Test zawieszenia ogona

Summary

Test zawieszenia ogona jest zatwierdzany jako eksperymentalna procedura oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych u myszy. Myszy są zawieszane za ogony na sześć minut i oceniane są zachowania związane z ucieczką. Opisano procedury stosowane przy przeprowadzaniu badania zawieszenia ogona.

Abstract

Test zawieszenia ogona jest testem behawioralnym myszy przydatnym do badania potencjalnych leków przeciwdepresyjnych i oceny innych manipulacji, które mogą wpływać na zachowania związane z depresją. Myszy są zawieszone za ogony za pomocą taśmy, w takiej pozycji, że nie mogą uciec ani trzymać się pobliskich powierzchni. Podczas tego testu, trwającego zazwyczaj sześć minut, wyniki zachowań zorientowanych na ucieczkę są określane ilościowo. Test zawieszenia ogonowego jest cennym narzędziem w odkrywaniu leków do wysokoprzepustowych badań przesiewowych potencjalnych związków przeciwdepresyjnych. W tym miejscu opisujemy szczegóły wymagane do realizacji tego testu z dodatkowym naciskiem na potencjalne problemy, które mogą wystąpić i jak ich uniknąć. Oferujemy również rozwiązanie problemu wspinania się na ogon, częstego problemu, który sprawia, że ten test jest bezużyteczny w niektórych odmianach myszy, takich jak szeroko stosowany C57BL/6. W szczególności zapobiegamy wspinaniu się ogona, przepuszczając ogony myszy przez mały plastikowy cylinder przed zawieszeniem. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak ręcznie oceniać zachowania, które przejawiają się w tym teście.

Protocol

1. Materiały

1. Skrzynka zawieszenia

Test zawieszenia ogona (TST) polega na zawieszeniu myszy nad ziemią za ich ogony. Na najbardziej podstawowym poziomie procedura wymaga jedynie drążka do zawieszania lub półki i taśmy. Eksperymentator powinien jednak rozważyć użycie tła zapewniającego optymalny kontrast. Ponadto rozsądnie jest podjąć kroki, aby zapobiec obserwowaniu przez myszy innych testowanych zwierząt. W naszym laboratorium korzystamy ze specjalnie wyprodukowanych skrzyń do zawieszania ogona (Four-Hour Day, Baltimore MD), wykonanych z tworzywa sztucznego o wymiarach (55 wysokości X 60 szerokości X 11,5 cm głębokości). Aby zapobiec wzajemnej obserwacji lub interakcji zwierząt, każda mysz jest zawieszona we własnej prostokątnej komorze o trzech ściankach (55 wysokości x 15 szerokości x 11,5 cm głębokości). Mysz jest zawieszona na środku tej komory, a szerokość i głębokość są wystarczająco duże, aby mysz nie mogła stykać się ze ścianami. W tym ustawieniu przybliżona odległość między nosem myszy a podłogą aparatu wynosi 20-25 cm. W aparacie znajdują się cztery takie identyczne komory, co pozwala nam testować cztery myszy jednocześnie. Na górze pudełka znajduje się aluminiowa belka do zawieszania (1 cm wysokości x 1 cm szerokości x 60 cm długości), służąca do zawieszenia ogona każdej myszy. Wymiary, których używamy w naszym laboratorium, należy traktować jako ogólne odniesienie. Na przykład rozmiar poszczególnych komór w skrzynce zawieszenia ogona można zwiększyć, jeśli stosuje się duży szczep myszy niekrewniaczych (np. CD-1).

Na dole każdej komory umieszczamy odłączaną aluminiową tacę, która zbiera kał lub mocz od zwierząt. Używamy ciemnoszarego pudełka dla zwierząt albinosów i kremowego pudełka dla myszy o innych kolorach sierści. Taki układ daje nam lepszy kontrast, a co za tym idzie bardziej wiarygodną ocenę behawioralną testu.

2. Taśma

Taśma powinna bezpiecznie przylegać zarówno do ogona myszy, jak i do belki zawieszenia, i być wystarczająco mocna, aby udźwignąć ciężar testowanej myszy (np. TimeMed Labeling Systems, Inc, Burr Ridge IL, 1,9 cm szerokości). Jednak taśma nie powinna być nadmiernie lepka, ponieważ pod koniec sesji zostanie usunięta z ogona. Wycinamy 17 cm fragmenty taśmy i umieszczamy znak 2 cm od jednego końca. Ta 2 cm część służyła do przymocowania taśmy do ogona, natomiast pozostałe 15 cm służyło do zawieszenia myszki.

3. Zegar

4. Urządzenie do nagrywania wideo

Potrzebna jest kamera wideo i statyw (lub inna konstrukcja nośna). Ponieważ test ten zwykle obejmuje wiele zwierząt testowanych w tym samym czasie, ocena na żywo będzie trudna i nie jest zalecana. Kamera wideo powinna nagrywać w wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby renderować wysokiej jakości obraz, który zostanie później wykorzystany do oceny behawioralnej. Przed rozpoczęciem testu należy zawsze upewnić się, że w aparacie jest wystarczająca ilość pamięci nagrywania. Korzystamy z kamery wideo, która nagrywa cyfrowo bez użycia fizycznych nośników (np. kasety wideo), co pozwala na proste przesyłanie filmów.

5. Generator białego szumu

Generator szumów powinien maskować przerywane dźwięki otoczenia. Stosowanie generatora szumów jest szczególnie zalecane w środowiskach laboratoryjnych, w których słychać nagłe głośne dźwięki, które potencjalnie mogłyby przestraszyć myszy. W naszym pomieszczeniu doświadczalnym poziom hałasu otoczenia (bez włączonego generatora białego szumu) wynosi około 60 dB. Całkowity poziom dźwięku przy włączonym generatorze białego szumu w miejscu, w którym prowadzony jest TST wynosi 70-72 dB. Należy jednak zauważyć, że liczby te są podane jedynie jako przykładowe, a każde laboratorium powinno wybrać odpowiednie poziomy hałasu zgodnie z unikalnym środowiskiem i okolicznościami.

6. Środki czystości

Pudełko z zawieszeniem powinno być dokładnie przetarte po każdej sesji roztworem sterylizacyjnym (np. MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, lub podobnym).

7. Climbstoppers (opcjonalnie: w zależności od użytego szczepu)

Myszy z niektórych środowisk, takich jak C57BL/6, mogą wspinać się na ogony podczas testu¹. Przezroczyste puste cylindry (4 cm długości, 1,6 cm średnicy zewnętrznej, 1,3 cm średnicy wewnętrznej, 1,5 grama), które są cięte na długość czterech cm (przez FourHourDay Inc, Baltimore MD) z poliwęglanowych rurek (#8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs, CA) są umieszczane wokół ogonów myszy, aby zapobiec takiemu zachowaniu wspinania się ogona^2,3. Urządzenia te można wykonać w dowolnym laboratorium przy użyciu zwykłych narzędzi i materiałów.

2. Procedury behawioralne

Ogólny projekt eksperymentu powinien odzwierciedlać prawidłowe równoważenie zmiennych specyficznych dla twojego eksperymentu. Na przykład w naszych eksperymentach staramy się reprezentować każdą grupę jednakowo w każdej sesji TST (tj. jeśli są cztery grupy terapeutyczne, każda z nich będzie reprezentowana w każdej sesji). Ponadto pozycje myszy są obracane w taki sposób, że myszy z każdej grupy leczonej są umieszczane w innej pozycji podczas każdej sesji.

1. Umieść kamerę w odpowiedniej pozycji. Kamera powinna znajdować się jak najbliżej, aby uzyskać jak najwyższą rozdzielczość zwierząt.
2. Fragmenty taśmy, które będą wykorzystywane podczas sesji, powinny zostać wycięte, oznaczone i przygotowane do sesji.
3. Uruchom generator białego szumu, jeśli jest używany, zanim myszy zostaną wprowadzone do pomieszczenia testowego. Poziom białego szumu powinien być wystarczający tylko do zamaskowania dźwięków zewnętrznych. Unikaj dużej głośności i upewnij się, że ten sam poziom białego szumu jest używany dla wszystkich zwierząt.
4. Przyprowadź zwierzęta do pomieszczenia testowego. Jeżeli pomieszczenie, w którym przebywają zwierzęta, i pomieszczenie do przeprowadzania badań sąsiadują ze sobą i panują w nich podobne warunki otoczenia, okres aklimatyzacji nie jest konieczny. W przeciwnym razie należy umieścić zwierzęta w pomieszczeniu do przeprowadzania testów na okres aklimatyzacji (zazwyczaj co najmniej jedną godzinę). Należy pamiętać, że inne zwierzęta znajdujące się w tym samym pomieszczeniu mogą wyczuwać sygnały węchowe i ultradźwiękowe.
5. Jeśli używana jest odmiana, o której wiadomo, że wspina się po ogonach, taka jak C57BL6/J, przed nałożeniem taśmy umieść Climbstoppers wokół ogonów.
6. Przyklej taśmę do ogonów myszy. Użyj zaznaczonego końca taśmy i upewnij się, że taśma przylega do ogona i z powrotem na siebie. Taśmę należy przyłożyć na sam koniec ogona, pozostawiając 2-3 milimetry ogona na zewnątrz taśmy.
7. Po przymocowaniu każdego kawałka taśmy do ogona myszy przyklej środkową część taśmy do wewnętrznych ścian klatki. Pomoże to zapobiec plątaniu się kawałków taśmy ze sobą. Należy pamiętać, że uwięzienie w ten sposób może powodować stres i że ważne jest, aby jak najszybciej zakończyć proces nakładania taśmy na każde zwierzę.
8. Po nałożeniu całej taśmy rozpocznij nagrywanie i zidentyfikuj sesję, zanim myszy zostaną zawieszone.
9. Zawiesić zwierzęta, umieszczając wolny koniec taśmy na drążku do zawieszania lub półce w kolejności, która jest równoważona między grupami poddawanymi zabiegowi. Zawieś myszy w taki sposób, aby nie zasłaniał widoku z kamery, ponieważ cała sesja TST będzie punktowana, a zasłanianie kamery doprowadzi do niemożności oceny zachowań w tym czasie. Sprawdź, czy wszystkie końce taśmy zwisają równolegle do drążka zawieszenia lub półki z podobną długością luzu dla każdej myszy.
10. Pod koniec sesji (która zwykle trwa sześć minut) wróć do klatki domowej i ostrożnie usuń taśmę z każdego ogona, delikatnie ją ściągając. Nie zrywaj taśmy z ogona, ponieważ może to spowodować ból myszy.
11. Po powrocie myszy do ich pokoju kolonijnego wyrzuć kał, boli i mocz z tacek zbiorczych i przetrzyj aparat roztworem sterylizującym.

3. Analiza zachowania

1. Ogólnie rzecz biorąc, TST trwa od początku do końca sześć minut. W przeciwieństwie do innej powszechnie stosowanej procedury skuteczności przeciwdepresyjnej, testu wymuszonego pływania, cała sesja jest oceniana. Wynika to z ogólnego stwierdzenia, że myszy mają tendencję do manifestowania bezruchu na wcześniejszym etapie TST.
2. W naszym laboratorium przesyłamy pliki wideo bezpośrednio z kamery do komputera, gdzie przeprowadzana jest analiza.
3. Podczas analizy behawioralnej mierzony jest czas, jaki każda mysz spędza jako mobilna. Chociaż możliwe jest bezpośrednie zmierzenie czasu bezruchu, stwierdziliśmy, że łatwiej jest wykryć i zmierzyć aktywne ruchy niż ich brak.
4. Najważniejszym aspektem analizy behawioralnej TST jest konsekwentna identyfikacja ruchów, które są rejestrowane jako mobilność w dobrej wierze. Myszy, zwłaszcza na początku sesji, przejawiają zachowania, które są jawnie związane z ucieczką. Należą do nich próby dotarcia do ścian aparatu i drążka nośnego, silne drżenie ciała i ruchy kończyn podobne do biegania. Ruchy te w oczywisty sposób składają się na mobilność. Zachowania te następnie ustępują i stają się bardziej subtelne. W naszym laboratorium drobne ruchy, które ograniczają się do przednich nóg, ale bez udziału tylnych nóg, nie są liczone jako mobilność. Dodatkowo, oscylacje i wahadła, takie jak wahadła, które są spowodowane pędem uzyskanym podczas wcześniejszych napadów mobilności, również nie są liczone jako mobilność.
5. W naszym laboratorium korzystamy z oprogramowania stopera ekranowego do pomiaru czasu pracy (Xnote Stoper, Grupa Badawcza dnSoft). Na ekranie używane są dwa oddzielne stopery. Pierwszy stoper odlicza od 360 sekund i ostrzega obserwatora o zakończeniu okresu analizy behawioralnej. Drugi stoper — sterowany przez obserwatora — mierzy czas spędzony w ruchu mobilnym. Niektóre programy stopera mają możliwość przypisywania do funkcji uruchamiania i zatrzymywania, dzięki czemu klawiatura na ekranie może sterować stoperem. Zamiast zwykłej klawiatury używamy urządzenia wejściowego powszechnie znanego jako "gamepad" do sterowania stoperami.
6. Jeśli na ekranie znajduje się więcej niż jedna testowana mysz, dobrym pomysłem jest zakrycie pozostałych zwierząt, aby ich ruchy nie rozpraszały obserwatora. Można to osiągnąć za pomocą innego okna programu lub fizycznie zakrywając inne myszy na ekranie papierem.
7. Może wystąpić pewne odchylenie, jeśli całkowity czas mobilności, jaki upłynął dla danej myszy, jest widoczny przed zakończeniem sesji analizy. Jeśli używany jest stoper ekranowy, sugerujemy pokrycie wszystkich ułamków dziesiętnych stopera z wyjątkiem milisekund. Zasłaniając stoper, obserwator wie tylko, czy stoper jest włączony, czy wyłączony w dowolnym momencie, ale nie zna całkowitego czasu, który upłynął, a zatem nie może być dotknięty żadną stronniczością. Stosując to podejście, obserwator, choć ślepy na grupowe przypisania zwierząt, nie będzie miał ogólnego pojęcia o poziomie mobilności każdego zwierzęcia.
8. Badanie wiarygodności między obserwatorami powinno być przeprowadzone dla każdego nowego obserwatora przed rozpoczęciem zbierania danych od badanych zwierząt. W naszym laboratorium każdy nowy obserwator najpierw obserwuje doświadczonego obserwatora podczas jego punktacji. Po tym, jak nowi obserwatorzy nabiorą wystarczającej pewności siebie, aby odróżnić mobilność od bezruchu, zdobywają punkty w czasie rzeczywistym, a doświadczony obserwator obserwuje i wskazuje wszelkie błędy. Po pomyślnym zakończeniu tej fazy, nowi obserwatorzy przeanalizują określony zestaw filmów TST, które przechowujemy w naszym laboratorium w celach szkoleniowych. Dopiero po uzyskaniu wysokiego poziomu korelacji między obserwatorami a doświadczonym obserwatorem, badacz analizuje filmy TST z rzeczywistych eksperymentów. Dane z tych analiz szkoleniowych archiwizujemy w celu stworzenia wewnętrznego standardu dla laboratorium. Zaobserwowaliśmy różnice między szczepami w sposobie, w jaki wyrażają zachowania związane z mobilnością (i bezruchowością) oraz średnim czasem bezruchu między płciami. Kiedy nowy szczep, płeć lub genetycznie zmodyfikowany model myszy jest testowany w laboratorium, konieczne jest ponowne przeprowadzenie tego typu analizy niezawodności.

4. Reprezentatywne wyniki

Użyliśmy TST do oceny reakcji podobnych do leków przeciwdepresyjnych na leczenie litem u różnych szczepów myszy (Rysunek 1)³. Szczegóły eksperymentalne tego eksperymentu zostały opublikowane w Can et al., 2011³.

Rysunek 1. Czas unieruchomienia w teście zawieszenia ogona po przewlekłym podawaniu litu w pięciu wsobnych szczepach myszy. Myszy trzymano w grupach, po cztery myszy w klatce. Myszy w grupie leczonej litem otrzymywały karmę litową zawierającą 4 g / kg LiCl przez trzy tygodnie. Zwierzęta kontrolne otrzymywały identyczny pokarm bez chlorku litu. **:p<0,01, ***:p<0,001 oznaczają istotny, niesparowany test t. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM. n:10-12 zwierząt na grupę dla każdego szczepu. (rysunek odtworzony z ³).

W tym przykładzie znaczący efekt leczenia przewlekłego litu dostarczanego w żywności obserwuje się tylko w szczepach C57BL/6J i DBA/2J. W pozostałych trzech szczepach nie zaobserwowano istotnego statystycznie skrócenia czasu bezruchu. Dane te wskazują, że odpowiedź podobna do leku przeciwdepresyjnego na przewlekłe leczenie litem jest zależna od szczepu, co zaobserwowano również w przypadku innych leków przeciwdepresyjnych^4-8.

Discussion

Opracowanie TST przez Steru i wsp.⁹ był pod wpływem wcześniej opracowanego testu wymuszonego pływania^10-12. Podobnie jak w teście wymuszonego pływania, w TST myszy są umieszczane w nieuniknionej, ale umiarkowanie stresującej sytuacji. Brak zachowań związanych z ucieczką jest uważany za bezruch. Podobnie jak test wymuszonego pływania, TST jest testem najlepiej zwalidowanym do oceny skuteczności przeciwdepresyjnej leków, ale także do oceny skutków manipulacji środowiskowych, neurobiologicznyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taśma
czasowa
Kamera
Generator białego szumu (opcjonalnie)
Climbstoppers (opcjonalnie; w zależności od użytego szczepu)