Test zawieszenia ogona

Podsumowanie

Test zawieszenia za ogon jest walidowaną procedurą eksperymentalną służącą do oceny skuteczności przeciwdepresyjnej leków u myszy. Myszy są zawieszane za ogony na sześć minut, a następnie ocenia się zachowania związane z próbą ucieczki. Opisujemy procedury stosowane podczas przeprowadzania testu zawieszenia za ogon.

Streszczenie

Test zawieszenia za ogon jest behawioralnym testem mysim, użytecznym w przesiewaniu potencjalnych leków przeciwdepresyjnych oraz ocenie innych manipulacji, które mają wpływać na zachowania związane z depresją. Myszy są zawieszane za ogony za pomocą taśmy, w pozycji uniemożliwiającej ucieczkę lub chwycenie się pobliskich powierzchni. Podczas tego testu, który trwa zazwyczaj sześć minut, kwantyfikowane są wynikające z tego zachowania ukierunkowane na ucieczkę. Test zawieszenia za ogon jest cennym narzędziem w odkrywaniu leków, służącym do wysokoprzepustowego przesiewania potencjalnych związków przeciwdepresyjnych. W niniejszej pracy opisujemy szczegóły niezbędne do przeprowadzenia tego testu, kładąc dodatkowy nacisk na potencjalne problemy, które mogą wystąpić, oraz sposób ich unikania. Proponujemy również rozwiązanie problemu wspinania się po ogonie – częstej trudności, która czyni ten test bezużytecznym u niektórych szczepów myszy, takich jak powszechnie stosowany C57BL/6. Konkretnie, zapobiegamy zachowaniom wspinania się po ogonie poprzez przekładanie ogonów myszy przez mały plastikowy cylinder przed zawieszeniem. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak ręcznie oceniać zachowania przejawiane w tym teście.

Protokół

1. Materiały

1. Pudełko do zawieszeń

Test zawieszenia za ogon (TST) polega na zawieszeniu myszy nad ziemią za pomocą ogona. W najprostszym wydaniu procedura wymaga jedynie pręta do zawieszenia lub krawędzi półki oraz taśmy. Eksperymentator powinien jednak rozważyć zastosowanie tła zapewniającego optymalny kontrast. Ponadto zaleca się podjęcie kroków zapobiegających obserwowaniu przez myszy innych testowanych zwierząt. W naszym laboratorium stosujemy specjalnie wykonane skrzynki do zawieszania za ogon (Four-Hour Day, Baltimore MD), wykonane z tworzywa sztucznego o wymiarach (55 wysokość X 60 szerokość X 11,5 cm głębokość). Aby zapobiec obserwowaniu lub interakcjom między zwierzętami, każda mysz jest zawieszona we własnej trójściennej prostokątnej komorze (55 wysokość X 15 szerokość X 11,5 cm głębokość). Mysz jest zawieszona na środku tej komory, a jej szerokość i głębokość są dostatecznie duże, aby zwierzę nie mogło dotykać ścian. W tej konfiguracji przybliżona odległość między nosem myszy a dnem aparatury wynosi 20-25 cm. Aparatura posiada cztery takie identyczne komory, co pozwala na jednoczesne testowanie czterech myszy. Aluminiowy pręt do zawieszania (1 cm wysokości X 1 cm szerokości x 60 cm długości), służący do mocowania ogonów poszczególnych myszy, znajduje się na górze skrzynki. Wymiary stosowane w naszym laboratorium należy traktować jako ogólny punkt odniesienia. Na przykład rozmiar poszczególnych komór skrzynki do zawieszania za ogon może zostać zwiększony w przypadku użycia dużej linii myszy outbred (np. CD-1).

Na dnie każdego przedziału umieszczamy wyjmowaną aluminiową tackę, która służy do zbierania odchodów lub moczu zwierząt. W przypadku zwierząt albinosów stosujemy ciemnoszary pojemnik, natomiast dla myszy o innych kolorach okrywy włosowej używamy pojemnika w kolorze kremowym. Taki układ zapewnia lepszy kontrast, a w konsekwencji bardziej wiarygodną ocenę behawioralną podczas testu.

2. Taśma

Taśma powinna przylegać stabilnie zarówno do ogona myszy, jak i do pręta zawieszenia, oraz być wystarczająco wytrzymała, aby utrzymać ciężar badanej myszy (np. TimeMed Labeling Systems, Inc, Burr Ridge IL, szerokość 1.9 cm). Taśma nie powinna być jednak nadmiernie lepka, ponieważ pod koniec sesji zostanie usunięta z ogona. Odcinamy fragmenty taśmy o długości 17 cm i zaznaczamy punkt 2 cm od jednego z końców. Ten 2 cm odcinek służy do przymocowania taśmy do ogona, natomiast pozostałe 15 cm służy do zawieszenia myszy.

3. Odliczanie czasu

4. Urządzenie do rejestracji wideo

Wymagana jest kamera wideo oraz statyw (lub inna struktura wsporcza). Ponieważ test ten zazwyczaj obejmuje badanie wielu zwierząt w tym samym czasie, ocena na żywo będzie trudna i nie jest zalecana. Kamera wideo powinna nagrywać w rozdzielczości wystarczająco wysokiej, aby uzyskać obraz wysokiej jakości, który zostanie później wykorzystany do oceny behawioralnej. Przed rozpoczęciem testu zawsze upewnij się, że w kamerze znajduje się wystarczająca ilość pamięci do nagrywania. Używamy kamery wideo, która nagrywa cyfrowo bez użycia nośników fizycznych (np. kaset wideo), co umożliwia łatwy transfer nagrań.

5. Generator białego szumu

Generator szumu powinien maskować przerywane dźwięki otoczenia. Stosowanie generatora szumu jest szczególnie zalecane w środowiskach laboratoryjnych, w których mogą wystąpić nagłe, głośne dźwięki, które mogłyby potencjalnie spłoszyć myszy. W naszym pomieszczeniu eksperymentalnym poziom hałasu otoczenia (bez włączonego generatora białego szumu) wynosi około 60 dB. Całkowity poziom dźwięku przy włączonym generatorze białego szumu w miejscu przeprowadzania TST wynosi 70-72 dB. Należy jednak zauważyć, że wartości te podano wyłącznie w celach przykładowych, a każde laboratorium powinno dobrać odpowiednie poziomy hałasu w zależności od swojego specyficznego środowiska i okoliczności.

6. Materiały do czyszczenia

Pojemnik z zawiesiną należy dokładnie przecierać po każdej sesji roztworem sterylizującym (np. MB-10, Quip Laboratories Inc., Wilmington, DE, lub podobnym).

7. Stopery do wspinania (opcjonalnie: zależnie od użytego szczepu)

Myszy niektórych szczepów, takich jak C57BL/6, mogą wspinać się po własnych ogonach podczas testu¹. Aby zapobiec takim zachowaniom^2,3, wokół ogonów myszy umieszcza się przezroczyste puste cylindry (długość 4 cm, średnica zewnętrzna 1,6 cm, średnica wewnętrzna 1,3 cm, masa 1,5 g) o długości czterech cm (wykonane przez FourHourDay Inc, Baltimore MD) z rurek poliwęglanowych (#8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs, CA). Urządzenia te można wykonać w każdym laboratorium przy użyciu powszechnie dostępnych narzędzi i materiałów.

2. Procedury behawioralne

Ogólny schemat eksperymentalny powinien odzwierciedlać odpowiednią przeciwwagę między zmiennymi specyficznymi dla danego badania. Na przykład w naszych eksperymentach staramy się równomiernie reprezentować każdą grupę w każdej sesji TST (tzn. jeśli istnieją cztery grupy badawcze, każda z nich powinna być reprezentowana w każdej sesji). Ponadto pozycje myszy są rotowane w taki sposób, aby myszy z każdej grupy badawczej były umieszczane w innej pozycji w każdej sesji.

1. Ustaw kamerę w odpowiedniej pozycji. Kamera powinna znajdować się jak najbliżej, aby uzyskać jak najwyższą rozdzielczość obrazu zwierząt.
2. Fragmenty taśmy, które będą wykorzystywane podczas sesji, należy wyciąć, oznaczyć i przygotować do badania.
3. Przed wprowadzeniem myszy do pomieszczenia badawczego uruchom generator białego szumu, jeśli jest on stosowany. Poziom białego szumu powinien być jedynie wystarczający do zamaskowania hałasów zewnętrznych. Należy unikać zbyt wysokiej głośności i upewnić się, że dla wszystkich zwierząt stosowany jest ten sam poziom białego szumu.
4. Wprowadź zwierzęta do pomieszczenia badawczego. Jeśli pomieszczenie, w którym przebywają zwierzęta, oraz pomieszczenie badawcze sąsiadują ze sobą i panują w nich podobne warunki otoczenia, okres aklimatyzacji może nie być konieczny. W przeciwnym razie umieść zwierzęta w pomieszczeniu badawczym na okres aklimatyzacji (zazwyczaj co najmniej jedną godzinę). Pamiętaj, że inne zwierzęta umieszczone w tym samym pomieszczeniu mogą wyczuwać sygnały węchowe i ultradźwiękowe.
5. W przypadku użycia szczepu znanego z wspinania się po własnych ogonach, takiego jak C57BL6/J, przed naklejeniem taśmy należy założyć Climbstoppery wokół ogonów.
6. Przyklej taśmę do ogonów myszy. Użyj oznaczonego końca taśmy i upewnij się, że taśma przylega do ogona oraz do samej siebie. Taśmę należy nakleić na sam koniec ogona, pozostawiając 2-3 mm ogona poza taśmą.
7. Po przyklejeniu każdego kawałka taśmy do ogona myszy, przyczep środkową część taśmy do wewnętrznych ścianek klatki. Pomoże to zapobiec plątaniu się kawałków taśmy. Należy pamiętać, że takie ograniczenie przestrzeni może powodować stres, dlatego ważne jest, aby proces naklejania taśmy na każde zwierzę zakończyć jak najszybciej.
8. Po naklejeniu wszystkich taśm rozpocznij nagrywanie i zidentyfikuj sesję przed zawieszeniem myszy.
9. Zawieś zwierzęta, umieszczając wolny koniec taśmy na pręcie lub półce zawieszającej, w kolejności zrównoważonej między grupami badawczymi. Zawieś myszy w sposób, który nie zasłania widoku z kamery, ponieważ cała sesja TST będzie oceniana, a zasłonięcie kamery uniemożliwi analizę zachowań w tym czasie. Sprawdź, czy wszystkie końce taśm zwisają równolegle do pręta lub półki zawieszającej, z podobną długością luzu dla każdej myszy.
10. Po zakończeniu sesji (która zazwyczaj trwa sześć minut) zwróć zwierzęta do ich klatek domowych i ostrożnie usuń taśmę z każdego ogona, delikatnie ją odrywając. Nie szarp taśmy z ogona, ponieważ może to spowodować ból u myszy.
11. Po powrocie myszy do pomieszczenia dla kolonii usuń grudki kału i mocz z tacek zbierających, a następnie przetrzyj aparat roztworem sterilizującym.

3. Analiza zachowania

1. Zazwyczaj test TST trwa od początku do końca sześć minut. W przeciwieństwie do innej powszechnie stosowanej procedury oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych, testu wymuszonego pływania, ocenia się całą sesję. Wynika to z ogólnego spostrzeżenia, że myszy wykazują tendencję do przejawiania unieruchomienia wcześniej w TST.
2. W naszym laboratorium przesyłamy pliki wideo bezpośrednio z kamery na komputer PC, na którym przeprowadzana jest analiza.
3. Podczas analizy behawioralnej mierzy się czas, jaki każda mysz spędza w stanie aktywności ruchowej. Choć możliwe jest bezpośrednie mierzenie czasu unieruchomienia, stwierdziliśmy, że łatwiej jest wykrywać i mierzyć ruchy aktywne niż brak takich ruchów.
4. Najważniejszym aspektem analizy behawioralnej TST jest spójna identyfikacja ruchów rejestrowanych jako rzeczywista mobilność. Myszy, szczególnie na początku sesji, wykazują zachowania ewidentnie związane z próbą ucieczki. Obejmują one próby dotarcia do ścian aparatury i pręta zawieszenia, silne potrząsanie ciałem oraz ruchy kończyn przypominające bieg. Ruchy te jednoznacznie stanowią przejaw mobilności. Następnie zachowania te ustępują i stają się subtelniejsze. W naszym laboratorium niewielkie ruchy ograniczone do przednich łap, bez udziału tylnych łap, nie są liczone jako mobilność. Ponadto oscylacje i ruchy wahadłowe wynikające z pędu uzyskanego podczas wcześniejszych epizodów mobilności również nie są liczone jako mobilność.
5. W naszym laboratorium do pomiarów czasu używamy oprogramowania ze stoperem ekranowym (Xnote Stopwatch, dnSoft Research Group). Na ekranie używa się dwóch oddzielnych stoperów. Pierwszy stoper odlicza czas od 360 sekund i powiadamia obserwatora o zakończeniu okresu analizy behawioralnej. Drugi stoper — kontrolowany przez obserwatora — mierzy czas spędzony w stanie mobilności. Niektóre oprogramowania stoperów mają możliwość przypisania klawiszy do funkcji startu i stopu, dzięki czemu stoperem można sterować za pomocą klawiatury na ekranie. Zamiast zwykłej klawiatury używamy urządzenia wejściowego powszechnie znanego jako „gamepad” do sterowania stoperami.
6. Jeśli testowanych jest więcej niż jedna mysz i są one widoczne na ekranie, warto zasłonić pozostałe zwierzęta, aby ich ruchy nie rozpraszały obserwatora. Można to osiągnąć, używając innego okna programu lub fizycznie zasłaniając pozostałe myszy na ekranie papierem.
7. Może wystąpić błąd systematyczny, jeśli całkowity czas mobilności upływający dla danej myszy jest widoczny przed zakończeniem sesji analizy. W przypadku użycia stopera ekranowego sugerujemy zasłonić wszystkie cyfry stopera poza milisekundami. Dzięki zasłonięciu stopera obserwator wie jedynie, czy stoper jest włączony czy wyłączony w danym momencie, ale nie zna całkowitego upływu czasu, a zatem nie może ulec żadnemu błęgowi systematycznemu. Stosując to podejście, obserwator, będąc zaślepionym co do przydziału zwierząt do grup, nie będzie miał ogólnego pojęcia o poziomie mobilności każdego zwierzęcia.
8. Przed rozpoczęciem zbierania danych od zwierząt testowych należy przeprowadzić test niezawodności międzyobserwatorami dla każdego nowego obserwatora. W naszym laboratorium każdy nowy obserwator najpierw obserwuje doświadczonego obserwatora podczas oceniania. Po tym, jak nowi obserwatorzy nabiorą wystarczającej pewności w odróżnianiu mobilności od unieruchomienia, dokonują ocen w czasie rzeczywistym, podczas gdy doświadczony obserwator nadzoruje proces i wskazuje ewentualne błędy. Po pomyślnym zakończeniu tej fazy nowi obserwatorzy analizują konkretny zestaw filmów z TST, który przechowujemy w naszym laboratorium do celów szkoleniowych. Dopiero po uzyskaniu wysokiego poziomu korelacji międzyobserwatorskiej z doświadczonym obserwatorem badacz analizuje filmy z TST z rzeczywistych eksperymentów. Archiwizujemy dane z tych analiz szkoleniowych, aby stanowiły wewnętrzny standard dla laboratorium. Zaobserwowaliśmy różnice między szczepami w sposobie ekspresji zachowań mobilności (i unieruchomienia) oraz średni czas unieruchomienia między płciami. Gdy w laboratorium testowany jest nowy szczep, płeć lub genetycznie zmodyfikowany model mysi, konieczne jest ponowne przeprowadzenie tego typu analizy niezawodności.

4. Reprezentatywne wyniki

Wykorzystaliśmy TST do oceny odpowiedzi przeciwdepresyjnych na leczenie litem u różnych szczepów myszy (Rysunek 1)³. Szczegóły eksperymentalne tego badania zostały opublikowane w pracy Can et al., 2011³.

Rysunek 1. Czas unieruchomienia w teście zawieszenia za ogon po przewlekłym podawaniu litu u pięciu inbredowych szczepów myszy. Myszy były utrzymywane w grupach, po cztery osobniki w klatce. Myszy w grupie leczonej litem otrzymywały karmę z dodatkiem 4 g/kg LiCl przez trzy tygodnie. Zwierzęta kontrolne otrzymywały identyczną karmę bez chlorku litu. **:p<0.01, ***:p<0.001 oznaczają istotność statystyczną w nieparzystym teście t. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n: 10-12 zwierząt na grupę dla każdego szczepu (rysunek powielony z ³).

W tym przykładzie istotny efekt terapeutyczny przewlekłego podawania litu z pokarmem zaobserwowano jedynie u szczepów C57BL/6J i DBA/2J. W pozostałych trzech szczepach nie odnotowano statystycznie istotnego skrócenia czasu unieruchomienia. Dane te wskazują, że odpowiedź o charakterze przeciwdepresyjnym na przewlekłe leczenie litem jest zależna od szczepu, co obserwowano również w przypadku innych leków przeciwdepresyjnych^4-8.

Dyskusja

Opracowanie testu TST przez Steru et al.⁹ było inspirowane wcześniej opracowanym testem wymuszonego pływania^10-12. Podobnie jak w teście wymuszonego pływania, w TST myszy są umieszczane w sytuacji bez wyjścia, ale umiarkowanie stresującej. Brak zachowań związanych z próbą ucieczki uznaje się za unieruchomienie. Podobnie jak test wymuszonego pływania, TST jest testem najlepiej zwalidowanym do oceny skuteczności leków przeciwdepresyjnych, ale stosuje się go również do oceny efektów manipulacj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma
Stoper
Kamera wideo
Generator białego szumu (opcjonalnie)
Climbstoppers (opcjonalnie; w zależności od użytego szczepu)