Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Podsumowanie

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Streszczenie

Znajomość czasu, poziomu, lokalizacji komórkowej oraz typu komórek, w których ekspresowany jest gen, przyczynia się do zrozumienia jego funkcji. Każdą z tych cech można określić za pomocą hybrydyzacji in situ mRNA wewnątrz komórek. Przedstawiamy tutaj metodę radioaktywnej hybrydyzacji in situ zmodyfikowaną według Clayton et al. (1988)¹, która z powodzeniem funkcjonuje w naszym laboratorium od wielu lat, szczególnie w przypadku mózgów dorosłych kręgowców^2-5. Długie komplementarne sondy RNA (cRNA) do sekwencji docelowej umożliwiają wykrywanie transkryptów o niskiej obfitości^6,7. Włączenie radioaktywnych nukleotydów do sond cRNA pozwala na dalsze zwiększenie czułości wykrywania transkryptów o niskiej obfitości oraz na analizy ilościowe, przeprowadzone za pomocą światłoczułej kliszy rentgenowskiej lub emulsji naniesionej na tkankę. Metody detekcji te zapewniają długoterminowy zapis ekspresji genu docelowego. W porównaniu z metodami z wykorzystaniem sond nieradioaktywnych, takimi jak znakowanie DIG, metoda hybrydyzacji z sondą radioaktywną nie wymaga wielokrotnych etapów amplifikacji z użyciem przeciwciał HRP i/lub zestawu TSA w celu wykrycia transkryptów o niskiej obfitości. W związku z tym metoda ta zapewnia liniową zależność między intensywnością sygnału a ilością docelowego mRNA na potrzeby analizy ilościowej. Pozwala ona na jednoczesne przetwarzanie 100–200 slajdów. Metoda ta sprawdza się również w przypadku różnych stadiów rozwojowych embrionów. Większość badań rozwojowych nad ekspresją genów wykorzystuje całe embriony i podejścia nieradioaktywne^8,9, częściowo dlatego, że tkanka embrionalna jest bardziej delikatna niż tkanka dorosła i wykazuje mniejszą kohezję między komórkami, co utrudnia dostrzeżenie granic między populacjami komórek w przekrojach tkankowych. W przeciwieństwie do tego, nasze podejście radioaktywne, dzięki szerszemu zakresowi czułości, pozwala na uzyskanie wyższego kontrastu w rozdzielczości ekspresji genów między obszarami tkanki, co ułatwia dostrzeżenie granic między populacjami. Stosując tę metodę, badacze mogą ujawnić możliwe znaczenie nowo zidentyfikowanego genu i dalej przewidzieć funkcję badanego genu.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki

1. Pobrać świeże tkanki. W przypadku embrionów ptaków ostrożnie otworzyć jaja i dwukrotnie oczyścić embrion w naczyniu z 1xPBS. W przypadku mózgów dorosłych osobników szybko wyciąć mózg i delikatnie wypłukać go w 1 x PBS.
2. Zatopić embriony lub dorosły mózg w formie do zatapiania wypełnionej OCT tissue tek, orientując tkankę zgodnie z potrzebami sekcjonowania, a następnie szybko zamrozić blok, umieszczając go w mieszaninie etanolu i suchego lodu, uważając, aby mieszanina nie dostała się do wnętrza bloku.
3. Pokroić zamrożoną próbkę w kriosztacie na skrawki o grubości 10-12 μm. Dla tkanek mózgu i embrionalnych optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C.
4. Przenieść zamrożone skrawki na szkiełka Super Plus.
5. Przechowywać skrawki w kasecie na szkiełka w temperaturze -80 °C.

2. Generowanie radioaktywnych ryboprob (Należy stosować procedury bezpieczeństwa radiologicznego obowiązujące w danej instytucji)

1. Przygotuj oczyszczoną liniową matrycę DNA interesującego Cię cDNA, stosując trawienie enzymatyczne fragmentu klonowanego, otoczonego sekwencjami promotora polimerazy RNA w plazmidowym DNA, lub poprzez PCR insertu połączonego z sekwencjami wiążącymi promotora polimerazy RNA. Możliwe jest również otrzymanie fragmentów PCR z promotorami polimerazy RNA jako części starterów PCR 3' i 5'. Oczyszczone w żelu fragmenty po trawieniu lub PCR uzyskaj za pomocą zestawu do oczyszczania z żelu GENECLEAN.
2. Do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml dodaj 0,5-1 μg oczyszczonej liniowej matrycy DNA, bufor do transkrypcji, DTT, RNasin, roztwór mieszaniny nukleotydów AGC oraz wodę wolną od RNaz, aby doprowadzić objętość do pożądanej wartości. Następnie dodaj S³⁵-UTP i odpowiednią polimerazę RNA w celu otrzymania rybosond antysensownych lub sensownych.
3. Inkubuj mieszaninę przez 1 hr w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj kolejną porcję polimerazy RNA i inkubuj przez następną 1 hr.
4. Do probówki Eppendorf dodaj 3M roztwór octanu sodu (0,1 objętości całkowitej) i 100% EtOH (2,5 objętości całkowitej), aby wytrącić zsyntetyzowaną rybosondę RNA.
5. Inkubuj w suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C przez 15 min lub powyżej 3 godzin, aby wspomóc wytrącanie.
6. Zwiruj RNA w wirówce stołowej Eppendorf przy 4 °C i 15,000 rpm przez 30 min w celu uzyskania osadu.
7. Odlej nadsącz i przemyj osad 70% EtOH, delikatnie opukując probówkę palcem, aby dobrze wymieszać osad.
8. Ponownie zwiruj RNA przy 4 °C i 15000 rpm przez 30 min.
9. Całkowicie usuń nadsącz za pomocą pipety, a następnie dodaj 40 μl roztworu hybrydyzacyjnego. Wymieszaj dokładnie poprzez wielokrotne pipetowanie.
10. Przenieś 1 μl roztworu do 3 ml roztworu Safety-Solve w fiolce scyntylacyjnej, wymieszaj dokładnie i zmierz liczbę impulsów w liczniku scyntylacyjnym.
11. Przechowuj probówkę Eppendorf z rybosondą w temperaturze -20 °C; należy jej użyć w ciągu jednego tygodnia.

3. Obróbka tkanki

1. W dygestorium przygotować świeży 4% roztwór paraformaldehydu w buforze PBS, podgrzany do temperatury o około 3-5 °C wyższej od temperatury pokojowej. Przenieść preparaty ze stanu przechowywania w -80 °C w metalowej kasetce na suchym lodzie do miejsca pracy pod dygestorium, a następnie umieścić kasetkę w 4% roztworze paraformaldehydu i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Przemyć 3 razy w 1 x PBS, zanurzając preparaty około 15 razy w każdym cyklu (około 1 sekundy na jedno zanurzenie).
3. W dygestorium przygotować bufor do acetylacji i energicznie wstrząśnąć go w ciągu 10 sekund. Natychmiast wlać bufor do kuwety z kasetką preparatów i inkubować przez 10 min w celu zredukowania niespecyficznego wiązania sondy rybowej.
4. Przepłukać 3 razy w 2 x SSPE przez 15 zanurzeń.
5. Odwodnić w serii roztworów EtOH 70%, 95% i 100% przez 2 min w każdym kroku (etap ten nie musi być wykonywany w dygestorium).
6. Osuszyć preparaty pod dygestorium przez co najmniej 10-15 min.

4. Hybrydyzacja

1. Oblicz ilość sondy rybosomowej (0,5–1 x 10⁶ cpm na slajd) oraz roztwór hybrydyzacyjny (100 μl na slajd) niezbędne dla wszystkich slajdów. Podgrzej mieszaninę sondy rybonukleotydowej i roztworu hybrydyzacyjnego do 65 °C przez 5 min w celu denaturacji sondy.
2. Nanieść pipetą 100 μl roztworu do hybrydyzacji sondy rybonukleinowej w linii wzdłuż szkiełka, a następnie za pomocą szkiełka nakrywki rozprowadzić go równomiernie po tkance i szkiełku nakrywce. Umieścić szkiełka poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a następnie powoli wprowadzić statyw pionowo do kąpieli olejowej o temperaturze 65 °C na minimum 4 h i maksymalnie 16 h. Olej tworzy szczelną barierę wokół szkiełek nakrywczych.
3. Wyjąć metalowe statywy z kąpieli olejowej i za pomocą ręcznika papierowego wytrzeć nadmiar oleju wokół statywu.
4. Zmyć olej z przykrytych szkiełek i metalowego statywu w kuwetach szklanych lub metalowych zawierających chloroform, powtarzając tę czynność dwukrotnie. 2^nd Przemycie chloroformem można wykorzystać jako etap pierwszy w kolejnym eksperymencie.
5. Przenieś kasetkę z zakrytymi szkiełkami do kuwety z roztworem 0,1% β-merkaptoetanolu + 2x SSPE i zanurzaj ją kilkukrotnie w górę i w dół, aby poluzować szkiełka nakładkowe i usunąć nadmiar roztworu do hybrydyzacji.
6. Przenieść kasetę z przykrytymi szkiełkami do świeżego roztworu 0,1% $\beta$-merkaptoetanolu + 2 x SSPE, a następnie zdjąć szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety wolnej od RNaz bezpośrednio w roztworze, aby zapobiec porysowaniu przekrojów tkankowych. Przenieść odsłonięte szkiełka do nowej kasety w poziomym uchwycie do kaset w kuwecie, do roztworu 0,1% $\beta$-merkaptoetanolu w 2 x SSPE.
7. Inkubować statyw z szkiełkami w świeżym roztworze 0,1% β-merkaptoetanolu + 2 x SSPE w temperaturze pokojowej przez 1 h w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanego sondy RNA. Roztwór ten oraz poprzednie wodne roztwory płuczące, jak i szkiełka nakrywkowe, należy zutylizować jako odpady promieniotwórcze.
8. Przenieś kasetkę z preparatami do uprzednio podgrzanego do 65 °C roztworu 2x SSPE, dodaj $\beta$-merkaptoetanol do stężenia końcowego 0,1% i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Utylizuj jako odpady radioaktywne.
9. Przenieść kasetę z preparatami i inkubować dwukrotnie w uprzednio ogrzanym roztworze 0,1 x SPPE w temperaturze 65 °C przez 30 min każdego z etapów. Ilość usuniętej w tym kroku radioaktywności jest bardzo mała i po tym etapie nie jest już uznawana za nadmierne odpady radioaktywne.
10. Odwodnij statyw i slajdy w 70%, 95% i 100% EtOH przez 2 min each.
11. Suszyć preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 min.

5. Wizualizacja sygnału promieniotwórczego

1. Umieść suche preparaty w kasecie do filmów, a następnie w ciemni połóż film rentgenowski (film Kodak BioMax MR) nad preparatami i zamknij kasetę. Upewnij się, że preparaty przylegają do strony emulsyjnej filmu rentgenowskiego. Naświetlaj preparaty przez ok. 1-7 dni, w zależności od oczekiwanej liczności transkryptów.
2. Wywołaj film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji pojawia się na filmie jako kolor czarny (naświetlone ziarna srebra w emulsji) (Rys. 1).
3. 1. (Opcjonalnie) Aby określić rozdzielczość komórkową i zobaczyć sygnał na tkance, preparaty należy zanurzyć w emulsji fotograficznej i poddać barwieniu kontrastowemu. Jeśli planowane jest późniejsze barwienie fioletem krezylowym, przeprowadź delipidację sekcji poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie rehydratuj przez 1 min w kolejno: 100%, 100%, 95%, 95%, 70% i 50% EtOH, a następnie w wodzie dejonizowanej. Jeśli nie planujesz barwienia barwnikiem wymagającym delipidacji, proces ten nie jest konieczny. Dobrze wysusz preparaty pod wyciągiem przez co najmniej 2-3 godziny.
   2. W ciemni, przy użyciu bezpiecznego światła, nabierz tyle emulsji Kodak NTB, aby pokryła wzdłuż połowę preparatu (tj. tkankę) w szklanym naczyniu do zanurzania, a następnie rozpuść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20-30 min. Następnie rozcieńcz ją wodą destylowaną w stosunku 1:1. Poziom emulsji powinien teraz pokrywać wszystkie sekcje na preparacie podczas jego zanurzania. W przypadku dużej liczby preparatów może być konieczne przygotowanie dodatkowej emulsji.
4. Zanurz preparaty w rozcieńczonej emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C i wysusz zanurzone preparaty w zamkniętym, światłoszczelnym pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny przy wyłączonym świetle.
5. Przenieś preparaty do slotów w statywach w czarnych pudełkach zawierających desykatory, uważając, aby preparaty nie dotykały się, co mogłoby spowodować powstanie artefaktów. Powoli zaklej krawędzie pudełek czarną taśmą izolacyjną, aby zapobiec powstawaniu iskier wywołanych elektrycznością statyczną, a następnie owiń pudełka folią aluminiową. Przechowuj pudełka w temperaturze 4 °C od kilku dni do kilku tygodni (sygnał po 1 dniu na filmie rentgenowskim jest podobny do sygnału po 5 dniach w emulsji).
6. Kondycjonuj pudełka z preparatami w temperaturze pokojowej przez 1 h.
7. W ciemni wyjmij statyw z preparatami z pudełek (lub umieść preparaty w metalowym statywie, jeśli używasz pudełek ze slotami na preparaty) i wywołaj je w wywoływaczu Kodak D-19 w temperaturze 16 °C przez 3,5 min.
8. Przepłucz wywołane preparaty w wodzie z kranu w temperaturze pokojowej przez 1 min.
9. Inkubuj preparaty dwukrotnie w utrwalaczu w temperaturze 19 °C po 6 min. Podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło.
10. Przepłucz preparaty w bieżącej wodzie w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min i zeskrob emulsję z tylnej strony preparatu, gdy jest jeszcze „mokry”, używając żyletki, aby uniknąć porysowania szkła.
11. Zabarw tkankę 0,3% fioletem krezylowym w wodzie z kranu przez 5 min.
12. Wypłucz nadmiar roztworu fioletu krezylowego w świeżej wodzie z kranu, wykonując ok. 15 zanurzeń.
13. Odwodnij preparaty, wykonując ok. 15 zanurzeń w każdym z kolejnych roztworów alkoholu: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% i 100% EtOH.
14. Inkubuj preparaty w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej dwukrotnie.
15. Przykryj preparaty szkiełkami przy użyciu medium Permount i susz tak przygotowane preparaty pod wyciągiem przez noc (>16 hr); potrzeba kilku dni, aż klej będzie wystarczająco trwały, aby można było dalej czyścić preparaty.

6. Generowanie kolorowych obrazów w ciemnym polu

1. W razie potrzeby należy dodatkowo usunąć nadmiar emulsji z tyłu szkiełek (strony bez szkiełka nakrywkowego, pozbawionej tkanki), zwilżając ją wodą i zeskrobując żyletką.
2. Wypłucz szkiełka w 80% roztworze EtOH i przetrzyj delikatnie 1-2 razy, aby pozbyć się zanieczyszczeń i kurzu.
3. Wykonaj zdjęcia przy użyciu oświetlenia w ciemnym lub jasnym polu. Kroki 6.2 i 6.3 mogą wymagać 2-3 powtórzeń w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereoskopowym.

7. Reprezentatywne wyniki

Istnieją dwa główne sposoby obrazowania wyników hybrydyzacji in situ na skrawkach tkanek hybrydyzowanych z radioaktywnymi sondami S³⁵: 1) przy użyciu filmu rentgenowskiego umieszczonego na szkiełkach lub 2) przy użyciu emulsji naniesionej na szkiełka. Trzecim podejściem jest zastosowanie ekranu fosforowego (phosphorimager) umieszczonego na szkiełkach, jednak rozdzielczość tej metody okazała się dla nas niesatysfakcjonująca. Filmy rentgenowskie zapewniają szybki wynik oraz pozwalają na analizę ogólnego przebiegu hybrydyzacji. Dane z filmów rentgenowskich ujawniają również szeroką rozdzielczość anatomiczną i mogą być wykorzystywane do analizy ilościowej¹⁰. Przykłady obrazów z filmów rentgenowskich głowy późnego embrionu ptaka, hybrydyzowanych z sondami antysensownymi dla ekspresji genów FoxP1 i CoupTF2, przedstawiono na Ryc. 1A i B. Oba geny występują w dużym stężeniu w specyficznych podregionach mózgu. Wynik na filmie rentgenowskim dobrej jakości powinien być ostry (nie rozmyty) i charakteryzować się wysokim stosunkiem sygnału do tła. Rozmyty obraz może wynikać z nierównego kontaktu filmu rentgenowskiego ze szkiełkiem z hybrydyzowaną tkanką.

W przypadku szkiełek zanurzonych w emulsji, emulsja zawiera światłoczułe sole srebra naniesione bezpośrednio na tkankę, w przeciwieństwie do filmu rentgenowskiego, gdzie znajdują się one na podłożu plastikowym. Podczas wywoływania sole srebra naświetlone S³⁵ są przekształcane w ziarna srebra metalicznego, podobnie jak w filmie rentgenowskim. Jednak osady srebra są bezpośrednio widoczne nad komórkami, reprezentując ekspresję genów, którą można obserwować i mierzyć jakościowo pod mikroskopem. Ziarna srebra metalicznego blokują bezpośrednie przejście światła i jawią się jako czarne kropki w obrazowaniu w polu jasnym. Kontrastowe barwienie fioletem krezylowym ma kolor purpurowy (Ryc. 3A, 3C oraz Ryc. 4). W polu ciemnym ziarna srebra odbijają światło padające z boku i pojawiają się jako białe kropki (Ryc. 1C, 1D, 3B i 3D). W tej konfiguracji barwienie fioletem krezylowym ma kolor czerwony. W polu jasnym sygnał hybrydyzacji jest łatwiejszy do obserwacji przy dużym powiększeniu z rozdzielczością komórkową, natomiast w polu ciemnym sygnał hybrydyzacji można dodatkowo oglądać przy mniejszym powiększeniu w obrębie całej tkanki. Obrazowanie w polu ciemnym jest metodą, której powszechnie używamy do pokazania ogólnego wzorca ekspresji genów. Jednak w porównaniu do szybkich wyników uzyskiwanych z filmów rentgenowskich, przygotowanie szkiełek zanurzonych w emulsji zajmuje więcej czasu (od jednego do kilku tygodni) i jest bardziej podatne na powstawanie tła.

Istnieją cztery częste przyczyny silnego tła: 1) tło na całej kliszy rentgenowskiej zwykle wynika z problemów z wywoływaczem lub utrwalaczem bądź z częściowego naświetlenia kliszy; 2) tło na szkiełkach przedmiotowych zazwyczaj wynika z problemów z myciem lub przygotowaniem szkiełek, takich jak niewłaściwa silanizacja szkiełek pochodzących z zewnętrznego źródła lub przygotowanych samodzielnie; 3) tło wynikające z naświetlania i wywoływania emulsji; oraz 4) tło na preparacie wynikające albo z braku staranności w etapach mycia po hybrydyzacji, zbyt niskiej temperatury hybrydyzacji, niskiej jakości roztworu do hybrydyzacji, zanieczyszczenia naczyń do mycia paraformaldehydem powodującego trwałe sieciowanie sond z tkanką, degradacji ribosond prowadzącej do niespecyficznego znakowania tkanki przez małe cząsteczki, nieaktywnego DTT lub β-merkaptoetanolu skutkującego sieciowaniem sond S³⁵-RNA z tkanką poprzez wiązania dwusiarczkowe, lub zbyt długiego oczekiwania na acetylację. Kluczowe jest umieszczenie szkiełek w roztworze do acetylacji w ciągu kilku sekund od zmieszania bezwodnika octowego i trietanolaminy. Jeśli od zmieszania do dodania roztworu na szkiełka minie kilka minut, grupy acylowe nie zostaną efektywnie usunięte i będą wiązać się niespecyficznie z RNA. Inne czynniki to hybrydyzacja trwająca ponad 20 hr, co może generować zbyt silny sygnał, oraz nadmiar kropel oleju na szkiełkach, które zatrzymują roztwór do hybrydyzacji podczas myć wodnych, co skutkuje powstawaniem radioaktywnych plamek na tkance i szkiełkach, dając ciemne sygnały tła. W przypadku pracy z dużą liczbą szkiełek (więcej niż 100 skrawków), należy dodać 3^rd mycie chloroformem lub wymienić roztwory chloroformu, aby zapobiec pozostawaniu nadmiaru cząsteczek oleju na szkiełkach. Niestaranne traktowanie tkanki, np. zbyt wolne zamrażanie (powyżej 5-10 min po sekcji) lub rozmrażanie i ponowne zamrażanie, również zwiększa tło z powodu degradacji mRNA. Należy uważać, aby nie pomylić tła z prześwietleniem.

Wystąpienie tła emulsji na zanurzonych preparatach jest możliwe, ponieważ jest ona bardzo światłoczuła i wymaga długiego naświetlania w ciemności. Typowe problemy z tłem obejmują zbyt wysoką temperaturę wywoływacza i utrwalacza. Gdy temperatura przekracza 19 °C, zbliżając się do temperatury pokojowej lub przewyższając ją, uzyskuje się intensywniejsze tło z ziarna srebra. Ekspozycja na niskie natężenie światła przenikającego do ciemni spowoduje powstanie tła emulsji. Niedostateczne wypłukanie utrwalacza (przez co najmniej 30 min w bieżącej wodzie) spowoduje pozostanie utrwalacza, który następnie w reakcji z fioletem krezylowym generuje brązowy osad w całej emulsji. Jednakże, jeśli preparaty będą płukane w wodzie przez ponad 90 min po utrwalaniu, a przed barwieniem fioletem krezylowym, może to doprowadzić do poluzowania się emulsji i słabego barwienia przekrojów. Jeśli nie ma możliwości zabarwienia preparatów w oknie czasowym 30–90 min po utrwalaniu i płukaniu, należy po 30 min płukania wysuszyć preparaty przez noc i przystąpić do barwienia fioletem krezylowym następnego dnia. Zazwyczaj większość mRNA wykazuje specyficzne wzorce ekspresji genów, podczas gdy sygnał tła jest bardziej jednorodny.

Złożona tkanka może prowadzić do błędnych wyników ekspresji genów na kliszy rentgenowskiej, powodując powstanie obszaru o ciemniejszym sygnale. Aby określić, czy tkanka jest złożona, należy zbadać niebarwione skrawki w ciemnym polu lub skrawki barwione fioletem krezylowym w jasnym polu. Kontrastowanie fioletem krezylowym stanowi lepszą metodę oceny stanu tkanki.

W celu lepszej interpretacji swoistości sond, kontrolne sondy sensowne należy zastosować na kilku sąsiednich skrawkach. Większość sond sensownych nie wykazuje sygnału, jednak niektóre go wykazują, a w takich przypadkach często różni się on od sygnału antysensownego. Przypuszczamy, że może to być związane z syntezą antysensowną lub innym genem znajdującym się na nici antysensownej genomu. Przedstawiamy przykład sond sensownych i antysensownych dla Pax6 (Ryc. 2A i B). Nić antysensowna wykazuje znakowanie wzdłuż strefy komorowej przedmózgowia, móżdżku i oka, zgodnie z oczekiwaniami (Ryc. 2A), natomiast sonda sensowna wykazuje znakowanie w warstwie barwnikowej siatkówki (Ryc. 2B).

W odniesieniu do wielkości sond, stosujemy sondy cDNA o długości od 300 do 5000 bps. Sondy krótsze niż 300 bps działają, jednak sygnały są zazwyczaj słabsze. Nie testowaliśmy sond dłuższych niż 5000 bps. Najlepiej jest stosować sondy na tkankach pochodzących od tego samego gatunku, jeśli jest to możliwe. W przeciwnym razie przeprowadzamy hybrydyzację krzyżową sond na skrawkach innych gatunków i obniżamy temperatury hybrydyzacji oraz przemywania w krokach 3-5 °C w zależności od tożsamości sekwencji, jeśli jest ona znana. Jeśli nie jest znana, dobieramy temperatury hybrydyzacji i przemywania metodą prób i błędów. Jeśli temperatura zostanie obniżona zbyt mocno, sonda cDNA może ulec hybrydyzacji krzyżowej z innymi mRNA o podobnych sekwencjach między gatunkami lub w obrębie tego samego gatunku¹¹. W praktyce stwierdziliśmy, że w przypadku cDNA, które wykazują tożsamość na poziomie ~95% lub wyższym z docelowym mRNA w tkance, rygorystyczne warunki temperatury hybrydyzacji i przemywania (65 °C) sprawdzają się dobrze. Dla sekwencji o tożsamości w zakresie od ~85 do 94%, temperatura hybrydyzacji i przemywania może wymagać obniżenia do zakresu od ~50 do 60 °C.

Powodem stosowania metalowego statywu w większości etapów jest wykorzystanie przemywań chloroformem i ksylenem. Oba te związki organiczne rozpuszczają wiele rodzajów tworzyw sztucznych. Szkło i niektóre rodzaje tworzyw są odporne na te substancje organiczne, jednak szkło łatwiej stłuc, a niektóre tworzywa, które początkowo są odporne, mogą ulec rozpuszczeniu przy długotrwałej ekspozycji na te związki.

Rysunek 1. Autoradiografia obrazów hybrydyzacji in situ z filmów rentgenowskich i szkiełek zanurzonych w emulsji. (A-B) Obrazy z filmu rentgenowskiego strzałkowych przekrojów całej głowy kanarka zebra w 10. dniu embrionalnym, zhybrydyzowanych z antysensownymi ryboprobes przeciwko (A) FoxP1 lub (B) CoupTF2, wykonane w oświetleniu w polu jasnym pod mikroskopem stereoskopowym. Czarne, naświetlone ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA. Pasek skali = 500 μm. (C-D) Obrazy ze szkiełek zanurzonych w emulsji strzałkowych przekrojów całej głowy kanarka zebra w 6. dniu po wykluciu, zhybrydyzowanych z antysensownymi ryboprobes przeciwko (C) FoxP1 i (D) CoupTF2, wykonane w oświetleniu w polu ciemnym pod mikroskopem stereoskopowym. Białe, naświetlone ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Czerwony, barwienie fioletem krezylowym. Pasek skali = 200 μm. Na wszystkich zdjęciach dziób znajduje się po lewej stronie (rostralnie). Filmy rentgenowskie były naświetlane przez jeden dzień, a szkiełka zanurzone w emulsji przez 3 dni. Sonda FoxP1 ma 178 bps i odpowiada części mRNA od 1544-1711 bp; sonda CoupTF2 ma 545 bps i odpowiada części mRNA od 1-545 bp. Jak widać, w przedmózgowiu mRNA FoxP1 jest wzbogacone w mesopallium (M), striatum (St) i grzbietową część wzgórza (DT), podczas gdy CoupTF2 jest wzbogacone w nidopallium (N), arcopallium (A) i bardziej brzusznych częściach wzgórza. Ekspresja jest spójna pomiędzy typami naświetlania (i wiekiem). Jednak w przypadku szkiełek zanurzonych w emulsji obserwuje się wyższą rozdzielczość znakowania, a granice i podziały tkanek są identyfikowane bezpośrednio. Te oraz wszystkie pozostałe obrazy przedstawione w pracy pochodzą z przekrojów z zastosowaniem standardowej hybrydyzacji o wysokiej rygorystyczności w 65 °C.

Rysunek 2. Porównanie znakowania antysensownego i sensownego wykazujące różne wzorce. (A) Nić antysensowna Pax6 była wyrażana w mózgu, zwłaszcza w strefie komorowej (biała strzałka). Przedstawiono autoradiografię na kliszach rentgenowskich w sagiatalnych przekrojach całej głowy pobranych od kanarka w 12. dniu embrionalnym. (B) Sąsiedni przekrój zhybrydyzowany z nicią sensowną Pax6 nie wykazuje ekspresji tła w całej głowie embrionu, jednak widoczna jest ekspresja w warstwie pigmentowej siatkówki (czarne strzałki), podobnie jak w przypadku nici antysensownej. Linia przerywana oznacza obrys całego mózgu. C: Móżdżek.

Rysunek 3. Sygnały ekspresji genów in situ na preparatach zanurzonych w emulsji, pobranych z mózgu kanarka w późnych stadiach embrionalnych, w obrazowaniu w polu jasnym i ciemnym. (A) Obraz w polu jasnym ekspresji D1B w 10. dniu embrionalnym po standardowej ekspozycji na emulsję. Etykieta (czarna) jest ledwo widoczna przy tym powiększeniu. Sonda ma długość 625 bp i jest skierowana przeciwko fragmentowi mRNA od 1 do 625 bp. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A), ale w obrazowaniu w polu ciemnym, wykazujące etykietę (białą) w prążkowiu (St) i wzgórzu (TH). (C) Obraz w polu jasnym ekspresji Slit3 w 12. dniu embrionalnym po nadmiernej ekspozycji na emulsję. Etykieta (czarna) jest wyraźnie widoczna. Sonda ma długość 779 bp i jest skierowana przeciwko fragmentowi mRNA od 1243 do 2021 bp. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A), w obrazowaniu w polu ciemnym, wykazujące etykietę (białą) w rdzeniu kręgowym (SC), co odpowiada obrazowi w polu jasnym. Kierunek rostralny jest skierowany w lewo. Cb: móżdżek.

Rycina 4. Rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym. Przedstawiono znakowanie mRNA FoxP1 w przedmózgowiu kanarka zebrowego z ziarnami srebra (czarne kropki) nad komórkami (fiolet krezylowy) w różnych regionach mózgu i w różnym wieku, w porównaniu z obrazami przy mniejszym powiększeniu z Ryciny 1A i 1C. (A) Wysoka ekspresja nad poszczególnymi komórkami (czarne strzałki) w mesopallium dorosłego kanarka zebrowego. (B) Niska ekspresja nad poszczególnymi komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiadującym nidopallium tego samego przekroju. (C) Wysoka ekspresja mRNA FoxP1 nad komórkami (czarne strzałki) w mesopallium w 12. dniu rozwoju embrionalnego. (D) Niska ekspresja nad komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiadującym nidopallium tego samego przekroju. Przykładowe komórki obwiedziono żółtą linią. Komórki embrionalne (C i D) są mniejsze i gęściej upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi (A i B). Ponieważ między komórkami a emulsją występuje pewna przerwa, obszar odsłoniętych ziaren srebra z sondy S³⁵ jest nieco większy niż obszar ciał komórkowych. Pasek skali = 10 μm.

Dyskusja

Radioaktywna hybrydyzacja in situ ekspresji mRNA jest szeroko stosowana w wielu celach, w tym do badania regionalnej organizacji tkanek, typów komórek oraz funkcjonalnej aktywności mózgu^2-5,10,12-14. To ostatnie zastosowanie dotyczy genów, których ekspresja mRNA w mózgu jest zależna od zwiększonej aktywności neuronalnej, często nazywanych genami zależnymi od aktywności lub genami wczesnymi (immediate early genes). Przy takich zastosowaniach nasza metoda była stosowana u wielu gatunków, w tym u ptaków, ssaków (np. człowieka), ryb i płazów; w wielu tkankach, w tym w mózgu, skórze i mięśniach; oraz w różnym wieku, w tym u piskląt/noworodków, osobników młodocianych, dorosłych, a tutaj w przekrojach całych embrionów^2,3,5,15-17. Cechy szczególne naszego protokołu obejmują: (1) zapewnia on równowagę między specyficznością anatomiczną a specyficznością ilościową. Aby określić ilość ekspresji genu na kliszy rentgenowskiej, wykonujemy cyfrowe zdjęcia obrazów (np. Rys. 1A i 1B), używamy funkcji histogramu programu Photoshop (Adobe) do pomiaru gęstości pikseli w obszarach zainteresowania i odejmujemy poziomy tła na kliszy poza tkanką, ale wciąż na szkiełku podstawowym^2,4. Aby określić ilość ekspresji na poziomie komórkowym, wykonujemy zdjęcia ziaren srebra nad komórkami przy dużym powiększeniu (40-100X; Rys. 4). Następnie używamy funkcji threshold i measure programu Image J opracowanego przez Wayne'a Rasbanda w NIH, aby policzyć liczbę ziaren srebra na obrazie, odejmujemy liczbę ziaren tła w podobnym obszarze bez komórek na szkiełku podstawowym, a następnie dzielimy przez liczbę komórek, aby uzyskać wartości ekspresji na komórkę^4,18. (2) Może charakteryzować się stosunkowo wysoką przepustowością, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie 100-200 szkiełeczek dzięki szczelnemu zamknięciu szkiełek przykrywek za pomocą kąpieli w oleju mineralnym. Standardowe metody hybrydyzacji in situ wymagają więcej czasu na uszczelnienie szkiełeczek za pomocą parafilmu, lakieru do paznokci i innych środków, co powoduje, że szkiełka zajmują dużo miejsca; (3) jest bardzo czuła w przypadku transkryptów o niskiej liczebności dzięki zastosowaniu siarczanu dekstranu i roztworu Denhardta w buforze hybrydyzacyjnym^2,13; (4) podejście obrazowe w ciemnym polu daje obrazy o wysokim kontraście dzięki wykonywaniu zdjęć w oświetleniu ciemnego pola na mikroskopie stereoskopowym^4,5. Ponadto pozwala na czułą detekcję niewielkich zmian w ekspresji genów, takich jak ekspresja genów zależnych od aktywności, w celu zidentyfikowania konkretnych obszarów mózgu aktywowanych podczas percepcji i realizacji określonych zachowań¹⁹. Ograniczeniami w porównaniu z protokołami nieradioaktywnymi są fakt, że te ostatnie oferują wyraźniejszą rozdzielczość komórkową i dokładniejszą lokalizację mRNA wewnątrz komórki, a praca z emulsją jest bardzo wrażliwa na manipulację i światło. Naszą metodę można łączyć z innymi metodami, takimi jak nieradioaktywna hybrydyzacja in situ, aby znakować ekspresję mRNA więcej niż jednego genu w tej samej tkance^10,17,20. Może być ona łączona z immunocytochemią w celu znakowania ekspresji zarówno RNA, jak i białka w tej samej próbce, aby współlokalizować mRNA z określonymi typami komórek¹⁰. Modyfikacje protokołu niezbędne dla takich eksperymentów z podwójnym znakowaniem zostały opisane w cytowanych referencjach.

Podsumowując, nasze podejście ułatwia zrozumienie czasu i lokalizacji komórkowej ekspresji genów w celu poznania organizacji regionów, aktywności funkcjonalnej tkanek oraz funkcji genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezwodnik octowy	VWR	MK242002
Chloroform	VWR	BDH1109
Octan fioletu krezolowego	Sigma	C5042
Kriostat	Thermo scientific	Microm HM550
Dejonizowany formamid	Sigma	F9037
DTT	Promega	P1171	100mM
EDTA	Sigma	ED
Forma do zatapiania	VWR	15160-215
Szkiełka Superfrost plus marki Fisher	Fisher Scientific	22-034-979
Formaldehyd	VWR	BDH0506-4LP
Formamid	Sigma	F7508
Zestaw GENECLEAN	Q-Bio gene	1001-200
Film Kodak BioMax MR	Sigma	Z350370
Emulsja Kodak NTB	Carestream Health	8895666
Wywoływacz Kodak Professional D19	Kodak	1462593
Utrwalacz Kodak Professional	Kodak	1971746
β-merkapto–etanol	Calbiochem	444203
Olej mineralny	VWR	IC15169491
NaOH	VWR	SX0600-1
Paraformaldehyd	Sigma	76240
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
rATP	Promega	P1132	10mM
rCTP	Promega	P1142	10mM
rGTP	Promega	P1152	10mM
RNasin	Promega	N2111	40Units/μl
S35 UTP	PerkinElmer	NEG039C001MC
Roztwór Safety-Solve	Safety Solve Research Products International	111177
Octan sodu	Sigma	S7899	3M
Fosforan sodu zasadowy	Sigma	S3264
Fosforan sodu kwaśny	Sigma	S3139
Polimeraza RNA SP6	Promega	P1085
Metalowy statyw do barwienia	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Polimeraza RNA T7	Promega	P2075
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
5x bufor do transkrypcji	Promega	P1181
Trietanolamina	VWR	IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	VWR	101449-446
tRNA	Roche	10109509001
Roztwory:
Odczynniki do otrzymywania ribosond: 1,5 μl matrycy DNA (0,2-0,3 μg/μl), 2 μl 5x zoptymalizowanego buforu do transkrypcji, 1 μl 100mM DTT (dołączony do polimerazy z firmy Promega, dokładnie wymieszać w temperaturze pokojowej), 0,3 μl RNasinu (40 jednostek/μl), 1,5 μl roztworu mieszanki rybonukleotydów AGC, 3,5 μl S35 UTP oraz 1 μl polimerazy RNA. Uzupełnić do 10 μl wodą wolną od nukleaz. Roztwór mieszanki rybonukleotydów AGC: zmieszać równe ilości 10mM ATP, GTP i CTP. Roztwór octanu sodu do wytrącania EtOH w celu usunięcia wolnego S35 UTP: 40 μl wody wolnej od RNazy i DNazy, 5 μl 3M octanu sodu oraz 125 μl 100% EtOH. Bufor do hybrydyzacji (stok 10 ml): 5 ml 100% dejonizowanego formamidu, 600 μl 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8,0), 240 μl 0,5M EDTA (pH = 8,0), 100 μl 100x roztworu Denharta, 100 μl 1M DTT, 250 μl 20 mg/ml tRNA, 125 μl 20 mg/ml poly A oraz 1 g siarczanu dekstranu sodu. Dodać wodę traktowaną DEPC, aby uzyskać objętość całkowitą 10 ml. Intensywnie wstrząsnąć, a następnie inkubować w 55 °C aż do całkowitego rozpuszczenia siarczanu dekstranu sodu. Przechowywać bufor do hybrydyzacji w -20 °C (stabilny przez ok. 6 miesięcy). 4% buforowany roztwór paraformaldehydu: do kolby przeznaczonej do paraformaldehydu dodać 40 g paraformaldehydu w 760 ml wody destylowanej, podgrzewać do 50 °C na płycie grzejnej przy jednoczesnym mieszaniu. Dodać 320 μl 10N NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie paraformaldehydu. Po rozpuszczeniu (ok. 10 min) dodać 100 ml 10x PBS i uzupełnić objętość wodą destylowaną do 1 litra. Mieszać i podgrzewać roztwór, aż paraformaldehyd się rozpuści. pH powinno wynosić 7,4. Bufor do acetylacji: 13,6 ml trietanolaminy oraz 2,52 ml bezwodnika octowego w 1 litrze wody destylowanej. Roztwór 20x SSPE: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O oraz 200 mM EDTA w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 10N NaOH. Bufor 10x PBS: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 oraz 2,4 g KH2PO4 w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,0 i uzupełnić objętość całkowitą do 1 litra. Drugi roztwór do przemywania: 0,1% β-merkapto–etanolu i 50% formamidu w 2x SSPE Roztwór octanu fioletu krezolowego: 3% octanu fioletu krezolowego w wodzie z kranu (woda destylowana uniemożliwia prawidłowe barwienie), rozpuszczony przez noc przy mieszaniu w kolbie w temperaturze pokojowej. Przefiltrować za pomocą ssania próżniowego przez 1-milimetrowy papier filtracyjny Whatman i lejek Büchnera.