Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3823

⸱

2 kwietnia 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

Streszczenie

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających zdarzeń reaktywacji, które zapewniają transmisję wirusa i przyczyniają się do rozwoju choroby klinicznej. Obecne leki przeciwwirusowe nie wpływają na rezerwuar latentny, a szczepionki nie istnieją. Podczas gdy molekularne szczegóły replikacji litycznej są dobrze opisane, mechanizmy kontrolujące latencję w neuronach pozostają nieznane. Nasza obecna wiedza na temat latencji pochodzi z badań in vivo z wykorzystaniem modeli małych zwierząt, które były niezbędne do określenia wymagań genetycznych wirusa oraz roli odpowiedzi immunologicznych. Niemniej jednak w żywych zwierzętach nie jest możliwe odróżnienie specyficznych efektów wpływających na relację wirusa z neuronem od bardziej ogólnych konsekwencji infekcji pośredniczonych przez komórki odpornościowe lub nie-neuronalne komórki wspierające. Ponadto eksperymenty na zwierzętach są kosztowne, czasochłonne i ograniczone pod kątem dostępnych opcji manipulowania procesami gospodarza. Aby pokonać te ograniczenia, niezbędny jest system oparty wyłącznie na neuronach, który odtwarzałby charakterystykę latencji i reaktywacji in vivo, oferując jednocześnie zalety hodowli tkankowej w zakresie homogeniczności i dostępności.

Przedstawiamy tutaj model in vitro z wykorzystaniem hodowli pierwotnych neuronów sympatycznych z górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) (Ryc. 1) do badania latencji i reaktywacji HSV-1, który spełnia większość, jeśli nie wszystkie, pożądane kryteria. Po usunięciu komórek nieneuronalnych, niemal jednorodne hodowle neuronów TrkA+ są zakażane HSV-1 w obecności acyklowiru (ACV) w celu zahamowania replikacji litycznej. Po usunięciu ACV efektywnie ustanawiane są nieproduktywne infekcje HSV-1, które wiernie wykazują uznane cechy latencji. Co istotne, lityczne mRNA, białka i wirusy zakaźne stają się niewykrywalne, nawet w przypadku braku selekcji, natomiast ekspresja transkryptu związanego z latencją (LAT) utrzymuje się w jądrach neuronów. Genomy wirusowe są utrzymywane w średniej liczbie 25 kopii na neuron i mogą zostać indukowane do replikacji produktywnej poprzez zakłócenie sygnalizacji PI3-Kinazy / Akt lub proste odstawienie czynnika wzrostu nerwów1. Rekombinowany HSV-1 kodujący EGFP połączone z wirusowym białkiem litycznym Us11 zapewnia funkcjonalny marker replikacji wynikającej z reaktywacji w czasie rzeczywistym, który można łatwo skwantyfikować. Oprócz zabiegów chemicznych, w systemie tym można z powodzeniem zastosować metodologie genetyczne, takie jak interferencja RNA lub dostarczanie genów za pomocą wektorów lentiwirusowych, co umożliwia badania mechanistyczne, które są bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe, do przeprowadzenia na zwierzętach. Podsumowując, system latencji / reaktywacji HSV-1 oparty na SCG stanowi potężne i niezbędne narzędzie do odkrycia molekularnych mechanizmów kontrolujących latencję i reaktywację HSV-1 w neuronach – odnośnej długotrwałej zagadki w wirusologii, której rozwiązanie może dostarczyć nowych spostrzeżeń w opracowywaniu nowych terapii celujących w latentny rezerwuar herpeswirusa.

Protokół

1. Izolacja i hodowla neuronów z zwojówczennych górnych (SCG) z embrionów szczura

W celu zapewnienia przydatnego kontekstu dla zrozumienia niniejszego protokołu oraz dla wyczerpującego omówienia wcześniejszej literatury ustanawiającej metody hodowli neuronów SCG, w tym podstaw hodowli SCG in vitro, podłoży do powlekania płytek oraz składników pożywek bezsurowiczych, czytelnika odsyła się do referencji2-4.

  1. Wykorzystanie szczurów jako źródła neuronów SCG przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH w ramach aktywnego protokołu zatwierdzonego przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Laboratoryjnych (IACUC).
  2. Przed rozpoczęciem dysekcji należy przygotować 96-dołkowe naczynia hodowlane pokryte kolagenem i lamininą. Używając pipety wielokanałowej, należy napełnić wszystkie 96 dołków roztworem zawierającym 0,66 mg / ml kolagenu z ogona szczura. Natychmiast usunąć kolagen, który można odzyskać i wykorzystać do 8 dysekcji. Po usunięciu kolagenu bardzo ważne jest pozostawienie dołków do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Czas schnięcia zależy od liczby dołków w naczyniu. Na przykład wyschnięcie dołków w naczyniu 96-dołkowym zajmuje zazwyczaj około 5-10 min, ale może trwać do 30 - 40 min w przypadku użycia większego naczynia 24-dołkowego. Niewłaściwe wysuszenie dołków prowadzi do słabej adhezji SCG. Następnie należy powtórzyć procedurę, używając roztworu 2 μg / ml lamininy. Inkubować roztwór lamininy przez co najmniej 2 hr w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze CO2 aż do momentu wysiewania neuronów (krok 1.14).
  3. Zakupione komercyjnie ciężarne samice szczurów poddaje się eutanazji za pomocą CO2. Po spryskaniu ciała 70% etanolem wykonuje się nacięcie w kształcie litery U wokół brzucha. Po odchyleniu skóry wykonuje się drugie nacięcie w kształcie litery U przez ścianę mięśniową brzucha. Macica staje się widoczna po uniesieniu warstwy mięśni brzucha. Należy usunąć macicę i umieścić ją w naczyniu o średnicy 15 cm. Ostrożnie otworzyć macicę za pomocą tępych nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia płodów. Każdy płód musi zostać uwolniony z pęcherzyka zarodkowego, pępowina przecięta, a płód oczyszczony 70% etanolem i chusteczkami Kimwipes.
  4. Pracując pod dysekcyjną komorą laminarną, uśmiercić nienarodzone płody szczura w 21. dniu embrionalnym (E21) poprzez oddzielenie głowy od tułowia. Nożyczki należy skierować w podstawę szyi, tuż nad barkami. Aby odsłonić zwoje, należy przypiąć głowę (stroną szyi do góry) za pomocą igieł 23 G w trzech miejscach: i) rdzeń kręgowy; ii) przednia skóra odciągnięta nad nosem i przypięta; iii) przełyk / tchawica muszą być odciągnięte i przypięte z dala od podstawy szyi.
  5. Zlokalizować dwa SCG* znajdujące się po obu stronach rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej (dwa SCG na jeden embrion). SCG znajduje się bezpośrednio pod rozgałęzieniem. Oddzielić SCG od tętnic, rozsuwając rozwidlenie. Umieścić zwoje w 12 ml pożywki L15 (uzupełnionej o 0,4% D(+)-glukozy) w 15 ml probówce stożkowej na lodzie.

*SCG jest półprzezroczysty i bezbarwny w porównaniu z nieprzezroczystą, żółtawą tkanką tłuszczową otaczającą rozwidlenie. Przed pobraniem zwojów należy starać się usunąć jak najwięcej pozostałej tkanki tłuszczowej oraz naczyń krwionośnych.*

  1. Powtarzać kroki 1.4 i 1.5 do czasu pozyskania wszystkich SCG z embrionów.
  2. Ostrożnie wirować zwoje przez 1 min przy 600 rpm, a następnie odessać nadmiar pożywki.
  3. Resuspender zwoje w 1 ml pożywki L15 zawierającej trypsynę (0,25%, bez EDTA) i kolagenazę (1 mg/ml). Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C, mieszając co 10 min.
  4. Dodać 10 ml pożywki C (1x MEM, 0,4% D(+)-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 10% FBS), aby dezaktywować trypsynę, i wirować przez 1 min przy 600 rpm.
  5. Usunąć jak największą ilość pożywki z trypsyną/kolagenazą* i przemyć zwoje 10 ml pożywki C. Wirować przez 1 min przy 600 rpm. Powtórzyć ten krok raz.

*Pozostałości kolagenazy będą zakłócać działanie podłoża kolagenowego niezbędnego do przyкрепienia komórek do płytki hodowlanej.

  1. Usunąć medium płuczące i resuspender zwoje w 1 ml C-media, a następnie przeprowadzić triturację za pomocą igły 21 G przymocowanej do strzykawki 5 ml, aby rozbić duże skupiska komórek*. Kontynuować triturację igłą 23 G aż do momentu rozbicia widocznych skupisk.

*Należy uważać, aby nie przesadzić z tryturacją, ponieważ może to uszkodzić komórki. Jeśli obróbka trypsyną i kolagenazą przebiegła pomyślnie, wystarczające powinno być maksymalnie piętnaście cykli zasysania i wypychania igłą 21 G oraz trzy cykle igłą 23 G.

  1. Przefiltruj rozdzielone neurony przez nylonowy filtr 70 μm [BD Biosciences cell strainer] do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aby usunąć wszelkie pozostałe skupki komórek.
  2. Pobierz 10 μl alikwot przefiltrowanej zawiesiny komórkowej i wymieszaj z błękitem trypanowym w celu określenia liczby żywych komórek. Policz liczbę komórek, które aktywnie wykluczają barwnik, używając komory hemocytometrycznej.
  3. Usuń roztwór lamininy z płytek 96-dołkowych oczekujących w inkubatorze w temperaturze 37 °C (patrz KROK 1.2). Nie wysuszaj płytki; można jej użyć niezwłocznie do wysiewu komórek po usunięciu lamininy. Rozdziel* 5 000-6 000 łącznie żywych komórek (50 - 100 μl na dołek) do płytki hodowlanej 96-dołkowej uprzednio pokrytej kolagenem i lamininą. Dodaj 50 ng / ml czynnika wzrostu nerwów (NGF) do pożywki C-media.

*Kluczowe jest stosowanie prawidłowej, sterylnej techniki hodowli tkanek, ponieważ z pożywki wzrostowej pominięto antybiotyki. Ponadto może występować znaczna zmienność kolagenu pochodzącego od różnych dostawców. Uzyskiwaliśmy spójne wyniki w różnych partiach, stosując kolagen z ogona szczura firmy Millipore.

  1. W dniu DIV (day in vitro) 1 zastąpić pożywkę C użytą do wysiewu komórek 50 μl NBM (0,4% D(+)-glucose, 2 mM L-glutamine, suplement B-27 zawierający 50 ng/ml NGF, 5 μM aphidicolin oraz 20 μM 5-fluorouracil [5-fluoro-2'-deoxyuridine]). Inkubować kultury przez 5 dni*. Na tym etapie można przeprowadzić trypsynizację i policzyć komórki pozostałe w kilku studzienkach, aby określić liczbę neuronów, które przeżyły działanie czynnika antymitotycznego. Typowo w płytce 96-dołkowej pozostaje około 1 000 neuronów na studzienkę.

*Problemy z kontaminacją grzybiczą lub bakteryjną są zazwyczaj widoczne w ciągu pierwszych 24 h hodowli. Przed wymianą pożywki należy dokładnie sprawdzić każdą studzienkę pod kątem wzrostu drobnoustrojów. Jeśli problem dotyczy tylko ograniczonej liczby studni, można je potraktować rozcieńczonym roztworem wybielacza, wypłukać PBS i wysuszyć, aby kontynuować eksperyment. Zalecamy powtórzenie każdego eksperymentu, w którym wystąpiła kontaminacja mikrobiologiczna, nawet w niewielkiej liczbie studni. W przypadku stwierdzenia rozległej kontaminacji mikrobiologicznej w płytce 96-dołkowej należy przerwać eksperyment.

2. Zakażanie kultur SCG wirusem HSV-1 Us11-EGFP i ustanawianie latencji

W celu zapoznania się z przydatnymi informacjami na temat technik wirusologicznych, w tym podstawowej propagacji wirusów, określania miana wirusa oraz wielokrotności infekcji (MOI), czytelnik może odnieść się do publikacji5. W kwestii biologii herpeswirusów zaleca się zapoznanie z publikacją6. Na koniec, odnośnie poprzednich przykładów, innych protokołów oraz dodatkowych informacji dotyczących litycznej infekcji neuronów SCG przez alfa-herpeswirusy, a także w celu porównania z adaptacjami naszego protokołu do badania latencji i reaktywacji, czytelnik może odnieść się do publikacji7-10.

  1. W 6. dobie in vitro (DIV 6) dodaj acyklowir (ACV) do obecnej pożywki w każdej studzience, tak aby stężenie końcowe wynosiło 100 μM*. Na przykład, jeśli każda studzienka zawiera 50 μl, dodaj 25 μl roztworu zapasowego ACV o stężeniu 300 μM. Zazwyczaj ACV dodaje się w noc poprzedzającą infekcję, ale można go również podać na 6–8 h przed infekcją.

*Jest wyjątkowo ważne, aby w każdym momencie ograniczać niepotrzebną manipulację fizyczną neuronem. Samą wymianę pożywki lub zakażanie zapasami wirusa należy przeprowadzać bardzo delikatnie i powoli. W przeciwnym razie powstały stres mechaniczny może negatywnie wpłynąć na żywotność neuronów.

  1. W 7. dniu in vitro (DIV 7) zainfekuj hodowle SCG wirusem HSV-1 Us11-EGFP (opisanym w ref11) przy wielokrotności infekcji (MOI) w zakresie 1–2 (patrz poniższy ważny komentarz dotyczący wyznaczania optymalnego MOI)*. Dodaj rozcieńczonego wirusa bezpośrednio do istniejącej pożywki w dołku. Uwzględnij kontrolę mock-infected oraz dodatnią kontrolę infekcji litycznej w pożywce bez ACV. Pozostaw próbki do toku infekcji przez 2-3 hr w temperaturze 37 °C.

*MOI oblicza się na podstawie miana wirusa wyznaczonego poprzez test plackowy w komórkach Vero12 oraz liczby wysianych żywych komórek na dołek w kroku 1.14. Obliczenie to jest przydatne jedynie w sensie operacyjnym, ponieważ całkowita liczba wysianych komórek obejmuje neurony wraz z zanieczyszczającymi je glejem i fibroblastami. Ponieważ te zanieczyszczające dzielące się komórki są usuwane poprzez traktowanie środkami antymitotycznymi, efektywne MOI dla przeżyjących neuronów jest w rzeczywistości wyższe. Z początkowej liczby 5,000 - 6,000 żywych komórek, po zastosowaniu środków antymitotycznych pozostaje około 1,000 neuronów (co oceniono poprzez trypsynizację i bezpośrednie liczenie komórek). Optymalne MOI do stosowania podczas infekowania kultur neuronalnych może nieco różnić się w zależności od preparatu zapasu wirusa. Przy każdym nowym preparacie wirusa zalecamy przetestowanie ograniczonego zakresu różnych wartości MOI od 1 do 2. Celem jest zidentyfikowanie takiej wartości, która wywiera najmniejszy wpływ na żywotność neuronów i skutkuje największą liczbą zdarzeń indukowanej reaktywacji (zdefiniowanych w sekcji 3). Wirus Us11-EGFP jest szczególnie pomocny w szybkiej optymalizacji warunków, ale można również stosować inne metody odczytu, takie jak test plackowy lub ilościowy PCR. Pomocne może być zastosowanie wirusa oczyszczonego za pomocą poduszki sacharozowej w celu usunięcia zanieczyszczeń obniżających żywotność komórek, choć nie jest to niezbędne i nie jest wykonywane rutynowo.

  1. Ostrożnie zastąp podłoże do infekcji świeżym NBM zawierającym 50 ng / ml NGF oraz 100 μM ACV*.

*Niezwykle ważne jest, aby zachować maksymalną ostrożność podczas wymiany pożywki infekcyjnej. Należy skierować końcówkę pipety na ściankę dołka, a nie na jego dno, i pozwolić pożywce powoli spłynąć na komórki. Nawet szybkie wypchnięcie pożywki z pipety może wygenerować siłę wystarczającą do odczepienia aksonów od podłoża, co zazwyczaj powoduje odwarstwienie komórek w formie płata. Jeśli odczepi się tylko ograniczona liczba neuronów (20-30%), konsekwencje są minimalne, pod warunkiem, że komórki wyglądają na zdrowe. Odczepione neurony prawdopodobnie z czasem przywrą ponownie; jednak aksony nie będą już prawidłowo wyciągnięte i wyrosną nowe aksony. Choć nie jest to rozwiązanie optymalne, eksperyment może być kontynuowany, jeśli problem dotyczy tylko ograniczonej liczby dołków. W przypadku rozległego odczepienia neuronów (70-80%), nie zalecamy włączania dotkniętych dołków do eksperymentu. Jeśli w większości dołków odczepiło się 70-80% neuronów, zalecamy przerwanie eksperymentu.Mimo że neurony mogą ponownie przywrzeć, zazwyczaj tworzą one duże skupiska. Utrudnia to prawidłową ocenę poszczególnych reaktywowanych neuronów. Zalecamy powtórzenie każdego eksperymentu, w którym zaobserwowano dołki z odczepionymi neuronami, aby upewnić się, że wskaźniki reaktywacji nie zostały pod wpływem różnic w adhezji neuronów do dołków.

Dodatkowo kluczowe jest to, aby zawsze obchodzić się z kulturami jak najdelikatniej. Stres mechaniczny wynikający z niepotrzebnych, gwałtownych ruchów (w tym wielokrotnego otwierania i zamykania drzwi komory inkubatora) lub siłowego aplikowania pożywki może upośledzić zdolność kultur do utrzymywania latencji HSV-1, co może prowadzić do niedopuszczalnie wysokiego poziomu spontanicznej reaktywacji w danym eksperymencie.

  1. Utrzymywać hodowle przez 6 dni, podczas których wirus przejdzie w stan latencji. W tym okresie należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania stanu zdrowia neuronów oraz ekspresji Us11-EGFP jako wskaźnika replikacji litycznej. Us11-EGFP powinien być wykrywalny WYŁĄCZNIE w studzienkach kontrolnych bez zastosowania ACV, co wskazuje na przebieg prawidłowej infekcji pierwotnej i produktywną replikację lityczną. Neurony mogą wykazywać efekty cytopatyczne nawet przy braku produktywnego wzrostu wirusa. Zainfekowane hodowle powinny być ściśle monitorowane i porównywane z neuronami poddanymi infekcji pozorowanej.

3. Reaktywacja i ocena

  1. W 14. dniu in vitro (DIV 14) ostrożnie zastąp pożywkę zawierającą ACV świeżą pożywką pozbawioną ACV. Jeśli jest to właściwe, wprowadź w tym czasie zmienne farmakologiczne (lub biologiczne). Należy pamiętać o przestrzeganiu środków ostrożności określonych w punkcie 2.3.
  2. W okresie od 5 do 6 dni monitoruj żywe kultury za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć neurony przechodzące reaktywację. Alternatywnie pobierz próbki do innych rodzajów analiz (białek, kwasów nukleinowych, testu plackowego itp.).
  3. Oblicz częstotliwość reaktywacji, licząc liczbę studzienek zawierających neurony dodatnie pod kątem EGFP, i wyraź tę wartość jako proporcję całkowitej liczby studzienek z próbkami. Należy zauważyć, że ekspresja EGFP w pojedynczej studzience nie pozwala odróżnić pierwotnego zdarzenia reaktywacji od późniejszej infekcji wynikającej z rozprzestrzeniania się wirusa. Ponieważ rozprzestrzenianie zakaźne jest ograniczone do jednej studzienki z kulturą, obecność jednego lub więcej neuronów EGFP-dodatnich w studzience jest w tych warunkach operacyjnie definiowana jako jedno zdarzenie reaktywacji.

*W kulturze mogą wystąpić wielokrotne zdarzenia reaktywacji, jak opisano w1. Aby odróżnić pierwotne zdarzenie reaktywacji od rozprzestrzeniania się wirusa wynikającego z reaktywacji, można dodać inhibitor enkapsydacji WAY-150138. Poprzez blokowanie enkapsydacji nie powstaje zakaźny wirus, a rozprzestrzenianie się wynikające z reaktywacji staje się niemożliwe. W związku z tym sygnał EGFP wykryty w obecności WAY-150138 odzwierciedla liczbę niezależnych zdarzeń reaktywacji w obrębie pojedynczej studni hodowlanej1,13-15. Należy pamiętać, że WAY-150138 jest skuteczny wyłącznie przeciwko szczepowi HSV-1 Patton i nie jest dostępny w sprzedaży. Jako alternatywę dla WAY-150138 można rozważyć następujące opcje: i) wykorzystanie wirusa mutantowego o upośledzonej zdolności do rozprzestrzeniania się na sąsiednie komórki; ii) zastosowanie wirusa reporterowego, w którym EGFP jest ekspresyjny z promotora IE przy ciągłej obecności ACV; iii) traktowanie PAA lub ACV w celu zapobiegania ekspresji późnych genów (i produkcji zakaźnego wirusa), a następnie przeprowadzenie immunofluorescencji z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko produktowi genu IE.

4. Alternatywne metody oceny reaktywacji z wykorzystaniem testu

Wyniki z pojedynczego, indywidualnego eksperymentu powinny być uzyskiwane z jednej partii preparatu SCG. Eksperymenty powtórzone można przeprowadzać z niezależnymi preparatami SCG, pod warunkiem, że każde powtórzenie zostało wykonane przy użyciu pojedynczej partii SCG.

  1. Ocena transkrypcji litycznej HSV-1. Należy zebrać RNA w wybranych punktach czasowych po usunięciu ACV, w obecności lub przy braku różnych eksperymentalnych induktorów reaktywacji. W przypadku stosowania płytek hodowlanych 96-dołkowych zaleca się łączenie co najmniej 20 dołków dla każdej próbki (około 105 komórek na próbkę RNA). Alternatywnie, SCG można wysiać w większych dołkach (np. w płytce 24-dołkowej użyć 4-5 x104 komórek/dołek). Choć możliwe jest wykrycie RNA z mniej niż 20 dołków, małe objętości prowadzą do nieuzasadnionej zmienności między próbkami.
  2. Wykrywanie białek litycznych HSV-1. Należy zebrać lizaty w wybranym czasie po indukcji reaktywacji. Do każdego z 10 dołków w płytce 96-dołkowej należy dodać 7,5 μl buforu do lizy, a następnie przeprowadzić analizę za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Alternatywnie, białka wirusowe można wykryć metodą pośredniej immunofluorescencji. Pierwotny wysiew musi zostać wykonany na podłożu umożliwiającym obrazowanie, takim jak sterylna szklana lamella, która została uprzednio pokryta poli-D-lizyną (0,2 mg/ml, Sigma) przed aplikacją kolagenu i lamininy (patrz 1.10).
  3. Wykrywanie cząsteczek zakaźnych. Należy zebrać supernatant hodowli po reaktywacji. Należy wykonać test plackowy na monowarstwach komórek Vero, wykorzystując rozcieńczenia seryjne supernatantu. Dodatkowo testy plackowe można przeprowadzić z użyciem lizatów kultur poddanych zamrażaniu i rozmrażaniu, aby uwzględnić cząsteczki związane z komórkami w celu oznaczenia miana.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2A przedstawia przykład, w którym 1 μM trichostatyny A (TSA), znanego induktora reaktywacji16-18, zastosowano do kultur SCG z latentną infekcją szczepu reporterowego HSV1 EGFP-Us11 typu dzikiego. Przy zastosowaniu TSA reaktywacja osiąga 50% wartości maksymalnej w ciągu 2 dni, a do 5 dnia stabilizuje się na poziomie około 60% studni. Poziom bazowej reaktywacji („spontanicznej”) w tym eksperymencie wynosi około 10% i zazwyczaj mieści się w zakresie 10-20% w tym systemie in vitro. Maksymalne poziomy reaktywacji różnią się w zależności od zastosowanego induktora reaktywacji. Wiele induktorów reaktywacji można stosować przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ nie zakłócają one produkcyjnej replikacji wirusa, jednak musi to zostać określone empirycznie. Inne induktory, w tym każdy odczynnik wpływający na żywotność neuronów lub utrudniający zakończenie produkcyjnego cyklu życiowego wirusa, mogą wymagać krótkotrwałej aplikacji impulsowej w celu wywołania reaktywacji.

Chociaż akumulacja EGFP-Us11 w każdej studni eksperymentu przedstawionego na Rysunku 2A wskazuje na reaktywację z latentności, nie pozwala ona rozstrzygnąć, czy sygnał Us11-EGFP w pojedynczych neuronach pochodzi z niezależnego zdarzenia reaktywacji, czy z rozprzestrzeniania się reaktywowanego wirusa w hodowli. Aby ocenić liczbę neuronów przechodzących niezależne zdarzenia reaktywacji w każdej studni, hodowle poddano wstępnej obróbce związkiem WAY-150138, który specyficznie blokuje rozprzestrzenianie się wirusa poprzez zapobieganie enkapsydacji wirusowego genomu DNA13-15. Zainfekowane hodowle neuronów współczulnych potraktowano związkiem WAY-150138, a reaktywację indukowano za pomocą TSA. Znaczną liczbę neuronów wykazujących pozytywny wynik dla EGFP wykryto wyłącznie w studniach traktowanych TSA w porównaniu z hodowlami kontrolnymi traktowanymi DMSO, co dowodzi, że w pojedynczej hodowli zachodzi szereg niezależnych zdarzeń reaktywacji (Rysunek 2B).

W naszym teście reporter Us11-EGFP jest ekspresowany z endogennego promotora Us1111. Ponieważ Us11 jest „prawdziwie późnym” genem litycznym wirusa (typ γ2), do silnej ekspresji wymagana jest replikacja viralnego DNA. Zostało to przedstawione na Rysunku 3, gdzie akumulacja EGFP-Us11 jest upośledzona przez fosfonowocetową kwas (PAA), inhibitor polimerazy DNA wirusa, w kulturach indukowanych do reaktywacji inhibitorem kinazy PI3 LY294002.

Schemat eksperymentu z hodowlą komórek szczura; wycięcie SCG, infekcja GFP-HSV1, usunięcie ACV, zielone studzienki.
Rycina 1. Schemat ilustrujący typowy protokół eksperymentalny z wykorzystaniem systemu hodowli neuronów in vitro do badania latencji i reaktywacji HSV-1. 1) Po wycięciu zwojów szyjnych górnych (SCG) od szczurów w 21. dniu embrionalnym (E21), zdysocjowane neurony wysiewa się do płytek 96-dołkowych i traktuje środkami antymitotycznymi w celu usunięcia komórek nieneuronalnych. 2) Po 6 dniach in vitro (DIV) kultury infekuje się rekombinowanym HSV-1 zawierającym EGFP połączone z kodowanym przez wirusa późnym genem Us11 (EGFP-HSV-1) w obecności acyklowiru (ACV), leku przeciwwirusowego, który blokuje replikację lityczną. 3) W 14. dniu (DIV 14) acyklowir jest usuwany, a ekspresja EGFP nie jest wykrywana. Kultury mogą być w ten sposób stabilnie utrzymywane przez miesiąc lub dłużej, bądź można dodać zmienną testową, aby ocenić jej zdolność do wywołania reaktywacji z latencji. Zmienna ta może mieć postać małocząsteczkowego inhibitora chemicznego, przeciwciała przeciwko rozpuszczalnej neurotrofinie lub białku powierzchniowemu komórki, albo lentiwirusa wykazującego ekspresję specyficznego dla genu shRNA lub białka ekspresowanego ektopowo. Reaktywację monitoruje się następnie poprzez ocenę liczby studzienek pozytywnych pod kątem EGFP w czasie rzeczywistym.

Analiza ekspresji GFP; wykresy liniowe porównujące traktowanie TSA i DMSO; wyniki eksperymentu.
Rycina 2. TSA reaktywuje HSV-1 w kulturach SCG. Kultury SCG zostały zainfekowane latentnie zgodnie z opisem w Rycini 1. W 14. dniu in vitro (DIV 14) ACV usunięto i zastąpiono medium zawierającym 1 μM trichostatyny A (TSA). (A) Kultury wizualizowano i oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej każdego dnia po podaniu leku przez okres 5 dni. Przedstawiono procent studni ulegających reaktywacji w trakcie eksperymentu w porównaniu do kultur kontrolnych traktowanych DMSO. Procent reaktywacji obliczono na podstawie liczby studni pozytywnych pod kątem EGFP z 20 studni na 96-dołkowej płytce hodowlanej. Słupki błędu wskazują standardowy błąd średniej. (B) Latentnie zainfekowane kultury traktowano TSA oraz inhibitorem enkapsydacji wirusowego DNA, WAY-150138 (20 μg/ml). Liczbę neuronów EGFP+ porównano 48 h po podaniu leków z kontrolą traktowaną DMSO i WAY-150138. Każdy punkt danych reprezentuje stosunek neuronów EGFP+ do 1 000 neuronów w studni hodowlanej. Słupek przedstawia średni procent neuronów EGFP+ w studni.

Wykres reaktywowanych studzienek, wyniki analizy GFP dla traktowania LY, PAA oraz LY/PAA w ciągu 5 dni.
Rysunek 3. Detekcja EGFP zależy od replikacji viralnego DNA. Hodowle SCG zostały zainfekowane latentnie, a następnie poddane działaniu 10 μM LY29004, znanego induktora reaktywacji 1. Reaktywację wywołaną przez LY (kolor niebieski) porównano z reaktywacją po zastosowaniu inhibitora syntezy viralnego DNA, kwasu fosfonooctowego (PAA) (300μg/ml, kolor czerwony) oraz obu związków jednocześnie (kolor zielony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten system hodowli i infekcji pierwotnych neuronów stanowi prostą i skuteczną metodę badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw latencji i reaktywacji HSV-1. System ten wiernie odwzorowuje uznane cechy latencji zdefiniowane zarówno w infekcjach u ludzi, jak i w modelach zwierzęcych. Gdy wirus znajduje się w stanie latencji w hodowlach SCG, nie można wykryć cząstek zakaźnych ani produktów litycznych genów wirusowych. Jedynym wykrywanym produktem genu wirusowego w neuronach z latentną infekcją je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy recenzentom za ich wnikliwe sugestie, które pomogły ulepszyć niniejszy manuskrypt. Praca ta była wspierana przez granty przyznane MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) oraz IM (AI073898, GM056927) przez NIH. MK otrzymał częściowo wsparcie z grantu szkoleniowego NIH (5T32 AI007180).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70μfiltr nylonowy (sito do komórek)BD Biosciences352350
1x roztwór Hanksa’zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)-/-) Invitrogen14175bez CaCl₂2 oraz MgCl22
1x podłoże Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen11095-080
5-fluoro-2-’-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20 mM w 1x MEM; przechowywać w temperaturze -20°C°C
płytki TC z 96 płaskimi dołkamiCorning3599
acyklowir Calbiochem114798przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 31 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Afidikolina Calbiochem178273przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Suplement B-27 Invitrogen17504-44
Kolagenaza Sigma-AldrichC2674przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/ml w HBSS-/-; przechowywać w temperaturze -20°C°C
D-(+)-glukoza Sigma-AldrichG6152przygotuj 40% roztwór zapasowy w H2O2O; sterylizować przez filtr &i przechowywać w temperaturze 4°C°C
L-glutamina Invitrogen25030-081
Laminina Sigma-AldrichL2020przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml w H2O2O; szybkie zamrażanie 20 μalikwoty &przechowywać w temperaturze -80°C°C; rozcieńczyć do 2 μg/ml stężenie robocze w sterylnym H2O
Leibovitz’z pożywki L-15 Invitrogen11415
Czynnik wzrostu nerwów Harlan LaboratoriesBT.5017przygotować 50 μroztwór stokowy o stężeniu g/ml w HBSS-/-; przechowywać w temperaturze -80°C°C
pożywka Neurobasal Invitrogen12348
Kwas fosfonooctowy (PAA) Sigma-AldrichP6909przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 75 mg/ml w H2O2O; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Hydrobromek poli-D-lizyny Sigma-AldrichP0899przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w H2O2O; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Kolagen z ogonów szczura EMD Millipore08-115Stężenie różni się w zależności od partii produktu; przechowywać w temperaturze 4°C°C i rozcieńczyć do stężenia roboczego 0,66 mg/ml w sterylnej H2O
Trichostatyna A Sigma-AldrichT8552przygotować roztwór stokowy 1 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Trypsyna 2,5% Invitrogen15090-04

Bibliografia

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Reaktywacja z latencjizwoje szyjne górneneurony współczulneleczenie acyklowiremwirus z reporterem EGFPmikroskopia fluorescencyjnaczynnik wzrostu nerwówsygnalizacja PI3-kinazy
System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.