Artykuł metodologiczny

Czasoprzestrzenna manipulacja aktywnością małej GTPazy na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

DOI:

10.3791/3794

⸱

9 marca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics, Johns Hopkins University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, 3Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę czasoprzestrzennej kontroli małej aktywności GTPazy za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB i systemach fotoklatkowania. Optymalizacja napromieniowania światłem umożliwia kontrolowaną przestrzennie i czasowo aktywację małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczna regulacja rodziny Rho małych trifosfataz guanozynowych (GTPaz) z dużą precyzją czasoprzestrzenną jest niezbędna dla różnych funkcji komórkowych i zdarzeń1, 2. Ich czasoprzestrzennie dynamiczna natura została ujawniona poprzez wizualizację ich aktywności i lokalizacji w czasie rzeczywistym3. Aby uzyskać głębsze zrozumienie ich roli w różnych funkcjach komórkowych na poziomie molekularnym, kolejnym krokiem powinno być zaburzenie aktywności białek w precyzyjnym miejscu i czasie subkomórkowym.

Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy metodę indukowanej światłem, czasoprzestrzennie kontrolowanej aktywacji małych GTPaz poprzez połączenie dwóch technik: (1) heterodimeryzacji FKBP-FRB indukowanej rapamycyną oraz (2) metody foto-klatki rapamycyny. Wykorzystując heterodimeryzację FKBP-FRB za pośrednictwem rapamycyny, opracowaliśmy metodę szybkiej indukcji aktywacji lub inaktywacji małych GTPaz, w tym Rac4, Cdc424, RhoA4 i Ras5, w których rapamycyna indukuje translokację GTPaz skonfundowanych przez FKBP lub ich aktywatorów do błony komórkowej, w której zakotwiczony jest FRB. W celu sprzężenia z tym systemem heterodimeryzacji opracowaliśmy również system foto-klatkowania analogów rapamycyny. Związek zamknięty w klatce to mała cząsteczka, której aktywność jest tłumiona przez fotorozszczepialną grupę ochronną, znaną jako grupa klatkowa. Aby całkowicie stłumić aktywność heterodimeryzacyjną, zaprojektowaliśmy rapamycynę w klatce, która jest przywiązana do makrocząsteczki w taki sposób, że powstały duży kompleks nie może przejść przez błonę plazmatyczną, co prowadzi do praktycznie zerowej aktywności tła jako chemicznego dimeryzatora wewnątrz komórek6. Rysunek 1 ilustruje schemat naszego systemu. Dzięki połączeniu tych dwóch systemów lokalnie zrekrutowaliśmy aktywator Rac do błony plazmatycznej w skali sekund i osiągnęliśmy indukowaną światłem aktywację Rac na poziomie subkomórkowym6.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfekcja plazmidowego DNA

  1. Dodać plazmidowe DNA, 0,5 μg FRB na uwięzi błonowej (dalej określane jako LDR) i 0,5 μg FKBP-Tiam1 (białko 1 wywołujące inwazję chłoniaka z komórek T i przerzuty) oznaczone białkiem fluorescencyjnym do 37,5 μl dH2O. Dodać 1 μl FuGENE HD.
  2. Wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przejdź do kroków 1.3-1.8.
  3. Umyj każdą studzienkę w komorze 8-dołkowej 50 μl poli-D-lizyny.
  4. Umyć środek każdej studzienki za pomocą dH2O.
  5. Trypsynizować 80-85% zlewających się komórek NIH-3T3 i rozcieńczyć do 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM z 10% FBS).
  6. Usunąć 375 μl zawiesiny i odwirować z prędkością 1750 obr./min przez 3 minuty.
  7. Zassać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  8. Dodaj 750 μl DMEM z 10% FBS i ponownie zawiesij.
  9. Dodaj zawiesinę komórkową do roztworu dH2O/DNA/FuGENE HD i delikatnie wymieszaj.
  10. Dodaj 250 μl zawiesiny komórek/DNA do każdej studzienki (wypełni do 3 dołków).
  11. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15-18 godzin.

2. Przygotowanie roztworu cRb-A

  1. Syntetyzuj addukt rapamycyny-biotyny w klatce (cRb). Szczegółowe informacje można znaleźć w "Syntetycznym schemacie cRb". Krótko mówiąc, ugrupowania w klatkach i biotyny są przygotowywane oddzielnie. Ugrupowanie w klatkach jest następnie sprzężone z rapamycyną (LC lab), a produkt jest następnie sprzężony z ugrupowaniem biotyny za pomocą reakcji kliknięcia7, aby uzyskać cRb.
  2. Przygotować 1 μM roztwór podstawowy cRb w DMSO.
  3. Rozpuścić 1 mg awidyny w 250 μl PBS w 0,5 ml probówki Eppendorfa.
  4. Dodać 1 μl roztworu podstawowego cRb do rozpuszczonej awidyny. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby otrzymać roztwór koniugatu cRb-awidyny (cRb-A).
  6. Wyklucz niezwiązane małe cząsteczki i oczyść cRb-A za pomocą kolumny wykluczającej rozmiar.

3. Mikroskopia i oświetlenie światłem na poziomie subkomórkowym

  1. Surowica głodze transfekowane komórki w DMEM bez FBS przez 12 godzin.
  2. Delikatnie odessać pożywkę z komórek i dodać 250 μl przygotowanego roztworu 400 nM cRb-A (od kroku 2.6).
  3. Aby zobrazować dynamikę białek w żywych komórkach w rozdzielczości subkomórkowej przed i po leczeniu światłem, wykorzystano mikroskopię wirującego dysku (ryc. 2a). Oświetlenie UV uzyskano poprzez sprzężenie układu optycznego dla światła UV LED (365 nm) ze światłem epifluorescencyjnym (ryc. 2b).
  4. Oprogramowanie MetaMorph zostało wykorzystane do przechwytywania obrazów fluorescencyjnych transfekowanych komórek co 15 sekund.
  5. Określ współrzędne i rozmiar plamki świetlnej za pomocą szklanej płytki pokrytej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzonymi światłem UV. Rozmiar można zmieniać, stosując soczewki obiektywowe o różnych powiększeniach oraz dobierając światłowody o różnych rozmiarach rdzenia.
  6. Po określeniu poziomów tła potargania błony, należy naświetlić światłem UV na obrzeżach komórek. Poniższe dwa kroki mają na celu skontrastowanie poprzedzających efektów zlokalizowanych.
  7. Globalnie naświetlaj ogniwa światłem o długości fali 365 nm dostarczanym przez lampę rtęciową.
  8. Rozpuść nieklatkowaną, a więc oryginalną rapamycynę w DMSO, a następnie w PBS (400 nM końcowy) i dodaj roztwór do komory obrazowania w celu wywołania globalnych efektów.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład reprezentatywnych wyników jest pokazany na rysunku 3. Naświetlanie światłem UV małego obszaru w pobliżu krawędzi komórkowej szybko indukowało powstawanie miejscowych falban tylko w napromieniowanym obszarze i w jego pobliżu. Aby potwierdzić, że jest to rzeczywiście aktywność lokalna, następnie globalnie napromieniowaliśmy komórki promieniowaniem UV lub dodaliśmy rapamycynę do pożywki masowej, co wywołało globalne powstawanie falban w całej błonie. Do analizy ilościowej podzieliliśmy komórki docelowe na cztery ćwiartki i policzyliśmy częstotliwość powstawania falban w każdym kwadrancie po lokalnej i następującej po globalnej stymulacji w różnych warunkach, w tym w grupie kontrolnej (ryc. 4). Tylko ta kombinacja promieniowania UV, cRb-A i odpowiednich konstruktów FKBP-FRB indukuje miejscowe marszczenie.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat ograniczonej przestrzennie dimeryzacji białek przy użyciu koniugatu rapamycyny-awidyny w klatce (cRb-A) i światła UV. Promieniowanie UV rozszczepia łącznik między rapamycyną a biotyną, powodując uwolnienie chemicznego dimeryzatora (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyny) i jego produktu ubocznego. Uwolniony dimeryzator następnie dyfunduje do komórek i indukuje dimeryzację między FKBP-POI (białkiem zainteresowania) a FRB zakotwiczonym w błonie plazmatycznej tylko w pobliżu napromieniowanego obszaru (niebieskie kółko). Bez naświetlania promieniowaniem UV FKBP i FRB nie łączą się (czerwony krzyż), a więc nie wywołują żadnego efektu. (Copyright@ACS2011) 6

figure-protocol-2
Rysunek 2. Zdjęcie dostosowanego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. (a) Widok z przodu mikroskopu konfokalnego (odwrócony Axiovert 200, Zeiss). b) Zbliżenie, widok z góry na jednostkę sprzęgającą do fluorescencji EPI i oświetlenia UV.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przestrzennie ograniczone tworzenie się falban w transfekowanej komórce NIH3T3 indukowane przez miejscowe promieniowanie UV. Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórki fibroblastu NIH3T3, która jest transfekowana znakowanym YFP FKBP-Tiam1 (aktywator Rac) i LDR (FRB zakotwiczony w błonie) zostały poddane naświetlaniu w ograniczonym obszarze w pobliżu jego krawędzi światłem LED o długości fali 365 nm przez 15 sekund, zaczynając od 210 sekund w obecności koniugatu cRb-A w pożywce masowej. Po tym zabiegu przeprowadzono globalne oświetlenie lampą rtęciową przez 1 sekundę po 1063 sekundach i globalne dodanie rapamycyny końcowej 400 nM po 1560 sekundach. Komórka nie wykazywała prawie żadnej aktywności falbowania na początku (a), ale wykazywała przestrzennie ograniczone marszczenie po miejscowym oświetleniu (żółte kółko) (b). Komórka wykazała globalne tworzenie się falbanów po globalnym oświetleniu i dodaniu rapamycyny (c-d), co wskazuje, że lokalne tworzenie się falban było spowodowane przestrzennie ograniczoną aktywacją Rac. Podziałka: 10 μm. (Copyright@ACS2011) 6

figure-protocol-4
Rysunek 4. Częstość powstawania falban w kwadrantach transfekowanych komórek NIH3T3. Miejscowe naświetlanie promieniowaniem UV cRb-A i następujące po nim globalne naświetlanie promieniowaniem UV przeprowadzono na 13 komórkach. Dodatek cRb-A (brak promieniowania UV), miejscowe naświetlanie UV z awidyną lub bez awidyny zastosowano odpowiednio na 13, 5 i 6 komórkach. Żadna z obserwowanych komórek nie wykazywała tworzenia się falban z cRb-A bez promieniowania UV lub miejscowym napromieniowaniem UV z lub bez awidyny w pożywkach masowych. Zebraliśmy dane z komórek o niskim poziomie tworzenia falban tła, ale które miały zdolność do tworzenia falban indukowanych rapamycyną, które sprawdzaliśmy po każdym eksperymencie, potwierdzając globalne tworzenie się falban w wyniku dodania rapamycyny (końcowe 400 nM). Wyniki te wykazały, że cRb-A i miejscowe promieniowanie UV są niezbędne do miejscowego tworzenia się falban w komórkach. (Copyright@ACS2011) 6

Skróty:

FKBP: białko wiążące FK506
FRB: białko wiążące FKBP-rapamycynę
Tiam1: Inwazja chłoniaka z komórek T i białko indukujące przerzuty 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-końcowe 11 aminokwasów kinazy Lyn)
HE-Rapa: C40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyna
cRb: rapamycyna w klatce z grupą biotyny
cRb-A: cRb sprzężony z awidyną

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy technikę, która wykorzystuje nowy związek w klatce wraz z systemem heterodimeryzacji FKBP-FRB w celu manipulowania aktywnością GTPazy Rho w precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej w skali sekund.

Obecne podejście ma trzy ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ metoda opiera się na zapobieganiu lub umożliwianiu dyfuzji dimeryzatora przez błonę plazmatyczną, docelową lokalizacją komórkową musi być błona plazmatyczna lub jej okolice. Dalsza optymalizacja struktury chemicznej cRb może pozwol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez fundusze badawcze NIH (DK090868 i GM092930 T.I.). Istnieje wniosek o opatentowanie analogu rapamycyny w klatce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
  2. Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
  3. Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
  4. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
  5. Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
  6. Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
  7. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  8. Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
  9. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  10. Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  11. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
  12. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
  13. Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
  14. Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Small GTPase ActivityLight Induced ActivationRapamycin HeterodimerizationPhoto Caged RapamycinSubcellular LocalizationUV Light ManipulationMembrane Ruffling AnalysisSpinning Disc ConfocalFKBP FRB SystemRAC Activator Recruitment

Powiązane artykuły