Artykuł metodologiczny

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

DOI:

10.3791/3764

⸱

27 kwietnia 2012

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University , 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znajomość czasu, poziomu, lokalizacji komórkowej oraz typu komórek, w których ekspresowany jest gen, przyczynia się do zrozumienia jego funkcji. Każdą z tych cech można określić za pomocą hybrydyzacji in situ mRNA wewnątrz komórek. Przedstawiamy tutaj metodę radioaktywnej hybrydyzacji in situ zmodyfikowaną według Clayton et al. (1988)1, która z powodzeniem funkcjonuje w naszym laboratorium od wielu lat, szczególnie w przypadku mózgów dorosłych kręgowców2-5. Długie komplementarne sondy RNA (cRNA) do sekwencji docelowej umożliwiają wykrywanie transkryptów o niskiej obfitości6,7. Włączenie radioaktywnych nukleotydów do sond cRNA pozwala na dalsze zwiększenie czułości wykrywania transkryptów o niskiej obfitości oraz na analizy ilościowe, przeprowadzone za pomocą światłoczułej kliszy rentgenowskiej lub emulsji naniesionej na tkankę. Metody detekcji te zapewniają długoterminowy zapis ekspresji genu docelowego. W porównaniu z metodami z wykorzystaniem sond nieradioaktywnych, takimi jak znakowanie DIG, metoda hybrydyzacji z sondą radioaktywną nie wymaga wielokrotnych etapów amplifikacji z użyciem przeciwciał HRP i/lub zestawu TSA w celu wykrycia transkryptów o niskiej obfitości. W związku z tym metoda ta zapewnia liniową zależność między intensywnością sygnału a ilością docelowego mRNA na potrzeby analizy ilościowej. Pozwala ona na jednoczesne przetwarzanie 100–200 slajdów. Metoda ta sprawdza się również w przypadku różnych stadiów rozwojowych embrionów. Większość badań rozwojowych nad ekspresją genów wykorzystuje całe embriony i podejścia nieradioaktywne8,9, częściowo dlatego, że tkanka embrionalna jest bardziej delikatna niż tkanka dorosła i wykazuje mniejszą kohezję między komórkami, co utrudnia dostrzeżenie granic między populacjami komórek w przekrojach tkankowych. W przeciwieństwie do tego, nasze podejście radioaktywne, dzięki szerszemu zakresowi czułości, pozwala na uzyskanie wyższego kontrastu w rozdzielczości ekspresji genów między obszarami tkanki, co ułatwia dostrzeżenie granic między populacjami. Stosując tę metodę, badacze mogą ujawnić możliwe znaczenie nowo zidentyfikowanego genu i dalej przewidzieć funkcję badanego genu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie tkanki

  1. Pobrać świeże tkanki. W przypadku embrionów ptaków ostrożnie otworzyć jaja i dwukrotnie oczyścić embrion w naczyniu z 1xPBS. W przypadku mózgów dorosłych osobników szybko wyciąć mózg i delikatnie przemyć go 1xPBS.
  2. Zatopić embriony lub mózg dorosłego osobnika w formie do zatapiania wypełnionej OCT tissue tek, orientując tkankę zgodnie z potrzebami sekcjonowania, a następnie szybko zamrozić blok, umieszczając go w mieszaninie etanolu i suchego lodu, dbając o to, aby mieszanina nie dostała się do wnętrza bloku.
  3. Pokroić zamrożoną próbkę w kriotomacie na sekcje o grubości 10-12 μm. Dla tkanki mózgowej i embrionalnej optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C.
  4. Nanieść zamrożone sekcje na szkiełka Super Plus.
  5. Przechowywać sekcje w kasecie na szkiełka w temperaturze -80 °C.

2. Generowanie radioaktywnych ryboprobek (Należy stosować procedury bezpieczeństwa radiacyjnego obowiązujące w danej instytucji)

  1. Przygotuj oczyszczony liniowy matrycowy DNA interesującego cDNA, albo poprzez trawienie enzymatyczne fragmentu klonowanego, otoczonego miejscami promotorowymi polimerazy RNA z DNA plazmidowego, albo poprzez PCR insertu przyłączonego do miejsc wiązania promotora polimerazy RNA. Możliwe jest również generowanie fragmentów PCR z promotorami polimerazy RNA jako częścią starterów PCR 3' i 5'. Oczyść fragmenty otrzymane po trawieniu lub PCR za pomocą zestawu do oczyszczania z żelu GENECLEAN.
  2. Do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml dodaj 0,5-1 μg oczyszczonego liniowego matrycowego DNA, bufor do transkrypcji, DTT, RNasin, roztwór mieszaniny nukleotydów AGC oraz wodę wolną od RNaz, aby uzyskać pożądany objętość. Następnie dodaj S35-UTP oraz odpowiednią polimerazę RNA, aby otrzymać rybosondy antysensowne lub sensowne.
  3. Inkubuj mieszaninę przez 1 hr w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj kolejną porcję polimerazy RNA i inkubuj przez kolejną 1 hr.
  4. Do probówki Eppendorf dodaj roztwór octanu sodu 3M (0,1 objętości całkowitej) oraz 100% EtOH (2,5 objętości całkowitej), aby wytrącić syntetyczną rybosondę RNA.
  5. Inkubuj w suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C przez 15 min lub ponad 3 godziny, aby wspomóc wytrącanie.
  6. Osadź RNA, wirując w nasypowej wirówce Eppendorf przez 30 min w temperaturze 4 °C przy 15 000 rpm.
  7. Odbierz nadsącz i przemyj osad 70% EtOH, delikatnie opukując probówkę palcem, aby dobrze wymieszać osad.
  8. Ponownie osadź RNA, wirując przy 4 °C i 15 000 rpm przez 30 min.
  9. Całkowicie usuń nadsącz za pomocą pipety, a następnie dodaj 40 μl roztworu do hybrydyzacji. Wymieszaj dokładnie, pipetując roztwór.
  10. Przenieś 1 μl roztworu do 3 ml roztworu Safety-Solve w fiolce scyntylacyjnej, wymieszaj dokładnie i zmierz liczbę impulsów w liczniku scyntylacyjnym.
  11. Przechowuj probówkę Eppendorf z rybosondą w temperaturze -20 °C; należy ją wykorzystać w ciągu jednego tygodnia.

3. Obróbka tkanek

  1. W dygestorium przygotować świeży 4% roztwór paraformaldehydu w buforze PBS, podgrzany do temperatury o około 3-5 °C wyższej od temperatury pokojowej. Slajdy przechowywane w temperaturze -80 °C umieścić w metalowej kasetce na suchym lodzie, przenieść do miejsca pracy pod wyciągiem, a następnie zanurzyć kasetkę w 4% roztworze paraformaldehydu i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć 3 krotnie w 1 x PBS, wykonując około 15 zanurzeń w każdym cyklu (około 1 sekundy na jedno zanurzenie).
  3. W dygestorium przygotować bufor do acetylacji i energicznie wstrząsać przez 10 sekund. Bezzwłocznie wlać bufor do kuwety z kasetką ze slajdami i inkubować przez 10 min w celu zredukowania niespecyficznego wiązania sondy rybo-.
  4. Przepłukać 3 krotnie w 2 x SSPE, wykonując 15 zanurzeń.
  5. Odwodnić w serii EtOH 70%, 95% i 100%, inkubując przez 2 min na każdym etapie (czynność ta nie musi być wykonywana w dygestorium).
  6. Suszyć slajdy pod wyciągiem przez co najmniej 10-15 min.

4. Hybrydyzacja

  1. Oblicz ilość sondy rybonukleotydowej (0,5-1 x 106 cpm na slajd) oraz roztwór do hybrydyzacji (100 μ(1 ml na slajd) niezbędny dla wszystkich slajdów. Podgrzej mieszaninę do hybrydyzacji z sondą rybo- aż do osiągnięcia temperatury 65 °Inkubować w temperaturze C przez 5 min w celu denaturacji sondy rybowej.
  2. Pipetka 100 μl roztworu do hybrydyzacji z ryboprobnikiem w linii wzdłuż szkiełka, a następnie za pomocą szkiełka zakryjącego rozprowadzić go równomiernie po tkance i szkiełku. Umieścić szkiełka poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a następnie powoli wstawić statywie w pionie do 65 °w kąpieli olejowej przez minimum 4 h i maksimum 16 h. Olej tworzy szczelną powłokę wokół szkiełek nakrywkowych.
  3. Wyjmij metalowe statywy z kąpieli olejowej i wytrzyj nadmiar oleju wokół statywów za pomocą ręcznika papierowego.
  4. Dwukrotnie wypłucz olej z przykrytych szkiełek i metalowego statywu w kuwetach szklanych lub metalowych zawierających chloroform. 2nd płukanie chloroformem można wykorzystać jako pierwszy etap w kolejnym eksperymencie.
  5. Przenieść statyw z przykrytymi szkiełkami do kuwety z 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x roztwór SSPE, a następnie kilkakrotnie zanurzać i wyjmować, aby poluzować szkiełka nakrywowe i usunąć nadmiar roztworu do hybrydyzacji.
  6. Przenieś kasetę z przykrytymi szkiełkami do świeżego roztworu 0,1%. β-merkaptoetanol + 2 x SSPE, a następnie usunąć szkiełka cover slips za pomocą pęsety wolnej od RNaz w roztworze, aby zapobiec porysowaniu przekrojów tkankowych. Przenieść odsłonięte preparaty na szkiełkach do nowej kasetki w poziomym uchwycie do kasetek w roztworze 0,1% β-merkaptoetan w 2 x SSPE.
  7. Inkubować statyw z preparatami w świeżym 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x roztwór SSPE w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby usunąć nadmiar niezwiązanej sondy RNA. Odrzucić ten oraz poprzednie wodne roztwory płuczące, a także szkiełka przykrywowe, jako odpady radioaktywne.
  8. Przenieś kasetę z szkiełkami do uprzednio podgrzanego do 65°C roztworu 2x SSPE. °C, dodać β-merkaptoetan do stężenia końcowego 0,1% i inkubować w temperaturze 65 °Inkubować w temperaturze C przez 1 h. Utylizować jako odpad promieniotwórczy.
  9. Przenieść statyw z szkiełkami i inkubować dwukrotnie w podgrzanym do 65°C roztworze 0,1 x SPPE. °C przez 30 min każdorazowo. Ilość usuniętej na tym etapie radioaktywności jest bardzo mała i po tym kroku nie jest już uznawana za nadmierne odpady radioaktywne.
  10. Odwodnij statyw i szkiełka w 70%, 95% i 100% EtOH przez 2 min każdorazowo.
  11. Suszyć preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 min.

5. Wizualizacja sygnału radioaktywnego

  1. Włożyć suche preparaty do kasety fotograficznej, a następnie w ciemni położyć film rentgenowski (film Kodak BioMax MR) na preparatach i zamknąć kasetę. Należy upewnić się, że preparaty są skierowane stroną emulsji filmu rentgenowskiego. Naświetlać preparaty przez ok. 1-7 dni, w zależności od oczekiwanej liczby transkryptów.
  2. Wywołać film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji przejawia się na filmie jako kolor czarny (naświetlone ziarna srebra w emulsji) (Rys. 1).
    1. (Opcjonalnie) Aby określić rozdzielczość komórkową i zobaczyć sygnał w tkance, preparaty należy zanurzyć w emulsji fotograficznej i poddać barwieniu kontrastowemu. Jeśli planowane jest późniejsze barwienie fioletem krezylowym, należy przeprowadzić delipidację sekcji poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie rehydratować przez 1 min w kolejno: 100%, 100%, 95%, 95%, 70% i 50% EtOH, a na koniec w wodzie dejonizowanej. Jeśli stosowany barwnik nie wymaga delipidacji, etap ten można pominąć. Suszyć preparaty w dygestorium przez co najmniej 2-3 godziny.
    2. W ciemni, przy użyciu bezpiecznego światła, odmierzyć ilość emulsji Kodak NTB wystarczającą do pokrycia połowy długości preparatu (tj. tkanki) w szklanym pojemniku do zanurzania, a następnie rozpuścić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20-30 min. Następnie rozcieńczyć emulsję wodą destylowaną w stosunku 1:1. Poziom emulsji powinien teraz pokrywać wszystkie sekcje na preparacie podczas jego zanurzania. W przypadku dużej liczby preparatów może być konieczne przygotowanie dodatkowej emulsji.
  4. Zanurzyć preparaty w rozcieńczonej emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie suszyć zanurzone preparaty w zamkniętym, szczelnym przed światłem pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny przy wyłączonym świetle.
  5. Przenieść preparaty do slotów w statywach w czarnych pudełkach z desykatorami, uważając, aby preparaty nie dotykały się, co mogłoby spowodować powstanie artefaktów. Krawędzie pudełek powoli uszczelnić czarną taśmą izolacyjną, aby zapobiec powstawaniu iskier wywołanych ładunkami statycznymi, a następnie owinąć pudełka folią aluminiową. Przechowywać pudełka w temperaturze 4 °C od kilku dni do kilku tygodni (sygnał po 1 dniu na filmie rentgenowskim jest zbliżony do sygnału po 5 dniach w emulsji).
  6. Ogrzewać pudełka z preparatami do temperatury pokojowej przez 1 godzinę.
  7. W ciemni wyjąć statyw z preparatami (lub umieścić preparaty w metalowym statywie, jeśli używane są pudełka ze slotami) i wywołać je w wywoływaczu Kodak D-19 w temperaturze 16 °C przez 3,5 min.
  8. Przemyć wywołane preparaty wodą z kranu w temperaturze pokojowej przez 1 min.
  9. Inkubować preparaty dwukrotnie w utrwalaczu w temperaturze 19 °C po 6 min. Podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło.
  10. Przemywać preparaty pod bieżącą wodą w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min i zeskrobać emulsję z tylnej strony preparatu, gdy jest on jeszcze „mokry”, za pomocą żyletki, aby uniknąć porysowania szkła.
  11. Zbarwić tkankę 0,3% fioletem krezylowym w wodzie z kranu przez 5 min.
  12. Wypłukać nadmiar roztworu fioletu krezylowego w świeżej wodzie z kranu, wykonując ok. 15 zanurzeń.
  13. Odwodnić preparaty, wykonując ok. 15 zanurzeń w każdym z roztworów alkoholowych: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% i 100% EtOH.
  14. Inkubować preparaty w ksylenie przez 5 min w temperaturze pokojowej (dwukrotnie).
  15. Nakryć preparaty szkiełkami za pomocą medium Permount i suszyć w dygestorium przez noc (>16 h); zajmie to kilka dni, zanim klej będzie wystarczająco trwały, aby można było dalej czyścić preparaty.

6. Generowanie kolorowych obrazów w ciemnym polu

  1. W razie potrzeby należy dodatkowo usunąć nadmiar emulsji z tyłu szkiełek (strona bez szkiełka nakrywkowego i bez tkanki), zwilżając ją wodą i zeskrobując żyletką.
  2. Płukamy szkiełka 80% roztworem EtOH i delikatnie przecieramy 1-2 razy, aby usunąć zanieczyszczenia i kurz.
  3. Wykonujemy zdjęcia przy oświetleniu w ciemnym polu lub jasnym polu. Kroki 6.2 i 6.3 mogą wymagać 2-3 powtórzeń, aby uzyskać dobre obrazy bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereoskopowym.

7. Reprezentatywne wyniki

Istnieją dwa główne sposoby obrazowania wyników hybrydyzacji in situ na przekrojach tkanek hybrydyzowanych z radioaktywnymi sondami S35: 1) poprzez użycie filmu rentgenowskiego umieszczonego nad szkiełkami lub 2) poprzez nałożenie emulsji bezpośrednio na szkiełka. Trzecim podejściem jest zastosowanie ekranu fosforowego (phosphorimager) umieszczonego nad szkiełkami, jednak rozdzielczość tej metody nie była dla nas satysfakcjonująca. Filmy rentgenowskie zapewniają szybki wynik oraz pozwalają na analizę ogólnego stanu hybrydyzacji. Dane z filmów rentgenowskich ujawniają również szeroką rozdzielczość anatomiczną i mogą być wykorzystane do analizy ilościowej10. Przykłady obrazów z filmu rentgenowskiego głów późnych embrionów ptaków, hybrydyzowanych z sondami antysensownymi dla ekspresji genów FoxP1 i CoupTF2, znajdują się na Rysunkach 1A i B. Oba geny występują w dużym stopniu w określonych podregionach mózgu. Wynik z filmu rentgenowskiego dobrej jakości powinien być ostry (nie rozmyty) i charakteryzować się wysokim stosunkiem sygnału do tła. Rozmyty obraz może wynikać z nierównomiernego styku filmu rentgenowskiego z szkiełkiem zawierającym zhybrydyzowaną tkankę.

W przypadku szkiełek zanurzanych w emulsji, emulsja zawiera światłoczułe sole srebra naniesione na tkankę, w przeciwieństwie do ich obecności na plastiku filmu rentgenowskiego. Podczas wywoływania sole srebra wyeksponowane na S35 są przekształcane w ziarna srebra metalicznego, podobnie jak w filmie rentgenowskim. Jednakże osady srebra są bezpośrednio widoczne nad komórkami, reprezentując ekspresję genów, którą można obserwować i mierzyć jakościowo pod mikroskopem. Ziarna srebra metalicznego blokują bezpośrednie przenikanie światła i pojawiają się jako czarne kropki w widoku w jasnym polu. Kontrastowe barwienie fioletem krezylowym ma kolor purpurowy (Ryc. 3A, 3C oraz Ryc. 4). W ciemnym polu ziarna srebra odbijają światło padające z boku i pojawiają się jako białe kropki (Ryc. 1C, 1D, 3B i 3D). W tej sytuacji barwienie fioletem krezylowym ma kolor czerwony. W jasnym polu sygnał hybrydyzacyjny jest łatwiejszy do obserwacji przy dużym powiększeniu i rozdzielczości komórkowej, natomiast w ciemnym polu sygnał hybrydyzacyjny można dodatkowo oglądać przy mniejszym powiększeniu w obrębie całej tkanki. Widok w ciemnym polu to metoda, której powszechnie używamy do ukazania ogólnego wzorca ekspresji genów. Jednak w porównaniu do szybkich wyników uzyskiwanych z filmów rentgenowskich, przygotowanie szkiełek zanurzanych w emulsji trwa dłużej (od jednego do kilku tygodni) i jest bardziej podatne na powstawanie tła.

Istnieją cztery częste źródła silnego tła: 1) Tło na całej kliszy rentgenowskiej zazwyczaj wynika z problemów z wywoływaczem lub utrwalaczem bądź z częściowego naświetlenia kliszy; 2) Tło na szkiełkach przedmiotowych zazwyczaj wynika z problemów z płukaniem lub przygotowaniem szkiełek, takich jak niewłaściwa sylilacja szkiełek pochodzących z komercyjnego źródła lub przygotowanych samodzielnie; 3) Tło wynikające z naświetlania i wywoływania emulsji; oraz 4) Tło na przekroju wynikające z braku staranności w etapach płukania po hybrydyzacji, zbyt niskiej temperatury hybrydyzacji, niskiej jakości roztworu do hybrydyzacji, zanieczyszczenia naczyń do płukania paraformaldehydem, co powoduje trwałe sieciowanie sond z tkanką, degradacji ribosond prowadzącej do nieswoistego znakowania tkanki przez małe cząsteczki, nieaktywności DTT lub β-merkaptoetanolu, co skutkuje sieciowaniem sond S35-RNA z tkanką poprzez wiązania dwusiarczkowe, oraz zbyt długiego oczekiwania przed acetylacją. Krytyczne jest umieszczenie szkiełek w roztworze do acetylacji w ciągu kilku sekund od zmieszania bezwodnika octowego i trietanolaminy. Jeśli minie kilka minut bez dodania roztworu do szkiełek, grupy acetylowe nie zostaną efektywnie usunięte i będą wiązać się nieswoiście z RNA. Inne czynniki obejmują hybrydyzację trwającą powyżej 20 h, co może generować zbyt silny sygnał, oraz nadmiar kropel oleju na szkiełkach, które zatrzymują roztwór do hybrydyzacji podczas płukania w środowisku wodnym, co prowadzi do powstania radioaktywnych punktów na tkance i szkiełkach, dając ciemne sygnały tła. W przypadku pracy z wieloma szkiełkami (ponad 100 przekrojów), należy dodać 3rd płukanie chloroformem lub zmienić płukania chloroformem, aby zapobiec pozostawaniu nadmiaru cząsteczek oleju na szkiełkach. Nieostrożne traktowanie tkanki, np. zbyt wolne zamrażanie (powyżej 5-10 min po wycięciu) lub rozmrażanie i ponowne zamrażanie, również zwiększa tło ze względu na degradację mRNA. Należy uważać, aby nie pomylić tła z prześwietleniem.

Wystąpienie tła emulsji na zanurzonych preparatach jest możliwe, ponieważ jest ona silnie światłoczuła i wymaga długiego naświetlania w ciemności. Częste problemy z tłem obejmują zbyt wysoką temperaturę wywoływacza i utrwalacza. Gdy temperatura przekracza 19 °C, zbliżając się do temperatury pokojowej lub przewyższając ją, powstaje więcej ziarnistego tła srebrowego. Ekspozycja na niskie poziomy światła przedostającego się do ciemni spowoduje powstanie tła emulsji. Niedostateczne wypłukanie utrwalacza (przez co najmniej 30 min w bieżącej wodzie) pozostawi resztki utrwalacza, który następnie zareaguje z fioletem krezylu, generując brązowy osad w całej emulsji. Jednakże, jeśli preparaty będą płukane w wodzie dłużej niż 90 min po utrwaleniu, a przed barwieniem fioletem krezylu, może to spowodować poluzowanie się emulsji i słabe barwienie sekcji. Jeśli nie ma wystarczająco dużo czasu, aby zabarwić preparaty w przedziale 30-90 min po utrwaleniu i płukaniu, po 30-minutowym płukaniu należy wysuszyć preparaty przez noc i przystąpić do barwienia fioletem krezylu następnego dnia. Zazwyczaj większość mRNA wykazuje specyficzne wzorce ekspresji genów, podczas gdy sygnał tła jest bardziej jednolity.

Zagięcia tkanki mogą prowadzić do błędnych wyników analizy ekspresji genów na kliszach rentgenowskich, tworząc obszary o intensywniejszym sygnale. Aby ustalić, czy tkanka jest zagięta, należy zbadać niebarwione przekroje w ciemnym polu lub przekroje barwione fioletem krezylowym w jasnym polu. Kontrastowanie fioletem krezylowym stanowi lepszy sposób oceny stanu tkanki.

Dla lepszej interpretacji specyficzności sond należy zastosować kontrolne sondy sensowne na kilku sąsiednich sekcjach. Większość sond sensownych nie wykazuje sygnału, jednak niektóre go wykazują, a w takich przypadkach często różni się on od sygnału antysensownego. Sądzimy, że może to być związane z syntezą antysensowną lub innym genem na nici antysensownej genomu. Przedstawiamy przykład sond sensownych i antysensownych dla Pax6 (Ryc. 2A i B). Nić antysensowna ujawnia znakowanie wzdłuż strefy komorowej przedmózgowia, móżdżku i oka, zgodnie z oczekiwaniami (Ryc. 2A), natomiast sonda sensowna wykazuje znakowanie w warstwie barwnikowej siatkówki (Ryc. 2B).

W przypadku rozmiarów sond stosujemy sondy cDNA o długości od 300 do 5000 bps. Sondy krótsze niż 300 bps działają, ale sygnały są zazwyczaj słabsze. Nie testowaliśmy sond dłuższych niż 5000 bps. Najlepiej jest stosować sondy na tkankach pochodzących z tego samego gatunku, jeśli jest to możliwe. W przeciwnym razie przeprowadzamy hybrydyzację krzyżową sond na przekrojach innych gatunków i obniżamy temperaturę hybrydyzacji oraz temperatury przemywania w krokach 3-5 °C w zależności od tożsamości sekwencji, jeśli jest ona znana. Jeśli nie jest znana, dobieramy temperaturę hybrydyzacji i przemywania metodą prób i błędów. Jeśli temperatura zostanie obniżona zbyt mocno, sonda cDNA może ulec hybrydyzacji krzyżowej z innymi mRNA o podobnych sekwencjach u różnych gatunków lub w obrębie tego samego gatunku11. W praktyce stwierdziliśmy, że dla cDNA, których tożsamość z docelowym mRNA w tkance wynosi ~95% lub więcej, rygorystyczne warunki temperatury hybrydyzacji i przemywania (65 °C) sprawdzają się dobrze. W przypadku sekwencji o tożsamości w zakresie od ~85 do 94%, temperaturę hybrydyzacji i przemywania może być konieczne obniżyć do zakresu od ~50 do 60 °C.

Powodem zastosowania metalowego statywu w większości etapów jest użycie przemyć chloroformem oraz ksylenem. Oba te rozpuszczalniki organiczne topią wiele rodzajów tworzyw sztucznych. Szkło oraz niektóre rodzaje tworzyw są odporne na te substancje organiczne. Jednak szkło łatwiej stłuc, a niektóre tworzywa, które początkowo są odporne, mogą ulec stopieniu przy długotrwałej ekspozycji na związki organiczne.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Autoradiografia obrazów hybrydyzacji in situ z filmów rentgenowskich i szkiełek zanurzonych w emulsji. (A-B) Obrazy z filmu rentgenowskiego sagittalnych przekrojów całej głowy kanarka zebra w 10. dniu embrionalnym, zhybrydyzowanych z antysensownymi ryboprobami przeciwko (A) FoxP1 lub (B) CoupTF2, wykonane przy oświetleniu w polu jasnym pod mikroskopem stereoskopowym. Czarne, naświetlone ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA. Pasek skali = 500 μm. (C-D) Obrazy ze szkiełek zanurzonych w emulsji sagittalnych przekrojów całej głowy kanarka zebra w 6. dniu po wykluciu, zhybrydyzowanych z antysensownymi ryboprobami przeciwko (C) FoxP1 i (D) CoupTF2, wykonane przy oświetleniu w polu ciemnym pod mikroskopem stereoskopowym. Białe, naświetlone ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Czerwony: barwienie fioletem krezylu. Pasek skali = 200 μm. Na wszystkich zdjęciach dziób znajduje się po lewej stronie (rostralnie). Filmy rentgenowskie naświetlano przez jeden dzień, szkiełka zanurzone w emulsji przez 3 dni. Sonda FoxP1 ma długość 178 bps i odpowiada fragmentowi 1544-1711 bp mRNA; sonda CoupTF2 ma długość 545 bps i odpowiada fragmentowi 1-545 bp mRNA. Jak widać, w przedmózgowiu mRNA FoxP1 jest wzbogacone w mesopallium (M), striatum (St) i grzbietowej części wzgórza (DT), natomiast CoupTF2 jest wzbogacone w nidopallium (N), arcopallium (A) oraz w bardziej brzusznej części wzgórza. Ekspresja jest spójna pomiędzy różnymi typami naświetlania (oraz w różnym wieku). Jednak w przypadku szkiełek zanurzonych w emulsji widoczne jest znakowanie o wyższej rozdzielczości, a granice i podziały tkanek są bezpośrednio identyfikowalne. Te oraz wszystkie pozostałe obrazy przedstawione w pracy pochodzą z przekrojów z zastosowaniem standardowej hybrydyzacji o wysokiej rygorystyczności w 65 °C.

figure-protocol-2
Rycina 2. Porównanie znakowania nici antysensownej i sensownej, wykazujące różne wzorce. (A) Nić antysensowna genu Pax6 była eksponowana w mózgu, szczególnie w strefie komorowej (biała strzałka). Przedstawiono autoradiografię na filmach rentgenowskich sagitalnych przekrojów całej głowy zebra finch w 12. dniu embrionalnym. (B) Przekrój sąsiedni, poddany hybrydyzacji z nicią sensowną Pax6, nie wykazuje ekspresji tła w całej głowie embrionu, lecz widoczną ekspresję w warstwie pigmentowej siatkówki (czarne strzałki), podobnie jak nić antysensowna. Linia przerywana wskazuje kontur całego mózgu. C: móżdżek.

figure-protocol-3
Rycina 3. Sygnały ekspresji genów in situ na preparatach zanurzonych w emulsji, pobranych z mózgu kanarka zebrskiego w późnych stadiach embrionalnych, w widoku pola jasnego i ciemnego. (A) Obraz w polu jasnym ekspresji D1B w 10. dniu embrionalnym po standardowej ekspozycji na emulsję. Marker (czarny) jest ledwo widoczny przy tym powiększeniu. Sonda ma długość 625 bp i odpowiada fragmentowi 1-625 bp mRNA. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A), ale w widoku pola ciemnego, wykazujący marker (biały) w prążkowiu (St) i wzgórzu (TH). (C) Obraz w polu jasnym ekspresji Slit3 w 12. dniu embrionalnym po nadmiernej ekspozycji na emulsję. Marker (czarny) jest wyraźnie widoczny. Sonda ma długość 779 bp i odpowiada fragmentowi 1243-2021 bp mRNA. (B) Ten sam przekrój i powiększenie co w (A) w widoku pola ciemnego, wykazujący marker (biały) w rdzeniu kręgowym (SC), co odpowiada obrazowi w polu jasnym. Kierunek rostralny jest skierowany w lewo. Cb: móżdżek.

figure-protocol-4
Rycina 4. Rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym. Przedstawiono znakowanie mRNA FoxP1 w przedmózgowiu kanarka zebra z ziarnami srebra (czarne punkty) nad komórkami (fiolet krezylowy) w różnych obszarach mózgu i w różnym wieku, w porównaniu z obrazami przy mniejszym powiększeniu z Ryciny 1A i 1C. (A) Wysoka ekspresja nad poszczególnymi komórkami (czarne strzałki) w mesopallium dorosłego kanarka zebra. (B) Niska ekspresja nad poszczególnymi komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiednim nidopallium tego samego przekroju. (C) Wysoka ekspresja mRNA FoxP1 nad komórkami (czarne strzałki) w mesopallium w 12. dniu embrionalnym. (D) Niska ekspresja nad komórkami (czarne groty strzałek) w sąsiednim nidopallium tego samego przekroju. Przykładowe komórki obrysowano żółtą linią. Komórki embrionalne (C i D) są mniejsze i gęściej upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi (A i B). Ponieważ między komórkami a emulsją występuje pewna przestrzeń, obszar odsłoniętych ziaren srebra z sondy S35 jest nieco większy niż obszar ciał komórkowych. Pasek skali = 10 μm.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radioaktywna hybrydyzacja in situ ekspresji mRNA jest szeroko stosowana w wielu celach, w tym do badania regionalnej organizacji tkanek, typów komórek oraz funkcjonalnej aktywności mózgu2-5,10,12-14. To ostatnie zastosowanie dotyczy genów, których ekspresja mRNA w mózgu jest zależna od zwiększonej aktywności neuronalnej, często nazywanych genami zależnymi od aktywności lub genami wczesnymi (immediate early genes). Przy takich zastosowaniach nasza metoda była stosowana u wielu gatunków, w tym u ptaków, ssaków (np. człowieka), ryb i płazów; w wielu tkankach, w tym w mózgu, skórze i mięśniach; oraz w różnym wieku, w tym u piskląt/noworodków, osobników młodocianych, dorosłych, a tutaj w przekrojach całych embrionów2,3,5,15-17. Cechy szczególne naszego protokołu obejmują: (1) zapewnia on równowagę między specyficznością anatomiczną a specyficznością ilościową. Aby określić ilość ekspresji genu na kliszy rentgenowskiej, wykonujemy cyfrowe zdjęcia obrazów (np. Rys. 1A i 1B), używamy funkcji histogramu programu Photoshop (Adobe) do pomiaru gęstości pikseli w obszarach zainteresowania i odejmujemy poziomy tła na kliszy poza tkanką, ale wciąż na szkiełku podstawowym2,4. Aby określić ilość ekspresji na poziomie komórkowym, wykonujemy zdjęcia ziaren srebra nad komórkami przy dużym powiększeniu (40-100X; Rys. 4). Następnie używamy funkcji threshold i measure programu Image J opracowanego przez Wayne'a Rasbanda w NIH, aby policzyć liczbę ziaren srebra na obrazie, odejmujemy liczbę ziaren tła w podobnym obszarze bez komórek na szkiełku podstawowym, a następnie dzielimy przez liczbę komórek, aby uzyskać wartości ekspresji na komórkę4,18. (2) Może charakteryzować się stosunkowo wysoką przepustowością, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie 100-200 szkiełeczek dzięki szczelnemu zamknięciu szkiełek przykrywek za pomocą kąpieli w oleju mineralnym. Standardowe metody hybrydyzacji in situ wymagają więcej czasu na uszczelnienie szkiełeczek za pomocą parafilmu, lakieru do paznokci i innych środków, co powoduje, że szkiełka zajmują dużo miejsca; (3) jest bardzo czuła w przypadku transkryptów o niskiej liczebności dzięki zastosowaniu siarczanu dekstranu i roztworu Denhardta w buforze hybrydyzacyjnym2,13; (4) podejście obrazowe w ciemnym polu daje obrazy o wysokim kontraście dzięki wykonywaniu zdjęć w oświetleniu ciemnego pola na mikroskopie stereoskopowym4,5. Ponadto pozwala na czułą detekcję niewielkich zmian w ekspresji genów, takich jak ekspresja genów zależnych od aktywności, w celu zidentyfikowania konkretnych obszarów mózgu aktywowanych podczas percepcji i realizacji określonych zachowań19. Ograniczeniami w porównaniu z protokołami nieradioaktywnymi są fakt, że te ostatnie oferują wyraźniejszą rozdzielczość komórkową i dokładniejszą lokalizację mRNA wewnątrz komórki, a praca z emulsją jest bardzo wrażliwa na manipulację i światło. Naszą metodę można łączyć z innymi metodami, takimi jak nieradioaktywna hybrydyzacja in situ, aby znakować ekspresję mRNA więcej niż jednego genu w tej samej tkance10,17,20. Może być ona łączona z immunocytochemią w celu znakowania ekspresji zarówno RNA, jak i białka w tej samej próbce, aby współlokalizować mRNA z określonymi typami komórek10. Modyfikacje protokołu niezbędne dla takich eksperymentów z podwójnym znakowaniem zostały opisane w cytowanych referencjach.

Podsumowując, nasze podejście ułatwia zrozumienie czasu i lokalizacji komórkowej ekspresji genów w celu poznania organizacji regionów, aktywności funkcjonalnej tkanek oraz funkcji genów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Jarvis za udoskonalenie protokołu na przestrzeni lat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezwodnik octowyVWRMK242002
ChloroformVWRBDH1109
Octan fioletu krezolowegoSigmaC5042
KriostatThermo scientificMicrom HM550
Dejonizowany formamidSigmaF9037
DTTPromegaP1171100mM
EDTASigmaED
Forma do zatapianiaVWR15160-215
Szkiełka Superfrost plus marki FisherFisher Scientific22-034-979
FormaldehydVWRBDH0506-4LP
FormamidSigmaF7508
Zestaw GENECLEANQ-Bio gene1001-200
Film Kodak BioMax MRSigmaZ350370
Emulsja Kodak NTBCarestream Health8895666
Wywoływacz Kodak Professional D19Kodak1462593
Utrwalacz Kodak ProfessionalKodak1971746
β-merkapto–etanolCalbiochem444203
Olej mineralnyVWRIC15169491
NaOHVWRSX0600-1
ParaformaldehydSigma76240
Poly AInvitrogenPOLYA.GF
rATPPromegaP113210mM
rCTPPromegaP114210mM
rGTPPromegaP115210mM
RNasinPromegaN211140Units/μl
S35 UTPPerkinElmerNEG039C001MC
Roztwór Safety-SolveSafety Solve Research Products International111177
Octan soduSigmaS78993M
Fosforan sodu zasadowySigmaS3264
Fosforan sodu kwaśnySigmaS3139
Polimeraza RNA SP6PromegaP1085
Metalowy statyw do barwieniaElectron Microscopy Sciences70312-54
Polimeraza RNA T7PromegaP2075
Tissue-Tek OCTSakura4583
5x bufor do transkrypcjiPromegaP1181
TrietanolaminaVWRIC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)VWR101449-446
tRNARoche10109509001

Roztwory:

  1. Odczynniki do otrzymywania ribosond: 1,5 μl matrycy DNA (0,2-0,3 μg/μl), 2 μl 5x zoptymalizowanego buforu do transkrypcji, 1 μl 100mM DTT (dołączony do polimerazy z firmy Promega, dokładnie wymieszać w temperaturze pokojowej), 0,3 μl RNasinu (40 jednostek/μl), 1,5 μl roztworu mieszanki rybonukleotydów AGC, 3,5 μl S35 UTP oraz 1 μl polimerazy RNA. Uzupełnić do 10 μl wodą wolną od nukleaz.
  2. Roztwór mieszanki rybonukleotydów AGC: zmieszać równe ilości 10mM ATP, GTP i CTP.
  3. Roztwór octanu sodu do wytrącania EtOH w celu usunięcia wolnego S35 UTP: 40 μl wody wolnej od RNazy i DNazy, 5 μl 3M octanu sodu oraz 125 μl 100% EtOH.
  4. Bufor do hybrydyzacji (stok 10 ml): 5 ml 100% dejonizowanego formamidu, 600 μl 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8,0), 240 μl 0,5M EDTA (pH = 8,0), 100 μl 100x roztworu Denharta, 100 μl 1M DTT, 250 μl 20 mg/ml tRNA, 125 μl 20 mg/ml poly A oraz 1 g siarczanu dekstranu sodu. Dodać wodę traktowaną DEPC, aby uzyskać objętość całkowitą 10 ml. Intensywnie wstrząsnąć, a następnie inkubować w 55 °C aż do całkowitego rozpuszczenia siarczanu dekstranu sodu. Przechowywać bufor do hybrydyzacji w -20 °C (stabilny przez ok. 6 miesięcy).
  5. 4% buforowany roztwór paraformaldehydu: do kolby przeznaczonej do paraformaldehydu dodać 40 g paraformaldehydu w 760 ml wody destylowanej, podgrzewać do 50 °C na płycie grzejnej przy jednoczesnym mieszaniu. Dodać 320 μl 10N NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie paraformaldehydu. Po rozpuszczeniu (ok. 10 min) dodać 100 ml 10x PBS i uzupełnić objętość wodą destylowaną do 1 litra. Mieszać i podgrzewać roztwór, aż paraformaldehyd się rozpuści. pH powinno wynosić 7,4.
  6. Bufor do acetylacji: 13,6 ml trietanolaminy oraz 2,52 ml bezwodnika octowego w 1 litrze wody destylowanej.
  7. Roztwór 20x SSPE: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O oraz 200 mM EDTA w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 10N NaOH.
  8. Bufor 10x PBS: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 oraz 2,4 g KH2PO4 w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,0 i uzupełnić objętość całkowitą do 1 litra.
  9. Drugi roztwór do przemywania: 0,1% β-merkapto–etanolu i 50% formamidu w 2x SSPE
  10. Roztwór octanu fioletu krezolowego: 3% octanu fioletu krezolowego w wodzie z kranu (woda destylowana uniemożliwia prawidłowe barwienie), rozpuszczony przez noc przy mieszaniu w kolbie w temperaturze pokojowej. Przefiltrować za pomocą ssania próżniowego przez 1-milimetrowy papier filtracyjny Whatman i lejek Büchnera.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363(2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768(2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie ekspresji gen wci cie tkanekanaliza filmu rentgenowskiegopowlekanie emulsjhybrydyzacja z ryboprobredukcja t aobr bka w ciemnidetekcja ziaren srebralokalizacja kom rkowa

Powiązane artykuły