Artykuł metodologiczny

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3764

⸱

27 kwietnia 2012

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University , 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Streszczenie

Znajomość czasu, poziomu, lokalizacji komórkowej oraz typu komórek, w których ekspresowany jest gen, przyczynia się do zrozumienia jego funkcji. Każdą z tych cech można określić za pomocą hybrydyzacji in situ mRNA wewnątrz komórek. Przedstawiamy tutaj metodę radioaktywnej hybrydyzacji in situ zmodyfikowaną według Clayton et al. (1988)1, która z powodzeniem funkcjonuje w naszym laboratorium od wielu lat, szczególnie w przypadku mózgów dorosłych kręgowców2-5. Długie komplementarne sondy RNA (cRNA) do sekwencji docelowej umożliwiają wykrywanie transkryptów o niskiej obfitości6,7. Włączenie radioaktywnych nukleotydów do sond cRNA pozwala na dalsze zwiększenie czułości wykrywania transkryptów o niskiej obfitości oraz na analizy ilościowe, przeprowadzone za pomocą światłoczułej kliszy rentgenowskiej lub emulsji naniesionej na tkankę. Metody detekcji te zapewniają długoterminowy zapis ekspresji genu docelowego. W porównaniu z metodami z wykorzystaniem sond nieradioaktywnych, takimi jak znakowanie DIG, metoda hybrydyzacji z sondą radioaktywną nie wymaga wielokrotnych etapów amplifikacji z użyciem przeciwciał HRP i/lub zestawu TSA w celu wykrycia transkryptów o niskiej obfitości. W związku z tym metoda ta zapewnia liniową zależność między intensywnością sygnału a ilością docelowego mRNA na potrzeby analizy ilościowej. Pozwala ona na jednoczesne przetwarzanie 100–200 slajdów. Metoda ta sprawdza się również w przypadku różnych stadiów rozwojowych embrionów. Większość badań rozwojowych nad ekspresją genów wykorzystuje całe embriony i podejścia nieradioaktywne8,9, częściowo dlatego, że tkanka embrionalna jest bardziej delikatna niż tkanka dorosła i wykazuje mniejszą kohezję między komórkami, co utrudnia dostrzeżenie granic między populacjami komórek w przekrojach tkankowych. W przeciwieństwie do tego, nasze podejście radioaktywne, dzięki szerszemu zakresowi czułości, pozwala na uzyskanie wyższego kontrastu w rozdzielczości ekspresji genów między obszarami tkanki, co ułatwia dostrzeżenie granic między populacjami. Stosując tę metodę, badacze mogą ujawnić możliwe znaczenie nowo zidentyfikowanego genu i dalej przewidzieć funkcję badanego genu.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki

  1. Pobrać świeże tkanki. W przypadku embrionów ptaków ostrożnie otworzyć jaja i dwukrotnie przemyć embrion w naczyniu z 1xPBS. W przypadku mózgów dorosłych osobników szybko usunąć mózg i delikatnie przemyć go 1xPBS.
  2. Zatopić embriony lub mózg dorosłego osobnika w formie do zatapiania wypełnionej OCT tissue tek, orientując tkankę zgodnie z potrzebami sekcjonowania, a następnie szybko zamrozić blok, umieszczając go w mieszaninie etanolu i suchego lodu, uważając, aby mieszanina nie dostała się do wnętrza bloku.
  3. Pokroić zamrożoną próbkę w kriotomie na sekcje o grubości 10-12 μm. Dla tkanek mózgu i embrionalnych optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C.
  4. Nanieść zamrożone sekcje na szkiełka przedmiotowe super plus.
  5. Przechowywać sekcje w kasecie na szkiełka w temperaturze -80 °C.

2. Generowanie radioaktywnych rybosond (Należy stosować procedury bezpieczeństwa radiologicznego obowiązujące w danej instytucji)

  1. Przygotuj oczyszczoną liniową matrycę DNA dla wybranego cDNA, stosując trawienie enzymatyczne fragmentu klonowanego, otoczonego sekwencjami promotora polimerazy RNA w plazmidowym DNA, lub za pomocą PCR insertu połączonego z miejscami wiązania promotora polimerazy RNA. Możliwe jest również generowanie fragmentów PCR z promotorami polimerazy RNA jako części starterów PCR 3' i 5'. Oczyść fragmenty po trawieniu lub PCR za pomocą żelu, wykorzystując zestaw do oczyszczania z żelu GENECLEAN.
  2. Do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml dodaj 0,5-1 μg oczyszczonej liniowej matrycy DNA, bufor do transkrypcji, DTT, RNasin, roztwór mieszaniny nukleotydów AGC oraz wodę wolną od RNaz, aby dopełnić objętość do pożądanej ilości. Następnie dodaj S35-UTP oraz odpowiednią polimerazę RNA w celu otrzymania rybosond antysensownych lub sensownych.
  3. Inkubuj mieszaninę przez 1 hr w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj kolejną porcję polimerazy RNA i inkubuj przez następną 1 hr.
  4. Do probówki Eppendorf dodaj 3M roztwór octanu sodu (0,1 objętości całkowitej) oraz 100% EtOH (2,5 objętości całkowitej), aby wytrącić syntetyzowaną rybosondę RNA.
  5. Inkubuj w suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C przez 15 min lub ponad 3 godziny, aby wspomóc wytrącanie.
  6. Zgatheredz RNA w osad poprzez wirowanie w temperaturze 4 °C przy 15 000 rpm w wirówce stołowej Eppendorf przez 30 min.
  7. Usuń nadsącz i przemyj osad 70% EtOH, delikatnie opukując probówkę palcem, aby dobrze wymieszać osad.
  8. Ponownie zgromadź RNA w osad poprzez wirowanie w temperaturze 4 °C przy 15 000 rpm przez 30 min.
  9. Całkowicie usuń nadsącz za pomocą pipety, a następnie dodaj 40 μl roztworu do hybrydyzacji. Wymieszaj dokładnie, pipetując roztwór w górę i w dół.
  10. Przenieś 1 μl roztworu do 3 ml roztworu Safety-Solve w fiolce do pomiarów scyntylacyjnych, wymieszaj dokładnie i zmierz liczbę zliczeń w liczniku scyntylacyjnym.
  11. Przechowuj probówkę Eppendorf z rybosondą w temperaturze -20 °C; należy jej użyć w ciągu jednego tygodnia.

3. Obróbka tkanki

  1. W komorze z wyciągiem przygotować świeży 4% roztwór paraformaldehydu w buforze PBS, podgrzany do temperatury o około 3-5 °C wyższej od temperatury pokojowej. Slajdy przechowywane w temperaturze -80 °C umieścić w metalowym statywie na suchym lodzie, przenieść na stanowisko pracy pod wyciągiem, a następnie zanurzyć statyw w 4% roztworze paraformaldehydu i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć 3 razy w 1 x PBS, zanurzając ok. 15 razy w każdym cyklu (około 1 sekundy na jedno zanurzenie).
  3. W komorze z wyciągiem przygotować bufor do acetylacji i energicznie wstrząsnąć w ciągu 10 sekund. Natychmiast wlać do kuwety zawierającej statyw ze slajdami i inkubować przez 10 min w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania sondy ryboprobowej.
  4. Przepłukać 3 razy w 2 x SSPE przez 15 zanurzeń.
  5. Odwodnić w serii EtOH 70%, 95% i 100% przez 2 min w każdym kroku (czynność ta nie musi być wykonywana w komorze z wyciągiem).
  6. Osuszyć slajdy pod wyciągiem przez co najmniej 10-15 min.

4. Hybrydyzacja

  1. Oblicz ilość sondy rybowej (0,5-1 x 106 cpm na slajd) i roztwór hybrydyzacyjny (100 μl na slajd) jest wymagana dla wszystkich slajdów. Podgrzej mieszaninę do hybrydyzacji z sondą rybonukleotydową do 65 °C przez 5 min w celu denaturacji sondy rybowej.
  2. Pipeta 100 μl roztworu do hybrydyzacji sondy ryboprobowej w linii w poprzek szkiełka, a następnie za pomocą szkiełka podstawowego rozprowadzić go równomiernie po tkance i szkiełku. Szkiełka należy umieścić poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a następnie powoli wstawić statyw pionowo do 65 °C w kąpieli olejowej przez minimum 4 h i maksymalnie 16 h. Olej tworzy szczelną barierę wokół szkiełek nakrywkowych.
  3. Wyjąć metalowe statywy z kąpieli olejowej i za pomocą ręcznika papierowego wytrzeć nadmiar oleju wokół statywu.
  4. Dwukrotnie wypłucz olej z pokrytych szkiełek i metalowego koszyka w kuwetach szklanych lub metalowych zawierających chloroform. 2nd przemywanie chloroformem można wykorzystać jako pierwszy etap kolejnego eksperymentu.
  5. Przenieść statyw z zakrytymi szkiełkami do kuwety z roztworem 0,1% β-merkaptoetanolu + 2 x SSPE i kilkukrotnie poruszać nim w górę i w dół, aby poluzować szkiełka nakrywkowe i usunąć nadmiar roztworu do hybrydyzacji.
  6. Przenieś kasetę z przykrytymi szkiełkami do świeżego roztworu 0,1% β-merkaptoetanolu w 2 x SSPE, a następnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety wolnej od RNaz bezpośrednio w roztworze, aby zapobiec porysowaniu skrawków tkanek. Przenieś odsłonięte szkiełka do nowej kasety w poziomym uchwycie do kaset w kuwecie, do roztworu 0,1% β-merkaptoetanolu w 2 x SSPE.
  7. Inkubować kasetę z preparatami w świeżym roztworze 0,1% $\beta$-merkaptoetanolu + 2 x SSPE w temperaturze pokojowej przez 1 h w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanego sondy RNA. Roztwory te oraz poprzednie wodne roztwory płuczące, a także szkiełka zakrywające, należy zutylizować jako odpady radioaktywne.
  8. Przenieś kasetę z preparatami do uprzednio podgrzanego roztworu 2x SSPE w temperaturze 65 °C, dodać β-merkaptoetanol do stężenia końcowego 0,1% i inkubować w 65 °C przez 1 h. Utylizować jako odpady radioaktywne.
  9. Przenieść kasetę z szkiełkami i inkubować dwukrotnie w podgrzanym wcześniej roztworze 0,1 x SPPE w temperaturze 65 °C przez 30 min każdy. Ilość radioaktywności usunięta na tym etapie jest bardzo niewielka i po tym kroku nie jest już uznawana za nadmierne odpady radioaktywne.
  10. Odwodnij kasetkę i szkiełka w 70%, 95% i 100% EtOH przez 2 min w każdym z roztworów.
  11. Suszyć preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 min.

5. Wizualizacja sygnału promieniotwórczego

  1. Umieść suche szkiełka w kasecie filmowej, a następnie w ciemni połóż film rentgenowski (film Kodak BioMax MR) na szkiełkach i zamknij kasetę. Upewnij się, że szkiełka są skierowane w stronę emulsji filmu rentgenowskiego. Naświetlaj szkiełka przez ok. 1-7 dni, w zależności od oczekiwanej liczby transkryptów.
  2. Wywołaj film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji pojawia się na filmie jako kolor czarny (naświetlone ziarna srebra w emulsji) (Ryc. 1).
    1. (Opcjonalnie) Aby określić rozdzielczość komórkową i zobaczyć sygnał na tkance, szkiełka należy zanurzyć w emulsji fotograficznej i poddać barwieniu kontrastowemu. Jeśli planujesz końcowe barwienie fioletem krezylowym, przeprowadź delipidyzację przekrojów poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie rehydratację przez 1 min w kolejnych roztworach EtOH: 100%, 100%, 95%, 95%, 70% i 50%, a na koniec w wodzie dejonizowanej. Jeśli nie zamierzasz stosować barwnika wymagającego delipidyzacji, krok ten nie jest konieczny. Wysusz dokładnie szkiełka w dygestorium przez co najmniej 2-3 h.
    2. W ciemni, korzystając z bezpiecznego światła, odmierz do szklanego naczynia do zanurzania odpowiednią ilość emulsji Kodak NTB, aby przykryła połowę długości szkiełka (tzn. tkankę), a następnie rozpuść ją w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 20-30 min. Następnie rozcieńcz emulsję wodą destylowaną w stosunku 1:1. Poziom emulsji powinien teraz pokrywać wszystkie przekroje na szkiełku podczas jego zanurzania. W przypadku dużej liczby szkiełek może być konieczne przygotowanie dodatkowej ilości emulsji.
  4. Zanurz szkiełka w rozcieńczonej emulsji w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i pozostaw do wyschnięcia w zamkniętym, światłoszczelnym pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 h przy wyłączonym świetle.
  5. Przenieś szkiełka do slotów w statywach w czarnych pudełkach zawierających desykatory, dbając o to, aby szkiełka nie dotykały się, co mogłoby spowodować powstanie artefaktów. Powoli uszczelnij krawędzie pudełek czarną taśmą izolacyjną, aby zapobiec powstawaniu iskier wywołanych ładunkami elektrostatycznymi, a następnie owiń pudełka folią aluminiową. Przechowuj pudełka w temperaturze 4 °C od kilku dni do kilku tygodni (sygnał po 1 dniu na filmie rentgenowskim jest podobny do sygnału po 5 dniach pod emulsją).
  6. Ogrzewaj pudełka ze szkiełkami do temperatury pokojowej przez 1 h.
  7. W ciemni wyjmij statyw ze szkiełkami (lub umieść szkiełka w metalowym statywie, jeśli używasz pudełek ze slotami) z pudełek i wywołuj je w wywoływaczu Kodak D-19 w temperaturze 16 °C przez 3,5 min.
  8. Przemyj wywołane szkiełka wodą z kranu w temperaturze pokojowej przez 1 min.
  9. Inkubuj szkiełka dwukrotnie w utrwalaczu w temperaturze 19 °C przez 6 min za każdym razem. Podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło.
  10. Przemywaj szkiełka pod bieżącą wodą w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min i zeskrob emulsję z tylnej strony szkiełka, gdy jest jeszcze „mokre”, używając żyletki, aby uniknąć zarysowania szkła.
  11. Zabarw tkankę 0,3% fioletem krezylowym w wodzie z kranu przez 5 min.
  12. Usuń nadmiar roztworu fioletu krezylowego, zanurzając szkiełka w świeżej wodzie z kranu ok. 15 razy.
  13. Odwodnij szkiełka, zanurzając je ok. 15 razy w każdym z roztworów alkoholu: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% i 100% EtOH.
  14. Inkubuj szkiełka w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej dwukrotnie.
  15. Nałóż na szkiełko szkiełko nakrywkę z medium Permount i pozostaw do wyschnięcia w dygestorium przez noc (>16 h); upłynięcie kilku dni jest niezbędne, aby klej stał się wystarczająco trwały do dalszego czyszczenia szkiełek.

6. Generowanie kolorowych obrazów w ciemnym polu

  1. W razie potrzeby należy dodatkowo usunąć nadmiar emulsji z tyłu szkiełek (strona bez szkiełka nakrywkowego i bez tkanki), zwilżając ją wodą i zdrapując żyletką.
  2. Płukanie szkiełek 80% roztworem EtOH i delikatne przetarcie 1-2 razy w celu usunięcia zanieczyszczeń i kurzu.
  3. Wykonanie zdjęć w oświetleniu w ciemnym polu lub jasnym polu. Kroki 6.2 i 6.3 mogą wymagać 2-3 powtórzeń, aby uzyskać dobre obrazy bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereotypowym.

7. Reprezentatywne wyniki

Istnieją dwa główne sposoby obrazowania wyników hybrydyzacji in situ na skrawkach tkanek hybrydyzowanych z radioaktywnymi sondami S35: 1) przy użyciu filmu rentgenowskiego nakładanego na szkiełka lub 2) poprzez nałożenie emulsji bezpośrednio na szkiełka. Trzecim podejściem jest zastosowanie ekranu fosforyzującego (phosphorimager) umieszczonego nad szkiełkami, jednak rozdzielczość tej metody okazała się w naszym przypadku niesatysfakcjonująca. Filmy rentgenowskie zapewniają szybki wynik oraz pozwalają na analizę ogólnego stanu hybrydyzacji. Dane z filmu rentgenowskiego ujawniają również szeroką rozdzielczość anatomiczną i mogą być wykorzystane do analizy ilościowej10. Przykłady obrazów z filmu rentgenowskiego głów późnych embrionów ptaków hybrydyzowanych z sondami antysensownymi dla ekspresji genów FoxP1 i CoupTF2 znajdują się na Rysunkach 1A i B. Oba geny wykazują wysoką obfitość w specyficznych podregionach mózgu. Wynik z filmu rentgenowskiego wysokiej jakości powinien być ostry (nie rozmyty) i charakteryzować się wysokim stosunkiem sygnału do tła. Rozmyty obraz może wynikać z nierównomiernego kontaktu filmu rentgenowskiego ze szkiełkiem z hybrydyzowaną tkanką.

W przypadku szkiełek zanurzonych w emulsji, emulsja zawiera światłoczułe sole srebra naniesione bezpośrednio na tkankę, w przeciwieństwie do filmu rentgenowskiego, gdzie znajdują się one na tworzywie sztucznym. Podczas wywoływania sole srebra wystawione na działanie S35 ulegają przekształceniu w ziarna srebra metalicznego, podobnie jak w przypadku filmu rentgenowskiego. Jednak osady srebra są bezpośrednio widoczne nad komórkami, co reprezentuje ekspresję genów, którą można obserwować i mierzyć jakościowo pod mikroskopem. Ziarna srebra metalicznego blokują przejście światła i w obrazowaniu w polu jasnym widoczne są jako czarne kropki. Kontrastowe barwienie fioletem krezylowym ma kolor purpurowy (Rys. 3A, 3C i Rys. 4). W polu ciemnym ziarna srebra odbijają światło padające z boku i pojawiają się jako białe kropki (Rys. 1C, 1D, 3B i 3D). W tej konfiguracji barwienie fioletem krezylowym ma kolor czerwony. W polu jasnym sygnał hybrydyzacji jest łatwiejszy do obserwacji przy dużym powiększeniu w rozdzielczości komórkowej, natomiast w polu ciemnym sygnał hybrydyzacji można dodatkowo oglądać przy mniejszym powiększeniu w obrębie całej tkanki. Obrazowanie w polu ciemnym jest metodą, której powszechnie używamy do przedstawienia ogólnego wzorca ekspresji genów. Jednak w porównaniu do szybkich wyników uzyskiwanych z filmów rentgenowskich, przygotowanie szkiełek zanurzonych w emulsji zajmuje więcej czasu (od jednego do kilku tygodni) i jest bardziej podatne na powstawanie tła.

Wyróżnia się cztery powszechne źródła silnego tła: 1) tło na całej kliszy rentgenowskiej zazwyczaj wynika z problemów z wywoływaczem lub utrwalaczem bądź z częściowego naświetlenia kliszy; 2) tło na szkiełkach przedmiotowych zazwyczaj wynika z problemów z płukaniem lub przygotowaniem szkiełek, takich jak nieprawidłowa sylinizacja szkiełek pochodzących z komercyjnego źródła lub przygotowanych samodzielnie; 3) tło wynikające z naświetlania i wywoływania emulsji; oraz 4) tło na preparacie wynikające z braku starannych etapów płukania po hybrydyzacji, zbyt niskiej temperatury hybrydyzacji, słabej jakości roztworu do hybrydyzacji, zanieczyszczenia naczyń do płukania paraformaldehydem powodującego trwałe sieciowanie sond z tkanką, degradacji rybosond prowadzącej do niespecyficznego znakowania tkanki przez małe cząsteczki, nieaktywnego DTT lub β-merkaptoetanolu skutkującego sieciowaniem sond S35-RNA z tkanką poprzez wiązania dwusiarczkowe, a także zbyt długiego oczekiwania na acetylację. Krytyczne jest umieszczenie szkiełek w roztworze do acetylacji w ciągu kilku sekund od zmieszania bezwodnika octowego i trietanolaminy. Jeśli upłynie kilka minut bez naniesienia roztworu na szkiełka, grupy acetylowe nie zostaną efektywnie usunięte i będą wiązać się niespecyficznie z RNA. Inne czynniki obejmują hybrydyzację trwającą powyżej 20 hr, co może generować zbyt silny sygnał, oraz nadmiar kropel oleju na szkiełkach, które zatrzymują roztwór do hybrydyzacji na szkiełkach podczas płukania w roztworach wodnych, co skutkuje powstaniem radioaktywnych plamek na tkance i szkiełkach, dających ciemne sygnały tła. W przypadku pracy z dużą liczbą szkiełek (więcej niż 100 skrawków), należy dodać 3rd płukanie chloroformem lub wymienić roztwory do płukania chloroformem, aby zapobiec pozostawaniu nadmiernych cząsteczek oleju na szkiełkach. Nieostrożne obchodzenie się z tkanką, tzn. zbyt wolne zamrażanie (powyżej 5-10 min po sekcji) lub rozmrażanie i ponowne zamrażanie, również zwiększa tło z powodu degradacji mRNA. Należy uważać, aby nie pomylić tła z prześwietleniem.

Tło emulsji na zanurzonych slajdach może wystąpić, ponieważ jest ona silnie światłoczuła i wymaga długiej ekspozycji w ciemności. Typowe problemy z tłem obejmują zbyt wysoką temperaturę wywoływacza i utrwalacza. Gdy temperatura przekracza 19 °C, zbliżając się do temperatury pokojowej lub ją przewyższając, uzyskuje się silniejsze tło z ziaren srebra. Narażenie na niskie poziomy światła przedostającego się do ciemni spowoduje powstanie tła emulsji. Zbyt krótkie wypłukiwanie utrwalacza (minimum 30 min w bieżącej wodzie) pozostawi resztki utrwalacza, który następnie reaguje z fioletem krezolowym, tworząc brązowy osad w całej emulsji. Jednakże, jeśli slajdy są płukane w wodzie dłużej niż 90 min po utrwaleniu, a przed barwieniem fioletem krezolowym, może to spowodować poluzowanie emulsji i słabe barwienie przekrojów. Jeśli nie ma wystarczającej ilości czasu, aby zabarwić slajdy w oknie czasowym od 30 do 90 min po utrwaleniu i płukaniu, należy po 30 min płukania wysuszyć slajdy przez noc i przystąpić do barwienia fioletem krezolowym następnego dnia. Generalnie większość mRNA wykazuje specyficzne wzorce ekspresji genów, podczas gdy sygnał tła jest bardziej jednolity.

Zagięcia tkanki mogą prowadzić do błędnych wyników ekspresji genów na kliszy rentgenowskiej, powodując powstanie obszarów o ciemniejszym sygnale. Aby ustalić, czy tkanka jest zagięta, należy zbadać niebarwione skrawki w ciemnym polu lub skrawki barwione fioletem krezylowym w jasnym polu. Kontrbarwienie fioletem krezylowym stanowi lepszą metodę oceny stanu tkanki.

W celu lepszej interpretacji swoistości sond, kontrolne sondy sensowne należy zastosować na kilku sąsiednich skrawkach. Większość sond sensownych nie wykazuje sygnału, jednak niektóre go generują, a w takich przypadkach często różni się on od sygnału antysensownego. Przypuszczamy, że może to być związane z syntezą antysensowną lub innym genem na nici antysensownej genomu. Przedstawiamy przykład sond sensownych i antysensownych dla Pax6 (Rys. 2A i B). Nić antysensowna wykazuje znakowanie wzdłuż strefy komorowej przedmózgowia, móżdżku i oka, zgodnie z oczekiwaniami (Rys. 2A), natomiast sonda sensowna wykazuje znakowanie w warstwie pigmentowej siatkówki (Rys. 2B).

W przypadku wielkości sond stosujemy sondy cDNA w zakresie od 300 do 5000 bps. Sondy krótsze niż 300 bps działają, ale sygnały są zazwyczaj słabsze. Nie testowaliśmy sond dłuższych niż 5000 bps. Najlepiej jest stosować sondy na tkankach pochodzących z tego samego gatunku, jeśli jest to możliwe. W przeciwnym razie przeprowadzamy hybrydyzację krzyżową sond na skrawkach innych gatunków i obniżamy temperaturę hybrydyzacji oraz przemywania w stopniach 3-5 °C w zależności od tożsamości sekwencji, jeśli jest ona znana. Jeśli nie jest znana, dobieramy temperatury hybrydyzacji i przemywania metodą prób i błędów. Jeśli temperatura zostanie obniżona zbyt mocno, sonda cDNA może ulec hybrydyzacji krzyżowej z innymi mRNA o podobnych sekwencjach u różnych gatunków lub w obrębie tego samego gatunku11. W praktyce stwierdziliśmy, że dla cDNA, które wykazują ~95% lub większą tożsamość z docelowym mRNA w tkance, rygorystyczne warunki temperatury hybrydyzacji i przemywania (65 °C) sprawdzają się dobrze. Dla sekwencji o tożsamości w zakresie od ~85 do 94%, temperaturę hybrydyzacji i przemywania może być konieczne obniżyć do zakresu od ~50 do 60 °C.

Powodem stosowania metalowego statywu w większości etapów jest wykorzystanie przemywań chloroformem oraz ksylenem. Obie substancje organiczne topią wiele rodzajów tworzyw sztucznych. Szkło i niektóre rodzaje tworzyw sztucznych są odporne na te rozpuszczalniki organiczne. Jednak szkło łatwiej ulega stłuczeniu, a niektóre tworzywa sztuczne, które początkowo są odporne, mogą stopić się podczas długotrwałej ekspozycji na związki organiczne.

Przekroje histologiczne rozwijającego się mózgu myszy; porównanie ekspresji FoxP1 i CoupTF2.
Rycina 1. Autoradiografia obrazów hybrydyzacji in situ z filmów rentgenowskich oraz preparatów zanurzonych w emulsji. (A-B) Obrazy z filmu rentgenowskiego strzałkowych przekrojów całej głowy kanarka zebra na 10. dniu embrionalnym, zhybrydyzowanych z antysensownymi sondami rybowymi dla (A) FoxP1 lub (B) CoupTF2, wykonane przy użyciu oświetlenia w polu jasnym pod mikroskopem stereoskopowym. Czarne, naświetlone ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA. Pasek skali = 500 μm. (C-D) Obrazy z preparatów zanurzonych w emulsji strzałkowych przekrojów całej głowy kanarka zebra na 6. dzień po wykluciu, zhybrydyzowanych z antysensownymi sondami rybowymi dla (C) FoxP1 i (D) CoupTF2, wykonane przy użyciu oświetlenia w polu ciemnym pod mikroskopem stereoskopowym. Białe, naświetlone ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Kolor czerwony to barwienie fioletem krezylowym. Pasek skali = 200 μm. Na wszystkich zdjęciach dziób znajduje się po lewej stronie (rostralnie). Filmy rentgenowskie były naświetlane przez jeden dzień, preparaty zanurzone przez 3 dni. Sonda FoxP1 ma długość 178 bps i odpowiada fragmentowi mRNA od 1544-1711 bp; sonda CoupTF2 ma długość 545 bps i odpowiada fragmentowi mRNA od 1-545 bp. Jak widać, w przedmózgowiu mRNA FoxP1 jest wzbogacone w mesopallium (M), striatum (St) i grzbietowym wzgórzu (DT), natomiast CoupTF2 jest wzbogacone w nidopallium (N), arcopallium (A) oraz w bardziej brzusznych częściach wzgórza. Ekspresja jest spójna pomiędzy typami ekspozycji (i wiekiem). Jednak w przypadku preparatów zanurzonych w emulsji widoczne jest znakowanie o wyższej rozdzielczości, a granice tkanek i ich podziały są identyfikowane bezpośrednio. Te oraz wszystkie pozostałe obrazy przedstawione w pracy pochodzą z przekrojów poddanych standardowej hybrydyzacji o wysokiej rygorystyczności w 65 °C.

Analiza ekspresji genów, schematy A i B, przedstawiające rozwój oka, wyniki porównawcze, badanie naukowe.
Rysunek 2. Porównanie znakowania nici antysensownej i sensownej wykazujące różne wzorce. (A) Nić antysensowna Pax6 była eksprimowana w mózgu, zwłaszcza w strefie komorowej (biała strzałka). Przedstawiono autoradiografię na filmach rentgenowskich przekrojów strzałkowych całej głowy pobranych od kanarka w 12. dniu embrionalnym. (B) Sąsiedni przekrój hybrydyzowany z nicią sensowną Pax6 nie wykazuje ekspresji tła w całej głowie embrionu, lecz widoczną ekspresję w warstwie barwnikowej siatkówki (czarne strzałki), podobnie jak w przypadku nici antysensownej. Linia przerywana oznacza kontur całego mózgu. C: móżdżek.

Obraz mikroskopowy przekrojów tkanki mózgowej; analiza barwienia; oznakowane obszary; wyniki eksperymentalne.
Rycina 3. Sygnały ekspresji genów in situ na szkiełkach zanurzonych w emulsji, pobranych z mózgu kanarka zebra w późnych stadiach embrionalnych, w obrazowaniu w polu jasnym i ciemnym. (A) Obraz w polu jasnym ekspresji D1B w 10. dniu embrionalnym przy normalnej ekspozycji na emulsję. Marker (czarny) jest ledwo widoczny przy tym powiększeniu. Sonda ma długość 625 bps i jest komplementarna do fragmentu 1-625 bp mRNA. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A), ale w obrazowaniu w polu ciemnym, wykazujące marker (biały) w prążkowiu (St) i wzgórzu (TH). (C) Obraz w polu jasnym ekspresji Slit3 w 12. dniu embrionalnym przy nadmiernej ekspozycji na emulsję. Marker (czarny) jest wyraźnie widoczny. Sonda ma długość 779 bps i jest komplementarna do fragmentu 1243-2021 bp mRNA. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A), przełączone na obrazowanie w polu ciemnym, wykazujące marker (biały) w rdzeniu kręgowym (SC), co odpowiada obrazowi w polu jasnym. Kierunek rostralny jest skierowany w lewo. Cb: móżdżek.

Wynik mikroskopii przedstawiający komórki zabarwione na fioletowo, wykorzystany w analizie histologicznej do badań gęstości komórek.
Rycina 4. Rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym. Przedstawiono znakowanie mRNA FoxP1 w przedmózgowiu kanarka zebrowego z ziarnami srebra (czarne kropki) nad komórkami (fiolet krezylowy) w różnych regionach mózgu i w różnym wieku, w porównaniu z obrazami przy mniejszym powiększeniu z Ryciny 1A i 1C. (A) Wysoki poziom ekspresji nad pojedynczymi komórkami (czarne strzałki) w mesopallium dorosłego kanarka zebrowego. (B) Niski poziom ekspresji nad pojedynczymi komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiednim nidopallium tego samego przekroju. (C) Wysoka ekspresja mRNA FoxP1 nad komórkami (czarne strzałki) w mesopallium w 12. dniu embrionalnym. (D) Niski poziom ekspresji nad komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiednim nidopallium tego samego przekroju. Przykładowe komórki obwiedziono żółtą linią. Komórki embrionalne (C i D) są mniejsze i gęściej upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi (A i B). Ponieważ między komórkami a emulsją występuje pewna przestrzeń, obszar odsłoniętych ziaren srebra z sondy S35 jest nieco większy niż obszar ciał komórkowych. Pasek skali = 10 μm.

Dyskusja

Radioaktywna hybrydyzacja in situ ekspresji mRNA jest szeroko stosowana w wielu celach, w tym do badania regionalnej organizacji tkanek, typów komórek oraz funkcjonalnej aktywności mózgu2-5,10,12-14. To ostatnie zastosowanie dotyczy genów, których ekspresja mRNA w mózgu jest zależna od zwiększonej aktywności neuronalnej, często nazywanych genami zależnymi od aktywności lub genami wczesnymi (immediate early genes). Przy takich zastosowaniach nasza metoda była stosowana u wielu gatunków, w tym u ptaków, ssaków (np. człowieka), ryb i płazów; w wielu tkankach, w tym w mózgu, skórze i mięśniach; oraz w różnym wieku, w tym u piskląt/noworodków, osobników młodocianych, dorosłych, a tutaj w przekrojach całych embrionów2,3,5,15-17. Cechy szczególne naszego protokołu obejmują: (1) zapewnia on równowagę między specyficznością anatomiczną a specyficznością ilościową. Aby określić ilość ekspresji genu na kliszy rentgenowskiej, wykonujemy cyfrowe zdjęcia obrazów (np. Rys. 1A i 1B), używamy funkcji histogramu programu Photoshop (Adobe) do pomiaru gęstości pikseli w obszarach zainteresowania i odejmujemy poziomy tła na kliszy poza tkanką, ale wciąż na szkiełku podstawowym2,4. Aby określić ilość ekspresji na poziomie komórkowym, wykonujemy zdjęcia ziaren srebra nad komórkami przy dużym powiększeniu (40-100X; Rys. 4). Następnie używamy funkcji threshold i measure programu Image J opracowanego przez Wayne'a Rasbanda w NIH, aby policzyć liczbę ziaren srebra na obrazie, odejmujemy liczbę ziaren tła w podobnym obszarze bez komórek na szkiełku podstawowym, a następnie dzielimy przez liczbę komórek, aby uzyskać wartości ekspresji na komórkę4,18. (2) Może charakteryzować się stosunkowo wysoką przepustowością, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie 100-200 szkiełeczek dzięki szczelnemu zamknięciu szkiełek przykrywek za pomocą kąpieli w oleju mineralnym. Standardowe metody hybrydyzacji in situ wymagają więcej czasu na uszczelnienie szkiełeczek za pomocą parafilmu, lakieru do paznokci i innych środków, co powoduje, że szkiełka zajmują dużo miejsca; (3) jest bardzo czuła w przypadku transkryptów o niskiej liczebności dzięki zastosowaniu siarczanu dekstranu i roztworu Denhardta w buforze hybrydyzacyjnym2,13; (4) podejście obrazowe w ciemnym polu daje obrazy o wysokim kontraście dzięki wykonywaniu zdjęć w oświetleniu ciemnego pola na mikroskopie stereoskopowym4,5. Ponadto pozwala na czułą detekcję niewielkich zmian w ekspresji genów, takich jak ekspresja genów zależnych od aktywności, w celu zidentyfikowania konkretnych obszarów mózgu aktywowanych podczas percepcji i realizacji określonych zachowań19. Ograniczeniami w porównaniu z protokołami nieradioaktywnymi są fakt, że te ostatnie oferują wyraźniejszą rozdzielczość komórkową i dokładniejszą lokalizację mRNA wewnątrz komórki, a praca z emulsją jest bardzo wrażliwa na manipulację i światło. Naszą metodę można łączyć z innymi metodami, takimi jak nieradioaktywna hybrydyzacja in situ, aby znakować ekspresję mRNA więcej niż jednego genu w tej samej tkance10,17,20. Może być ona łączona z immunocytochemią w celu znakowania ekspresji zarówno RNA, jak i białka w tej samej próbce, aby współlokalizować mRNA z określonymi typami komórek10. Modyfikacje protokołu niezbędne dla takich eksperymentów z podwójnym znakowaniem zostały opisane w cytowanych referencjach.

Podsumowując, nasze podejście ułatwia zrozumienie czasu i lokalizacji komórkowej ekspresji genów w celu poznania organizacji regionów, aktywności funkcjonalnej tkanek oraz funkcji genów.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Jarvis za udoskonalenie protokołu na przestrzeni lat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezwodnik octowyVWRMK242002
ChloroformVWRBDH1109
Octan fioletu krezolowegoSigmaC5042
KriostatThermo scientificMicrom HM550
Dejonizowany formamidSigmaF9037
DTTPromegaP1171100mM
EDTASigmaED
Forma do zatapianiaVWR15160-215
Szkiełka Superfrost plus marki FisherFisher Scientific22-034-979
FormaldehydVWRBDH0506-4LP
FormamidSigmaF7508
Zestaw GENECLEANQ-Bio gene1001-200
Film Kodak BioMax MRSigmaZ350370
Emulsja Kodak NTBCarestream Health8895666
Wywoływacz Kodak Professional D19Kodak1462593
Utrwalacz Kodak ProfessionalKodak1971746
β-merkapto–etanolCalbiochem444203
Olej mineralnyVWRIC15169491
NaOHVWRSX0600-1
ParaformaldehydSigma76240
Poly AInvitrogenPOLYA.GF
rATPPromegaP113210mM
rCTPPromegaP114210mM
rGTPPromegaP115210mM
RNasinPromegaN211140Units/μl
S35 UTPPerkinElmerNEG039C001MC
Roztwór Safety-SolveSafety Solve Research Products International111177
Octan soduSigmaS78993M
Fosforan sodu zasadowySigmaS3264
Fosforan sodu kwaśnySigmaS3139
Polimeraza RNA SP6PromegaP1085
Metalowy statyw do barwieniaElectron Microscopy Sciences70312-54
Polimeraza RNA T7PromegaP2075
Tissue-Tek OCTSakura4583
5x bufor do transkrypcjiPromegaP1181
TrietanolaminaVWRIC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)VWR101449-446
tRNARoche10109509001

Roztwory:

  1. Odczynniki do otrzymywania ribosond: 1,5 μl matrycy DNA (0,2-0,3 μg/μl), 2 μl 5x zoptymalizowanego buforu do transkrypcji, 1 μl 100mM DTT (dołączony do polimerazy z firmy Promega, dokładnie wymieszać w temperaturze pokojowej), 0,3 μl RNasinu (40 jednostek/μl), 1,5 μl roztworu mieszanki rybonukleotydów AGC, 3,5 μl S35 UTP oraz 1 μl polimerazy RNA. Uzupełnić do 10 μl wodą wolną od nukleaz.
  2. Roztwór mieszanki rybonukleotydów AGC: zmieszać równe ilości 10mM ATP, GTP i CTP.
  3. Roztwór octanu sodu do wytrącania EtOH w celu usunięcia wolnego S35 UTP: 40 μl wody wolnej od RNazy i DNazy, 5 μl 3M octanu sodu oraz 125 μl 100% EtOH.
  4. Bufor do hybrydyzacji (stok 10 ml): 5 ml 100% dejonizowanego formamidu, 600 μl 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8,0), 240 μl 0,5M EDTA (pH = 8,0), 100 μl 100x roztworu Denharta, 100 μl 1M DTT, 250 μl 20 mg/ml tRNA, 125 μl 20 mg/ml poly A oraz 1 g siarczanu dekstranu sodu. Dodać wodę traktowaną DEPC, aby uzyskać objętość całkowitą 10 ml. Intensywnie wstrząsnąć, a następnie inkubować w 55 °C aż do całkowitego rozpuszczenia siarczanu dekstranu sodu. Przechowywać bufor do hybrydyzacji w -20 °C (stabilny przez ok. 6 miesięcy).
  5. 4% buforowany roztwór paraformaldehydu: do kolby przeznaczonej do paraformaldehydu dodać 40 g paraformaldehydu w 760 ml wody destylowanej, podgrzewać do 50 °C na płycie grzejnej przy jednoczesnym mieszaniu. Dodać 320 μl 10N NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie paraformaldehydu. Po rozpuszczeniu (ok. 10 min) dodać 100 ml 10x PBS i uzupełnić objętość wodą destylowaną do 1 litra. Mieszać i podgrzewać roztwór, aż paraformaldehyd się rozpuści. pH powinno wynosić 7,4.
  6. Bufor do acetylacji: 13,6 ml trietanolaminy oraz 2,52 ml bezwodnika octowego w 1 litrze wody destylowanej.
  7. Roztwór 20x SSPE: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O oraz 200 mM EDTA w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 10N NaOH.
  8. Bufor 10x PBS: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 oraz 2,4 g KH2PO4 w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,0 i uzupełnić objętość całkowitą do 1 litra.
  9. Drugi roztwór do przemywania: 0,1% β-merkapto–etanolu i 50% formamidu w 2x SSPE
  10. Roztwór octanu fioletu krezolowego: 3% octanu fioletu krezolowego w wodzie z kranu (woda destylowana uniemożliwia prawidłowe barwienie), rozpuszczony przez noc przy mieszaniu w kolbie w temperaturze pokojowej. Przefiltrować za pomocą ssania próżniowego przez 1-milimetrowy papier filtracyjny Whatman i lejek Büchnera.

Bibliografia

  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363(2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768(2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie ekspresji genówcięcie tkanekanaliza filmu rentgenowskiegopowlekanie emulsjąhybrydyzacja z ryboprobąredukcja tłaobróbka w ciemnidetekcja ziaren srebralokalizacja komórkowa
Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.