostać wysterylizowane w autoklawie przed operacją.
5. W przypadku preparatów do obrazowania w stanie czuwania przymocować sztywniejszy, niestandardowy łącznik z dwoma punktami mocowania (Rys. 1M i 1N). Wywiercić dwa otwory w czaszce nad przeciwległą półkulą korową za pomocą wiertła o średnicy ½ mm, a następnie wprowadzić dwie śruby samowiercące #000. Śruby te pomogą zakotwiczyć uchwyt głowy w czaszce. Wykonać tylko jeden pełny obrót śruby, aby uniknąć wywierania nacisku na leżącą poniżej korę. Następnie przymocować niestandardową metalową poprzeczkę za pomocą małej kropli kleju cyjanoakrylanowego nad móżdżkiem. Pozostawić klej cyjanoakrylanowy do całkowitego wyschnięcia. Ten metalowy łącznik znacznie ogranicza stopnie swobody i ułatwia ponowne zlokalizowanie tego samego pola obrazowania w badaniach podłużnych. Szeroka poprzeczka zapewnia wystarczająco dużo miejsca do umieszczenia elektrod i stymulacji wibrys. Szczegółowe plany wykonania niestandardowego uchwytu głowy i urządzenia mocującego są dostępne online (http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Śruby i poprzeczka powinny zostać wysterylizowane w autoklawie przed operacją.
6. Pokryć całą powierzchnię czaszki, z wyłączeniem miejsca na okno, warstwą cementu stomatologicznego (Rys. 1C i 1D). Upewnić się, że wszystkie odsłonięte krawędzie skóry są przykryte cementem. Składniki cementu stomatologicznego nie wymagają sterylizacji.

3. Tworzenie polerowanego i wzmocnionego okna z cienkiej czaszki (PoRTS)

1. Należy upewnić się, że wiertła są ostre i unikać ich ponownego użycia. Przy niskiej prędkości wiertła stomatologicznego należy zcieńczyć obszar o wymiarach 2 mm na 2 mm nad korą somatosensoryczną, używając wiertła ½ mm. Należy naprzemiennie zwilżać czaszkę roztworem ACSF i osuszać jej powierzchnię delikatnym strumieniem powietrza z puszki ze sprężonym powietrzem; zwilżanie służy do chłodzenia, a osuszanie do cieńczenia. Wymaga to cieńczenia przez warstwę gąbczastą czaszki, co może spowodować krwawienie, które można opanować poprzez płukanie ACSF (Rys. 1E). Czaszka zaczyna się uginać pod lekkim naciskiem wiertła, gdy jej grubość wynosi ~50 μm, a naczynia oponowe powinny być widoczne przez wilgotną kość (Rys. 1F). Przy tej grubości małe białe plamki w obrębie kości staną się widoczne przez kilka sekund bezpośrednio po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki.
2. Na tym etapie należy jeszcze bardziej zcieńczyć kość. Należy użyć niższej prędkości obrotowej wiertła, tj. 1000 rpm, co pozwala na ścieranie powierzchni czaszki przy jedynie lekkim dotyku. Należy wykonywać małe, kontrolowane ruchy, trzymając wiertło jak długopis i przykładając siłę wyłącznie w kierunku bocznym. Kość powinna mieć końcową grubość ~10 do 15 μm (Rys. 1G). Gdy kość jest wystarczająco cienka, małe białe plamki w kości nie będą już widoczne po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki.
3. Obszar okna należy wypolerować proszkiem z tlenku cyny. Należy przymocować gotowy wkład wiertarski, który został zanurzony w silikonowym uszczelniaczu akwariowym i wyjęty, tworząc zwężający się wierzchołek (wstawka, Rys. 1H). Silikonowy wierzchołek powinien zostać przygotowany co najmniej jeden dzień przed operacją i wysterylizowany 70% izopropanolem przed użyciem. Na okno należy nałożyć małą szczyptę proszku wraz z kroplą ACSF (Rys. 1H). Zawiesinę należy mieszać nad oknem przez maksymalnie dziesięć minut, delikatnie dotykając końcówką ruchomego wierzchołka powierzchni czaszki. Proszek z tlenku cyny należy dokładnie wypłukać z okna za pomocą ACSF, a następnie dokładnie osuszyć kość delikatnym strumieniem powietrza. Nieregularności powierzchni oraz przylegające odłamki kostne pozostałe po wierceniu w poprzednich krokach powinny zostać usunięte po polerowaniu (Rys. 1H i 1I). Proszku z tlenku cyny nie trzeba sterylizować.
4. Należy wyciąć kwadratowe kawałki szkiełka podstawowego nr 0, nieco mniejsze niż rozmiar okna. Za pomocą rylca należy delikatnie naciąć oddzielne linie poziome i pionowe w szkiełku, używając linijki. Następnie szkiełko należy umieścić w szalce Petriego i uderzyć szalką o krawędź stołu, aby oddzielić kawałki szkła. Całą szalkę Petriego można następnie poddać autoklawowaniu, aby zapewnić sterylność.
5. Obok osuszonego okna należy położyć dopasowane rozmiarem szkiełko podstawowe. Za pomocą końcówki złamanego drewnianego aplikatora z watą należy nałożyć małą ilość kleju cyjanoakrylowego na okno, a następnie szybko docisnąć docięty kawałek szkiełka do kleju. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem. Szkiełko należy delikatnie docisnąć do powierzchni czaszki i przytrzymać przez kilka sekund (Rys. 1J i 1O). Należy pozostawić klej do całkowitego wyschnięcia przez 15 minut. Nadmiar kleju cyjanoakrylowego można usunąć z górnej powierzchni szkiełka za pomocą ostrza skalpela po jego wyschnięciu. Krawędzie szkiełka należy uszczelnić cementem stomatologicznym, tworząc lekko wypukłą studzienkę do utrzymania wody dla soczewki zanurzeniowej (Rys. 1K i 1O).

4. Odzyskiwanie

1. Po operacji umieść zwierzę w ciepłej klatce. Monitoruj zwierzę okresowo, aż całkowicie wybudzi się z anestezji.
2. Jeśli preparat ma przetrwać więcej niż jeden dzień, podaj buprenorfinę (0,03 μg na g masy gryzonia) w celu przeciwbólowczym. Zazwyczaj obrazowanie zwierzęcia przeprowadzamy co najmniej jeden dzień po początkowej implantacji.

5. Przygotowanie do obrazowania

1. Ustabilizuj zwierzę na stole optycznym do obrazowania, używając ramki jako podpórki pod głowę (Rys. 1L i 1M). Aparaturę unieruchamiającą można wykonać z dostępnych komercyjnie komponentów optomechanicznych firmy Qioptiq lub ThorLabs. Nasza oddzielna płyta umożliwia transport zwierzęcia wraz z wszystkimi urządzeniami do monitorowania fizjologicznego jako jedna jednostka między salą operacyjną a pracownią obrazowania dwufotonowego ³.
2. Jeśli planowane jest obrazowanie przepływu krwi, wstrzyknij 0,05 mL 5% (w/v) fluorescencyjnego barwnika dekstranowego rozpuszczonego w jałowej soli fizjologicznej, albo przez żyłę ogonową, albo przez żyłę podoczną, aby oznakować surowicę krwi (Rys. 2A oraz 2C do 2H) ^4-7. Zabieg ten musi być wykonany w znieczuleniu ogólnym. Podanie do żyły podocznej może być łatwiejsze dla osób początkujących, ponieważ roztwory dekstranu są bardziej lepkie. Żyłę ogonową może być trudno zlokalizować u myszy o ciemnym umaszczeniu, a żyła ta ma tendencję do zapadania się po nieudanym wstrzyknięciu. Do obrazowania naczyń krwionośnych z emisją zieloną należy użyć dekstranu z izotiocyjanianem fluoresceiny. Do emisji czerwonej należy użyć dekstranu Texas Red. W przypadku dekstranów o wysokiej masie cząsteczkowej barwnik pozostanie w krążeniu przez kilka godzin. Alternatywnie, zwierzęta z endogennymi znacznikami fluorescencyjnymi można obrazować bezpośrednio przy odpowiedniej długości fali wzbudzenia dwufotonowego. Roztwór dekstranu można mrozić w alikwotach do późniejszego użycia.
3. Delikatnie oczyść powierzchnię okna wilgotnym aplikatorem z bawełnianą końcówką.
4. W przypadku długotrwałego obrazowania preparatów znieczulonych, wstrzykuj jałowy roztwór Ringera z mleczanami dootrzewnowo w objętości 3 μL na gram co 2 godziny, aby utrzymać poziom płynów ustrojowych i zapotrzebowanie energetyczne.
5. Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania ogranicz unieruchomienie głowy do zaledwie kilku godzin naraz, aby zredukować poziom stresu. Między sesjami obrazowania przekładaj zwierzę do klatki domowej w celu zapewnienia pożywienia i wody.

6. Reprezentatywne wyniki

Prawidłowo wykonane okno umożliwi obrazowanie na głębokości do 250 μm poniżej powierzchni opony miękkiej przez kilka miesięcy. Metoda ta była wykorzystywana do badania in vivo przepływu krwi w naczyniach włosowatych ^{4, 8}, aktywacji mikrogleju ^{8, 9} oraz struktury dendrytów w miąższu kory mózgu ⁸. W jednym z przykładów wykorzystujemy obrazowanie dwufotonowe do ukazania unaczynienia kory u znieczuczonej myszy Thy1-yellow fluorescent protein (YFP), po uprzednim znakowaniu surowicy krwi poprzez dożylny wtrysk dekstranu Texas Red (Rys. 2A). Naczynia opony twardej są często widoczne nieco powyżej powierzchni kory, w obrębie opony twardej (Rys. 2C, strzałka). Duże tętniczki i żyłki oponowe znajdują się na powierzchni kory (Rys. 2D). Naczynia penetrujące odgałęziają się od tej sieci powierzchniowej i wnikają do kory, gdzie rozgałęziają się w gęste łoże kapilarne zasilające tkankę korową (Rys. 2E do 2H). Drzewa dendrytyczne głębokich neuronów kory wykazujących ekspresję YFP, będących sygnałem endogennym dla tej linii myszy, mogą być obrazowane równocześnie w drugim kanale ¹⁰ (Rys. 2B do 2H). Sygnał drugiej harmoniki kości był zbierany w trzecim kanale i może służyć do oceny grubości ścienionej czaszki po zebraniu stosów obrazów (Rys. 2A do 2C).

Dynamika naczyniowa kory jest w znacznym stopniu modyfikowana przez środki znieczulające ¹¹. W drugim przykładzie prezentujemy wideo obrazujące spontaniczną wazoaktywność, zarejestrowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej u oswojonej, budzącej się myszy. Wyraźne oscylacje wazomotoryczne średnicy światła naczynia są widoczne w arteriolce oponowej, ale nie w sąsiedniej wenuli. Ten podstawowy zakres wazoaktywności ulega zmniejszeniu podczas znieczulenia uretanem ⁴. Aby ilościowo określić spontaniczne i wywołane zmiany w przepływie krwi, stosujemy dostosowane techniki skanowania liniowego w celu zarejestrowania zarówno średnicy naczyniowej, jak i prędkości erytrocytów w poszczególnych naczyniach. Szczegółowe zasoby dotyczące ilościowego obrazowania przepływu krwi z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej są dostępne ^{3, 12}.

Rycina 1. Procedura wykonania okna PoRTS. (A do K) Obrazy kolejnych kroków procedury tworzenia okna PoRTS. Szczegółowe instrukcje znajdują się w tekście. β = bregma i λ = lambda. (L) System śruby i nakrętki do stabilizacji głowy podczas obrazowania preparatów znieczulonych. (M) Specjalistyczny, obrabiany mechanicznie uchwyt poprzeczny do preparatów w stanie czuwania. W tym przykładzie zaimplantowano również konektor do wielokrotnych rejestracji elektrokortykogramu. (N) Schemat przedstawiający widok grzbietowy uchwytu głowy oraz położenie poszczególnych elementów. Nakrętka użyta w panelu L stanowi alternatywę dla poprzeczki użytej w panelu M. W przypadku uchwytu z poprzeczką dodaje się dwie wkręty samowiercące #000 w celu zwiększenia stabilności preparatów do obrazowania w stanie czuwania. (O) Schemat przedstawiający przekrój poprzeczny okna PoRTS.

Rycina 2. Obrazowanie dwufotonowe unaczynienia i struktury neuronalnej w korze mysiej. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przez okno PoRTS u myszy Thy1-YFP w 2. dniu po implantacji okna ¹⁰. Projekcja maksymalna z 150 μm tkanki w orientacji coronalnej, przedstawiająca odchudzoną czaszkę w relacji do unaczynienia (A) oraz dendrytów (B). Kość (kolor niebieski) została wykryta poprzez rejestrację fluorescencji drugiej harmonicznej przy emisji 450 nm i wzbudzeniu 900 nm ⁸. Unaczynienie (kolor czerwony) zostało oznakowane za pomocą dożylnie wstrzykniętego dekstranu Texas Red 70 kDa ⁶. Pola dendrytyczne neuronów (kolor zielony) są endogenne dla transgenicznej linii myszy Thy1-YFP. (C-H) Projekcje maksymalne z 50 μm tkanki w orientacji horyzontalnej na różnych głębokościach poniżej opony miękkiej. Dane pochodzą z tego samego stosu obrazów, który przedstawiono na panelach A i B. Naczynia oponowe mogą być widoczne tuż nad powierzchnią kory (strzałka w C).

Skróty

ACSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
PoRTS = wypolerowane i wzmocnione okno w cienkiej czaszce
YFP = żółte białko fluorescencyjne

ⁱNależy upewnić się, że opisane procedury zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).

Dyskusja

Obrazowanie dwufotonowe przez okno PoRTS wymaga transmisji przez odcieńczoną kość oraz oponę twardą, co osłabia światło lasera i wprowadza aberracje optyczne na większych głębokościach ⁸. Jednak pomimo tej wady, przy wzbudzeniu długością fali 900 nm możliwe jest uzyskanie głębokości obrazowania do 250 μm poniżej powierzchni pialnej. Większe głębokości obrazowania mogą być w zasadzie możliwe przy zastosowaniu dłuższych długości fal wzbudzenia ¹³. Główną zaletą tej metody jest brak stanu zapalnego kor...