Artykuł metodologiczny

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3794

⸱

9 marca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics, Johns Hopkins University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, 3Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Streszczenie

Dynamiczna regulacja małych guanozynotrifosfataz (GTPaz) z rodziny Rho z dużą precyzją czasoprzestrzenną jest niezbędna dla wielu funkcji i zdarzeń komórkowych1, 2. Ich dynamiczny charakter w czasie i przestrzeni został ujawniony dzięki wizualizacji ich aktywności oraz lokalizacji w czasie rzeczywistym3. Aby uzyskać głębsze zrozumienie ich roli w różnorodnych funkcjach komórkowych na poziomie molekularnym, kolejnym krokiem powinno być zaburzenie aktywności białek w precyzyjnie określonej lokalizacji subkomórkowej i czasie.

Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy metodę indukowanej światłem, kontrolowanej przestrzennie i czasowo aktywacji małych GTPaz poprzez połączenie dwóch technik: (1) indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz (2) metody fotoklatkowania rapamycyny. Wykorzystując zapośredniczoną przez rapamycynę heterodimeryzację FKBP-FRB, opracowaliśmy metodę szybkiej, indukowalnej aktywacji lub inaktywacji małych GTPaz, w tym Rac4, Cdc424, RhoA4 i Ras5, w której rapamycyna indukuje translokację GTPaz połączonych z FKBP lub ich aktywatorów do błony plazmatycznej, w której zakotwiczony jest FRB. W celu połączenia z tym systemem heterodimeryzacji opracowaliśmy również system fotoklatkowania analogów rapamycyny. Związek fotoklatkowany to mała cząsteczka, której aktywność jest tłumiona przez fotolabilną grupę ochronną, zwaną grupą klatkującą. Aby całkowicie stłumić aktywność heterodimeryzacji, zaprojektowaliśmy klatkowaną rapamycynę przywiązaną do makrocząsteczki w taki sposób, aby powstały duży kompleks nie mógł przekroczyć błony plazmatycznej, co prowadzi do praktycznego braku aktywności tła jako chemicznego dimeryzatora wewnątrz komórek6. Rysunek 1 przedstawia schemat naszego systemu. Dzięki połączeniu tych dwóch systemów lokalnie zrekrutowaliśmy aktywator Rac do błony plazmatycznej w skali sekund i osiągnęliśmy indukowaną światłem aktywację Rac na poziomie subkomórkowym6.

Protokół

1. Transfekcja plazmidowego DNA

  1. Do 37,5 μl dH2O dodać plazmidowe DNA: 0,5 μg FRB przytwierdzonego do błony (dalej określanego jako LDR) oraz 0,5 μg FKBP-Tiam1 (białko 1 indukujące inwazję i przerzuty w chłoniakach limfocytów T: aktywator Rac) znakowanego białkiem fluorescencyjnym. Dodać 1 μl FuGENE HD.
  2. Wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przejść do kroków 1.3-1.8.
  3. Każdą studzienkę komory 8-studzienkowej przemyć 50 μl poli-D-lizyny.
  4. Środek każdej studzienki przemyć dH2O.
  5. Komórki NIH-3T3 o konfluencji 80-85% poddać trypsynizacji i rozcieńczyć do 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM z 10% FBS).
  6. Odebrać 375 μl zawiesiny i wirować przy 1750 rpm przez 3 minuty.
  7. Odssać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  8. Dodać 750 μl DMEM z 10% FBS i resuspendować.
  9. Zawiesinę komórkową dodać do roztworu dH2O/DNA/FuGENE HD i delikatnie wymieszać.
  10. Do każdej studzienki dodać 250 μl zawiesiny komórek/DNA (wystarczy na maksymalnie 3 studzienki).
  11. Transfekowane komórki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15-18 h.

2. Przygotowanie roztworu cRb-A

  1. Zsyntezować addukt klatkowanej rapamycyny z biotyną (cRb). Szczegóły znajdują się w sekcji „Schemat syntezy cRb”. W skrócie, grupy klatkujące i biotynowe przygotowuje się osobno. Grupę klatkującą koniuguje się następnie z rapamycyną (LC lab), a produkt łączy się z grupą biotynową za pomocą reakcji typu click7, aby otrzymać cRb.
  2. Przygotować roztwór stokowy cRb o stężeniu 1 μM w DMSO.
  3. Rozpuścić 1 mg awidyny w 250 μl PBS w probówce Eppendorfa o pojemności 0,5 ml.
  4. Do rozpuszczonej awidyny dodać 1 μl roztworu stokowego cRb. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby otrzymać roztwór koniugatu cRb-awidyna (cRb-A).
  6. Usunąć niezwiązane małe cząsteczki i oczyścić cRb-A przy użyciu kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego.

3. Mikroskopia i oświetlenie światłem na poziomie subkomórkowym

  1. Poddaćy transfected komórki głodzeniu surowiczemu w DMEM bez FBS przez 12 godzin.
  2. Ostrożnie odessać pożywkę z komórek i dodać 250 μl przygotowanego 400 nM roztworu cRb-A (z kroku 2.6).
  3. W celu wizualizacji dynamiki białek w żywych komórkach z rozdzielczością subkomórkową przed i po naświetlaniu zastosowano mikroskopię dysku obrotowego (Ryc. 2a). Naświetlanie UV uzyskano poprzez połączenie optyki dla światła UV LED (365 nm) ze światłem epi-fluorescencyjnym (Ryc. 2b).
  4. Do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych transfected komórek co 15 sekund wykorzystano oprogramowanie MetaMorph.
  5. Zdefiniować współrzędne i rozmiar plamki naświetlania, używając szklanej płytki pokrytej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzanymi światłem UV. Rozmiar można zmieniać poprzez zastosowanie obiektywów o różnych powiększeniach oraz wybór światłowodów o różnej średnicy rdzenia.
  6. Po określeniu poziomu tła dla marszczenia błony (membrane ruffling), naświetlić światłem UV peryferie komórek. Dwa następne kroki służą skontrastowaniu wcześniejszych efektów lokalnych.
  7. Naświetlić komórki globalnie światłem 365 nm dostarczanym przez lampę rtęciową.
  8. Rozpuścić uwolnioną z klatki, a więc oryginalną rapamycynę w DMSO, a następnie w PBS (stężenie końcowe 400 nM), i dodać roztwór do komory obrazowania w celu wywołania efektów globalnych.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład reprezentatywnych wyników przedstawiono na Rysunku 3. Naświetlanie światłem UV niewielkiego obszaru w pobliżu krawędzi komórki szybko indukowalo tworzenie się lokalnych fałdów błony (ruffles) wyłącznie w obszarze naświetlanym i w jego bezpośrednim sąsiedztwie. Aby potwierdzić, że była to rzeczywiście aktywność lokalna, zastosowano następnie globalne naświetlanie komórek promieniami UV lub dodano rapamycynę do pożywki, co w obu przypadkach wywołało globalne tworzenie się fałdów w całej błonie. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej podzielono komórki docelowe na cztery kwadranty i policzono częstotliwość powstawania fałdów w każdym z nich po stymulacji lokalnej, a także po stymulacji globalnej w różnych warunkach, w tym w grupach kontrolnych (Rysunek 4). Tylko ta kombinacja naświetlania UV, cRb-A oraz odpowiednich konstruktów FKBP-FRB indukuje lokalne fałdowanie błony.

Schemat lokalnej dimeryzacji; proces chemiczny wyzwalany UV, struktury cRb-A i HE-Rapa, błona plazmatyczna.
Rysunek 1. Schemat przestrzennie ograniczonej dimeryzacji białek z wykorzystaniem koniugatu klatkowanej rapamycyny z awidyną (cRb-A) i światła UV. Naświetlanie UV rozrywa łącznik między rapamycyną a biotyną, co prowadzi do uwolnienia chemicznego dimeryzatora (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroksyetyl) rapamycyna) oraz jego produktu ubocznego. Uwolniony dimeryzator dyfunduje następnie do komórek i indukuje dimeryzację między FKBP-POI (białkiem badanym) a zakotwiczonym w błonie plazmatycznej FRB wyłącznie w sąsiedztwie obszaru naświetlanego (niebieskie koło). Bez naświetlania UV białka FKBP i FRB nie łączą się (czerwony krzyżyk), w związku z czym nie występuje żaden efekt. (Copyright@ACS2011) 6

Układ konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej; analiza wzbudzenia optycznego i emisji; schemat urządzenia.
Rycina 2. Zdjęcie zmodyfikowanego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. (a) Widok z przodu mikroskopu konfokalnego (odwrócony Axiovert 200, Zeiss). (b) Zbliżenie, widok z góry jednostki sprzęgającej dla fluorescencji EPI i oświetlenia UV.

Zmiana morfologii komórki na obrazach mikroskopowych wykazująca różnice strukturalne przed i po traktowaniu.
Rycina 3. Przestrzennie ograniczona formacja fałdów błonowych w transfekowanej komórce NIH3T3 indukowana lokalnym napromieniowaniem UV. Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórki fibroblasta NIH3T3 transfekowanej FKBP-Tiam1 (aktywator Rac) z etykietą YFP oraz LDR (zakotwiczone w błonie FRB), która została poddana napromieniowaniu w ograniczonym obszarze w pobliżu krawędzi światłem LED o długości fali 365 nm przez 15 s, zaczynając od 210 s, w obecności koniugatu cRb-A w medium. Po tym zabiegu nastąpiło ogólne naświetlanie lampą rtęciową przez 1 s w 1063 s oraz ogólna aplikacja rapamycyny do stężenia końcowego 400 nM w 1560 s. Komórka nie wykazywała niemal żadnej aktywności fałdowania na początku (a), lecz wykazała przestrzennie ograniczone fałdowanie po lokalnym naświetlaniu (żółte koło) (b). Komórka wykazała globalną formację fałdów po ogólnym naświetlaniu i dodaniu rapamycyny (c-d), co wskazuje, że lokalna formacja fałdów była spowodowana przestrzennie ograniczoną aktywacją Rac. Pasek skali: 10 μm. (Copyright@ACS2011) 6

Wykres słupkowy przedstawiający częstotliwość tworzenia fałdów (ruffles) w różnych warunkach UV dla traktowania cRb-A i awidyną.
Rycina 4. Częstotliwość tworzenia fałdów (ruffles) w kwadrantach transfektowanych komórek NIH3T3. Lokalną irradiację UV z użyciem cRb-A oraz następującą po niej globalną irradiację UV przeprowadzono na 13 komórkach. Dodanie cRb-A (bez irradiacji UV), lokalną irradiację UV z awidyną lub bez niej zastosowano odpowiednio na 13, 5 i 6 komórkach. W żadnej z obserwowanych komórek nie stwierdzono tworzenia fałdów po dodaniu cRb-A bez irradiacji UV, ani po lokalnej irradiacji UV z awidyną lub bez niej w medium zbiorczym. Dane zbierano z komórek o niskim podstawowym poziomie tworzenia fałdów, ale posiadających zdolność do tworzenia fałdów indukowanego rapamycyną, co sprawdzano po każdym eksperymencie, potwierdzając globalne tworzenie fałdów w wyniku dodania rapamycyny (stężenie końcowe 400 nM). Wyniki te wykazały, że cRb-A oraz lokalna irradiacja UV są niezbędne do lokalnego tworzenia fałdów w komórkach. (Copyright@ACS2011) 6

Skróty:

FKBP: białko wiążące FK506
FRB: białko wiążące FKBP-rapamycynę
Tiam1: białko 1 indukujące inwazję i przerzuty chłoniaka komórek T (Rac GEF)
LDR: linker Lyn-DSAG-FRB (Lyn: N-końcowe 11 aminokwasów kinazy Lyn)
HE-Rapa: C40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyna
cRb: klatkowana rapamycyna z grupą biotyny
cRb-A: cRb sprzężone z awidyną

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy technikę wykorzystującą nowy związek klatkowy (caged compound) wraz z systemem heterodimeryzacji FKBP-FRB w celu manipulowania aktywnością Rho GTPazy w precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej w skali czasu sekund.

Niniejsze podejście posiada trzy ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ metoda opiera się na zapobieganiu lub umożliwianiu dyfuzji dimeryzatora przez błonę plazmatyczną, docelowa lokalizacja komórkowa musi znajdować się w obrębie błony plazmatycznej lub jej bezpośrednim sąsiedz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badanie to było wspierane przez fundusze badawcze NIH (DK090868 oraz GM092930 dla T.I.). Wniosek patentowy dotyczący klatkowego analogu rapamycyny jest obecnie w toku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
  2. Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
  3. Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
  4. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
  5. Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
  6. Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
  7. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  8. Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
  9. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  10. Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  11. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
  12. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
  13. Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
  14. Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja indukowana wiat emheterodimeryzacja rapamycynyrapamycyna z fotoklatklokalizacja subkom rkowamanipulacja wiat em UVanaliza marszczenia b onykonfokalny mikroskop z dyskiem wiruj cymsystem FKBP FRBrekrutacja aktywatora RAC

Powiązane artykuły