System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Podsumowanie

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

Streszczenie

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających zdarzeń reaktywacji, które zapewniają transmisję wirusa i przyczyniają się do rozwoju choroby klinicznej. Obecne leki przeciwwirusowe nie wpływają na rezerwuar latentny, a szczepionki nie istnieją. Podczas gdy molekularne szczegóły replikacji litycznej są dobrze opisane, mechanizmy kontrolujące latencję w neuronach pozostają nieznane. Nasza obecna wiedza na temat latencji pochodzi z badań in vivo z wykorzystaniem modeli małych zwierząt, które były niezbędne do określenia wymagań genetycznych wirusa oraz roli odpowiedzi immunologicznych. Niemniej jednak w żywych zwierzętach nie jest możliwe odróżnienie specyficznych efektów wpływających na relację wirusa z neuronem od bardziej ogólnych konsekwencji infekcji pośredniczonych przez komórki odpornościowe lub nie-neuronalne komórki wspierające. Ponadto eksperymenty na zwierzętach są kosztowne, czasochłonne i ograniczone pod kątem dostępnych opcji manipulowania procesami gospodarza. Aby pokonać te ograniczenia, niezbędny jest system oparty wyłącznie na neuronach, który odtwarzałby charakterystykę latencji i reaktywacji in vivo, oferując jednocześnie zalety hodowli tkankowej w zakresie homogeniczności i dostępności.

Przedstawiamy tutaj model in vitro z wykorzystaniem hodowli pierwotnych neuronów sympatycznych z górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) (Ryc. 1) do badania latencji i reaktywacji HSV-1, który spełnia większość, jeśli nie wszystkie, pożądane kryteria. Po usunięciu komórek nieneuronalnych, niemal jednorodne hodowle neuronów TrkA⁺ są zakażane HSV-1 w obecności acyklowiru (ACV) w celu zahamowania replikacji litycznej. Po usunięciu ACV efektywnie ustanawiane są nieproduktywne infekcje HSV-1, które wiernie wykazują uznane cechy latencji. Co istotne, lityczne mRNA, białka i wirusy zakaźne stają się niewykrywalne, nawet w przypadku braku selekcji, natomiast ekspresja transkryptu związanego z latencją (LAT) utrzymuje się w jądrach neuronów. Genomy wirusowe są utrzymywane w średniej liczbie 25 kopii na neuron i mogą zostać indukowane do replikacji produktywnej poprzez zakłócenie sygnalizacji PI3-Kinazy / Akt lub proste odstawienie czynnika wzrostu nerwów¹. Rekombinowany HSV-1 kodujący EGFP połączone z wirusowym białkiem litycznym Us11 zapewnia funkcjonalny marker replikacji wynikającej z reaktywacji w czasie rzeczywistym, który można łatwo skwantyfikować. Oprócz zabiegów chemicznych, w systemie tym można z powodzeniem zastosować metodologie genetyczne, takie jak interferencja RNA lub dostarczanie genów za pomocą wektorów lentiwirusowych, co umożliwia badania mechanistyczne, które są bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe, do przeprowadzenia na zwierzętach. Podsumowując, system latencji / reaktywacji HSV-1 oparty na SCG stanowi potężne i niezbędne narzędzie do odkrycia molekularnych mechanizmów kontrolujących latencję i reaktywację HSV-1 w neuronach – odnośnej długotrwałej zagadki w wirusologii, której rozwiązanie może dostarczyć nowych spostrzeżeń w opracowywaniu nowych terapii celujących w latentny rezerwuar herpeswirusa.

Protokół

1. Izolacja i hodowla neuronów zzęków z zarodków szczura

Aby zapewnić przydatny kontekst dla zrozumienia niniejszego protokołu oraz w celu kompleksowego omówienia wcześniejszej literatury ustanawiającej metody hodowli neuronów SCG, w tym podstawy hodowli SCG in vitro, podłoża do pokrywania płytek oraz składniki mediów bezsurowiczych, czytelnika odsyła się do referencji^2-4.

1. Wykorzystanie szczurów jako źródła neuronów SCG przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH w ramach aktywnego protokołu zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC).
2. Przed rozpoczęciem sekcji przygotować płytki hodowlane z 96 dołkami powleczone kolagenem i lamininą. Używając wielokanałowej pipety, napełnić wszystkie 96 dołków roztworem zawierającym 0,66 mg / ml kolagenu z ogona szczura. Natychmiast usunąć kolagen, który można odzyskać i wykorzystać do maksymalnie 8 sekcji. Po usunięciu kolagenu bardzo ważne jest pozostawienie dołków do wyschnięcia pod laminarnym przepływem powietrza. Czas schnięcia zależy od liczby dołków w płytce. Na przykład w przypadku płytki 96-dołkowej zazwyczaj trwa to około 5-10 min, ale może trwać do 30-40 min przy użyciu większej płytki 24-dołkowej. Niedostateczne wysuszenie dołków skutkuje słabym przytwierdzianiem się SCG. Następnie powtórzyć procedurę, używając roztworu lamininy o stężeniu 2 μg / ml. Inkubować roztwór lamininy przez co najmniej 2 hr w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze CO₂ aż do momentu wysiewania neuronów (krok 1.14).
3. Kupione komercyjnie ciężarne samice szczurów uśpić za pomocą CO₂. Po spryskaniu truchła 70% etanolem wykonać cięcie w kształcie litery U wokół brzucha. Po odchyleniu skóry wykonać drugie cięcie w kształcie litery U przez ścianę mięśni brzucha. Macica jest widoczna po uniesieniu warstwy mięśni brzucha. Wyjąć macicę i umieścić ją w naczyniu o średnicy 15 cm. Ostrożnie otworzyć macicę za pomocą tępych nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia płodów. Każdy płód należy wyjęć z pęcherzyka zarodkowego, przeciąć pępowinę, a następnie oczyścić płód 70% etanolem i chusteczkami Kimwipes.
4. Pracując pod wyciągiem do sekcji, uśmiercić nienarodzone płody szczurze w 21. dniu embrionalnym (E21) poprzez oddzielenie głowy od tułowia. Skierować nożyczki w podstawę szyi, tuż nad barkami. Aby odsłonić zwoje, przypiąć głowę (szyją do góry) za pomocą igieł 23 G w trzech miejscach: i) rdzeń kręgowy; ii) skóra przednia odciągnięta nad nos i przypięta; oraz iii) przełyk / tchawica muszą być odciągnięte i przypięte od podstawy szyi.
5. Zlokalizować dwa SCG* położone po obu stronach rozwidlenia tętnicy szyjnej (dwa SCG na jeden embrion). SCG znajduje się bezpośrednio pod rozgałęzieniem. Oddzielić SCG od tętnic, rozsuwając rozwidlenie. Umieścić zwoje w 12 ml pożywki L15 (uzupełnionej o 0,4% D(+)-glukozy) w probówce stożkowej 15 ml na lodzie.

*SCG jest półprzezroczysty i bezbarwny w porównaniu do nieprzezroczystej, żółtawej tkanki tłuszczowej otaczającej rozwidlenie. Przed pobraniem zwojów należy spróbować usunąć jak najwięcej pozostałej tkanki tłuszczowej i naczyń krwionośnych.

6. Powtarzać kroki 1.4 i 1.5, aż wszystkie SCG zostaną wyizolowane z embrionów.
7. Zwirować delikatnie zwoje przez 1 min przy 600 rpm i odessać nadmiar pożywki.
8. Resuspendować zwoje w 1 ml pożywki L15 zawierającej trypsynę (0,25%, bez EDTA) i kolagenazę (1 mg/ml). Inkubować przez 30 min w 37 °C, mieszając co 10 min.
9. Dodać 10 ml pożywki C (1x MEM, 0,4% D(+)-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 10% FBS), aby inaktywować trypsynę, i zwirować przez 1 min przy 600 rpm.
10. Usunąć jak największą ilość pożywki z trypsyną/kolagenazą* i przemyć zwoje 10 ml pożywki C. Zwirować przez 1 min przy 600 rpm. Powtórzyć ten krok raz.

*Pozostała kolagenaza będzie zakłócać działanie podłoża kolagenowego niezbędnego do przytwierdzania komórek do płytki hodowlanej.

11. Usunąć medium płuczące i ponownie zawiesić zwoje w 1 ml C-media, a następnie poddać trituracji za pomocą igły 21 G dołączonej do strzykawki 5 ml, aby rozbić duże skupiska komórek*. Kontynuować triturację igłą 23 G aż do rozbicia widocznych skupisk.

*Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego utarcia, ponieważ uszkodzi to komórki. Jeśli traktowanie trypsyną i kolagenazą przebiegło pomyślnie, wystarczające powinno być maksymalnie piętnaście cykli przejścia igły 21 G w górę i w dół oraz trzy cykle z igłą 23 G.

12. Przefiltrować rozdzielone neurony przez nylonowy filtr 70 μm [BD Biosciences cell strainer] do probówki stożkowej 50 ml, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki.
13. Pobrać 10 μl alikwot przefiltrowanej zawiesiny komórkowej i zmieszać z błękitem trypanu w celu określenia liczby żywych komórek. Policzyć liczbę komórek aktywnie wykluczających barwnik przy użyciu hemocytometru.
14. Usunąć roztwór lamininy z płytek 96-dołkowych oczekujących w inkubatorze 37 °C (patrz KROK 1.2). Nie doprowadzać do wyschnięcia płytki; można jej użyć natychmiast do wysiewu komórek po usunięciu lamininy. Rozdzielić* 5,000-6,000 łącznie żywych komórek (50 - 100 μl na dołek) do 96-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej wcześniej kolagenem i lamininą. Do pożywki C dodać 50 ng / ml czynnika wzrostu nerwów (NGF).

*Kluczowe jest stosowanie prawidłowej, sterylnej techniki hodowli tkanek, ponieważ w pożywkach wzrostowych pominięto antybiotyki. Ponadto może występować znaczna zmienność kolagenu pochodzącego od różnych dostawców. Uzyskaliśmy spójne wyniki w różnych partiach, stosując kolagen z ogona szczura firmy Millipore.

15. W 1. dniu DIV (day in vitro) zastąp pożywkę C użytą do wysiewania komórek 50 μl NBM (0,4% D(+)-glukozy, 2 mM L-glutaminy, suplementu B-27 zawierającego 50 ng / ml NGF, 5 μM afidikoliny i 20 μM 5-fluorouracylu [5-fluoro-2'-deoksyurydyny]). Inkubuj hodowle przez 5 dni*. Na tym etapie poprzez trypsynizację i policzenie komórek pozostałych w kilku dołkach można określić liczbę neuronów, które przeżyły traktowanie środkiem antymitotycznym. Typowo w płytce 96-dołkowej pozostaje około 1000 neuronów na dołek.

*Problemy z kontaminacją grzybiczą lub bakteryjną są zazwyczaj widoczne w ciągu pierwszych 24 h hodowli. Przed wymianą pożywek należy dokładnie sprawdzić każdą studzienkę pod kątem wzrostu drobnoustrojów. Jeśli zanieczyszczona jest tylko ograniczona liczba studzienek, można je potraktować rozcieńczonym roztworem wybielacza, wypłukać PBS i wysuszyć, aby kontynuować eksperyment. Zaleca się powtórzenie każdego eksperymentu, w którym wystąpiła kontaminacja drobnoustrojowa, nawet w ograniczonej liczbie studzienek. W przypadku stwierdzenia rozległej kontaminacji drobnoustrojowej w płytce 96-dołkowej, eksperyment należy przerwać.

2. Zakażenie kultur SCG wirusem HSV-1 Us11-EGFP i ustanowienie latencji

W celu zapoznania się z przydatnymi informacjami na temat technik wirologicznych, w tym podstawowej propagacji wirusów, wyznaczania miana wirusa oraz wielokrotności infekcji (MOI), czytelnika odsyłamy do literatury⁵. W kwestii omówienia biologii herpeswirusów zalecamy zapoznanie się z referencją⁶. Na koniec, w celu przejrzenia wcześniejszych przykładów, innych protokołów oraz dodatkowych informacji dotyczących litycznej infekcji neuronów SCG przez alpha-herpeswirusy, a także w celu porównania z adaptacjami naszego protokołu służącymi do badania latencji i reaktywacji, odsyłamy do źródeł^7-10.

1. W 6. dniu in vitro (DIV 6) dodać acyklowir (ACV) do istniejącej pożywki w każdej studni, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM*. Na przykład, jeśli każda studnia zawiera 50 μl, należy dodać 25 μl roztworu zapasowego ACV o stężeniu 300 μM. Zazwyczaj ACV dodaje się wieczorem przed infekcją, ale można go również dodać na 6-8 h przed infekcją.

*Jest wyjątkowo ważne, aby w każdym momencie minimalizować niepotrzebne manipulacje fizyczne neuronem. Wymiana pożywki lub zakażanie zapasami wirusa muszą być przeprowadzane bardzo delikatnie i powoli. W przeciwnym razie wynikający z tego stres mechaniczny może negatywnie wpłynąć na żywotność neuronów.

2. W 7. dniu in vitro (DIV 7) zainfekuj kultury SCG wirusem HSV-1 Us11-EGFP (opisanym w ref¹¹) przy wielokrotności zakażenia (MOI) w zakresie 1–2 (patrz ważna uwaga poniżej dotycząca wyznaczania optymalnego MOI)*. Dodaj rozcieńczony wirus bezpośrednio do istniejącego medium w studzience. Uwzględnij kontrolę pozorowaną (mock-infected) oraz pozytywną kontrolę infekcji litycznej w medium bez ACV. Pozostaw próbki do infekcji na 2–3 h w temperaturze 37 °C.

*MOI jest obliczane na podstawie miana wirusa wyznaczonego za pomocą testu plackowego na komórkach Vero¹² oraz liczby żywych komórek wysianych na studzienkę w kroku 1.14. Obliczenie to jest przydatne jedynie w sensie operacyjnym, ponieważ całkowita liczba wysianych komórek obejmuje neurony wraz z zanieczyszczającymi je glejem i fibroblastami. Ponieważ te dzielące się komórki zanieczyszczające są eliminowane podczas traktowania środkami antymitotycznymi, efektywne MOI dla przeżywających neuronów jest w rzeczywistości wyższe. Z początkowej ilości 5 000 – 6 000 żywych komórek, po traktowaniu środkami antymitotycznymi pozostaje około 1 000 neuronów (oceniane poprzez trypsynizację i bezpośrednie liczenie komórek). Optymalne MOI do zakażania kultur neuronalnych może się nieco różnić w zależności od poszczególnych preparatów zapasów wirusa. Przy każdym nowym preparacie wirusa zalecamy przetestowanie ograniczonego zakresu różnych wartości MOI od 1 do 2. Celem jest zidentyfikowanie takiej wartości, która wywiera najmniejszy wpływ na żywotność neuronów i skutkuje największą liczbą indukowalnych zdarzeń reaktywacji (zdefiniowanych w sekcji 3). Wirus Us11-EGFP jest szczególnie pomocny w szybkim optymalizowaniu warunków, ale można również stosować inne metody odczytu, takie jak test plackowy lub ilościowe PCR. Pomocne może być użycie wirusa oczyszczonego za pomocą poduszki sacharozowej w celu usunięcia zanieczyszczeń obniżających żywotność komórek, choć nie jest to niezbędne i nie wykonuje się tego rutynowo.

3. Ostrożnie zastąp pożywkę infekcyjną świeżą pożywką NBM zawierającą 50 ng / ml NGF i 100 μM ACV*.

*Kluczowe jest zachowanie WYJĄTKOWEJ delikatności podczas wymiany pożywki do infekcji. Końcówkę pipety należy skierować w stronę ścianki dołka, a nie w jego dno, pozwalając pożywce łagodnie spływać na komórki. Nawet szybkie wypuszczenie pożywki z pipety może wygenerować siłę wystarczającą do oderwania aksonów od podłoża i spowodować odspojenie się komórek, zazwyczaj w postaci płata. Jeśli odspoi się tylko ograniczona liczba neuronów (20-30%), konsekwencje są minimalne, pod warunkiem że komórki wyglądają na zdrowe. Oderwane neurony prawdopodobnie z czasem przywrócą przyleganie; jednak aksony nie będą już prawidłowo rozciągnięte i odrosną nowe aksony. Choć nie jest to sytuacja optymalna, eksperyment może być kontynuowany, jeśli problem dotyczy tylko ograniczonej liczby dołków. W przypadku rozległego odspojenia neuronów (70-80%), nie zalecamy włączania dotkniętych dołków do eksperymentu. Jeśli w większości dołków odspoiło się 70-80% neuronów, zalecamy przerwanie eksperymentu. Mimo że neurony mogą ponownie przylgnąć, zazwyczaj tworzą one duże skupiska. Utrudnia to prawidłową ocenę poszczególnych reaktywowanych neuronów. Zalecamy powtórzenie każdego eksperymentu, w którym zaobserwowano dołki z odspojonymi neuronami, aby upewnić się, że wskaźniki reaktywacji nie zostały pod wpływem różnic w przyleganiu neuronów do dołków.

Ponadto kluczowe jest to, aby zawsze obchodzić się z kulturami tak delikatnie, jak to tylko możliwe. Stres mechaniczny wywołany niepotrzebnymi, gwałtownymi ruchami (w tym wielokrotnym otwieraniem i zamykaniem drzwi komory inkubatora) lub zbyt silnym aplikowaniem pożywki może upośledzić zdolność kultur do podtrzymywania latencji HSV-1, co może prowadzić do niedopuszczalnie wysokiego odsetka spontanicznej reaktywacji w danym eksperymencie.

4. Hodowle utrzymuj przez 6 dni, podczas których wirus ustanowi latencję. W tym okresie używaj mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania stanu neuronów oraz ekspresji Us11-EGFP jako wskaźnika replikacji litycznej. Us11-EGFP powinno być wykrywalne WYŁĄCZNIE w studniach kontrolnych bez zastosowania ACV, co wskazuje na udaną infekcję pierwotną i produktywną replikację lityczną. Neurony mogą wykazywać efekty cytopatyczne nawet w przypadku braku produktywnego wzrostu wirusa. Zainfekowane hodowle należy uważnie monitorować i porównywać z neuronami poddanymi infekcji pozorowanej.

3. Reaktywacja i ocena

1. W 14. dniu in vitro (DIV 14) ostrożnie zastąp pożywkę zawierającą ACV świeżą pożywką pozbawioną ACV. W razie potrzeby wprowadź w tym momencie zmienne farmakologiczne (lub biologiczne). Należy ściśle przestrzegać środków ostrożności opisanych w punkcie 2.3.
2. W okresie od 5 do 6 dni monitoruj żywe hodowle za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia neuronów ulegających reaktywacji. Alternatywnie pobierz próbki do innych rodzajów analiz (białek, kwasów nukleinowych, testu plackowego itp.).
3. Oblicz częstotliwość reaktywacji, licząc liczbę studzienek zawierających neurony dodatnie pod kątem EGFP, i przedstaw tę wartość jako proporcję całkowitej liczby studynek z próbkami. Należy pamiętać, że ekspresja EGFP w pojedynczej studzience nie pozwala odróżnić pierwotnego zdarzenia reaktywacji od późniejszej infekcji wynikającej z rozprzestrzeniania się wirusa. Ponieważ zakaźne rozprzestrzenianie się ogranicza się do jednej studzienki hodowlanej, obecność jednego lub więcej neuronów EGFP-dodatnich w studzience jest w tych warunkach operacyjnie definiowana jako jedno zdarzenie reaktywacji.

*W kulturze może dojść do wielu zdarzeń reaktywacji, co opisano w¹. Aby odróżnić pierwotne zdarzenie reaktywacji od rozprzestrzeniania się wirusa wynikającego z reaktywacji, można dodać inhibitor enkapsydacji WAY-150138. Poprzez blokowanie enkapsydacji nie powstaje zakaźny wirus, co uniemożliwia rozprzestrzenianie się wynikające z reaktywacji. W związku z tym sygnał EGFP wykryty w obecności WAY-150138 odzwierciedla liczbę niezależnych zdarzeń reaktywacji w obrębie pojedynczego dołka hodowlanego^1,13-15. Należy zauważyć, że WAY-150138 jest skuteczny tylko przeciwko szczepowi HSV-1 Patton i nie jest dostępny w handlu. Jako alternatywę dla WAY-150138 można rozważyć następujące rozwiązania: i) wykorzystanie wirusa mutanta o upośledzonej zdolności rozprzestrzeniania się do sąsiednich komórek; ii) użycie wirusa reporterowego, w którym EGFP jest eksprymowany z promotora IE w stałej obecności ACV; iii) traktowanie PAA lub ACV w celu zapobieżenia ekspresji późnych genów (i produkcji zakaźnego wirusa), a następnie zastosowanie immunofluorescencji z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko produktowi genu IE.

4. Alternatywne metody oceny reaktywacji przy użyciu testu

Wyniki z pojedynczego eksperymentu powinny być uzyskiwane z jednej preparacji SCG. Eksperymenty powtórzone można przeprowadzić z niezależnymi preparacjami SCG, pod warunkiem że każda powtórka została wykonana z użyciem pojedynczej partii SCG.

1. Ocena transkryptów litycznych HSV-1. Pobierz RNA w wybranych odstępach czasu po usunięciu ACV w obecności lub w przypadku braku różnych eksperymentalnych induktorów reaktywacji. Przy stosowaniu płytek hodowlanych z 96 dołkami zaleca się łączenie treści z co najmniej 20 dołków dla każdej próbki (w przybliżeniu 10⁵ komórek na próbkę RNA). Alternatywnie, SCG można wysiać w większych dołkach (np. dla płytki 24-dołkowej należy użyć 4-5 x10⁴ komórek/dołek). Choć wykrycie RNA z mniej niż 20 dołków jest możliwe, małe objętości prowadzą do nieuzasadnionej zmienności między próbkami.
2. Wykrywanie białek litycznych HSV-1. Pobierz lizaty w wybranym czasie po indukcji reaktywacji. Dodaj 7,5 μl buforu do lizy do każdego z 10 dołków w płytce 96-dołkowej i przeanalizuj próbki za pomocą SDS-PAGE oraz immunoblottingu. Alternatywnie, białka wirusowe można wykryć za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wstępny wysiew musi zostać przeprowadzony na podłożu umożliwiającym obrazowanie, takim jak sterylna szkiełko podstawowe pokryte wcześniej poli-D-lizyną (0,2 mg/ml, Sigma) przed naniesieniem kolagenu i lamininy (patrz 1.10).
3. Wykrywanie cząsteczek zakaźnych. Pobierz nadsącz z hodowli po reaktywacji. Wykonaj test plackowy na monowarstwach komórek Vero, wykorzystując rozcieńczenia seryjne nadsączu. Dodatkowo, testy plackowe można przeprowadzić z użyciem lizatów kultur poddanych zamrażaniu i rozmrażaniu, aby uwzględnić cząsteczki związane z komórkami w celu oznaczenia miana.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2A przedstawia przykład, w którym 1 μM trichostatyny A (TSA), znanego induktora reaktywacji^16-18, zastosowano w hodowlach SCG latentnie zainfekowanych szczepem reporterowym HSV1 EGFP-Us11 typu dzikiego. Przy zastosowaniu TSA reaktywacja osiąga 50% maksimum w ciągu 2 dni, a do 5. dnia poziom reaktywacji stabilizuje się na poziomie około 60% studni. Poziom bazowy reaktywacji („spontanicznej”) w tym doświadczeniu wynosi około 10% i zazwyczaj mieści się w zakresie 10-20% w tym systemie in vitro. Maksymalne poziomy reaktywacji różnią się w zależności od zastosowanego induktora reaktywacji. Wiele induktorów reaktywacji można stosować przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ nie zakłócają one produktywnej replikacji wirusa, jednak musi to zostać określone empirycznie. Inne induktory, w tym każdy odczynnik wpływający na żywotność neuronów lub utrudniający ukończenie produktywnego cyklu życiowego wirusa, mogą wymagać krótkotrwałego podania w formie impulsu w celu wywołania reaktywacji.

Choć akumulacja EGFP-Us11 w każdej studzience eksperymentu przedstawionego na Rysunku 2A wskazuje na reaktywację z latencji, nie pozwala ona rozstrzygnąć, czy sygnał Us11-EGFP w poszczególnych neuronach wynika z niezależnego zdarzenia reaktywacji, czy z rozprzestrzeniania się reaktywnego wirusa w kulturze. Aby ocenić liczbę neuronów przechodzących niezależne zdarzenia reaktywacji w każdej studzience, kultury poddano wstępnej obróbce związkiem WAY-150138, który specyficznie blokuje rozprzestrzenianie się wirusa poprzez zapobieganie enkapsydacji wirusowego genomu DNA^13-15. Zainfekowane kultury neuronów współczulnych potraktowano związkiem WAY-150138, a następnie indukowano reaktywację za pomocą TSA. Znaczną liczbę neuronów wykazujących ekspresję EGFP wykryto wyłącznie w studzienkach traktowanych TSA, w porównaniu do kultur kontrolnych traktowanych DMSO, co dowodzi, że w pojedynczej kulturze zachodzi wiele niezależnych zdarzeń reaktywacji (Rysunek 2B).

W naszym teście reporter Us11-EGFP jest wyrażany z endogennego promotora Us11¹¹. Ponieważ Us11 jest wirusowym genem litycznym z grupy „prawdziwie późnych” lub γ₂, do silnej ekspresji wymagana jest replikacja wirusowego DNA. Zostało to przedstawione na Rysunku 3, gdzie akumulacja EGFP-Us11 jest upośledzona przez kwas fosfonooctowy (PAA), inhibitor wirusowej polimerazy DNA, w kulturach indukowanych do reaktywacji inhibitorem kinazy PI3 LY294002.

Rysunek 1. Schemat ilustrujący typowy protokół eksperymentalny z wykorzystaniem systemu hodowli neuronów in vitro do badania latencji i reaktywacji HSV-1. 1) Po wypreparowaniu zwojów szyjnych górnych (SCG) od szczurów w dniu E21, dysocjowane neurony wysiewa się do płytek 96-dołkowych i traktuje środkami antymitotycznymi w celu usunięcia komórek nieneuronalnych. 2) Po 6 dniach in vitro (DIV) kultury infekuje się rekombinowanym wirusem HSV-1 zawierającym EGFP połączone z kodowanym przez wirusa genem późnym Us11 (EGFP-HSV-1) w obecności acyklowiru (ACV), leku przeciwwirusowego blokującego replikację lityczną. 3) Do 14. dnia (DIV 14) acyklowir jest usuwany, a ekspresja EGFP nie jest wykrywana. Kultury mogą być w ten sposób stabilnie utrzymywane przez miesiąc lub dłużej, bądź można dodać zmienną testową w celu oceny jej zdolności do wywoływania reaktywacji z latencji. Zmienna może mieć postać małocząsteczkowego inhibitora chemicznego, przeciwciała przeciwko rozpuszczalnej neurotrofinie lub białku powierzchniowemu komórki, bądź lentiwirusa wykazującego specyficzne dla genu shRNA lub białko ekspresowane ektopicznie. Reaktywację monitoruje się następnie poprzez ocenę liczby studzienek dodatnich pod kątem EGFP w czasie rzeczywistym.

Rycina 2. TSA reaktywuje HSV-1 w kulturach SCG. Kultury SCG zostały zainfekowane w sposób latentny zgodnie z opisem w Rycynie 1. W 14. dobie in vitro (DIV 14) ACV usunięto i zastąpiono medium zawierającym 1 μM trichostatyny A (TSA). (A) Kultury wizualizowano i oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej codziennie po podaniu leku przez okres 5 dni. Przedstawiono procent studni ulegających reaktywacji w przebiegu eksperymentu w porównaniu z kulturami traktowanymi kontrolnie DMSO. Procent reaktywacji obliczono na podstawie liczby studni pozytywnych pod kątem EGFP z 20 studni na 96-dołkowej płytce hodowlanej. Słupki błędów wskazują standardowy błąd średniej. (B) Latentnie zainfekowane kultury traktowano TSA oraz inhibitorem enkapsydacji wirusowego DNA, WAY-150138 (20 μg/ml). Liczbę neuronów EGFP+ porównano 48 h po podaniu leków z kontrolą traktowaną DMSO i WAY-150138. Każdy punkt danych reprezentuje stosunek neuronów EGFP+ do 1 000 neuronów w studni hodowlanej. Słupek przedstawia średni procent neuronów EGFP+ w studni.

Rycina 3. Wykrywanie EGFP zależy od replikacji wirusowego DNA. Kultury SCG zostały zainfekowane latentnie, a następnie potraktowane 10 μM LY29004, znanego induktora reaktywacji ¹. Reaktywację indukowaną przez LY (kolor niebieski) porównano z reaktywacją w próbkach potraktowanych inhibitorem syntezy wirusowego DNA, kwasem fosfonooctowym, PAA (300μg/ml, kolor czerwony) oraz obiema substancjami jednocześnie (kolor zielony).

Dyskusja

Ten system hodowli i infekcji pierwotnych neuronów stanowi prostą i skuteczną metodę badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw latencji i reaktywacji HSV-1. System ten wiernie odwzorowuje uznane cechy latencji zdefiniowane zarówno w infekcjach u ludzi, jak i w modelach zwierzęcych. Gdy wirus znajduje się w stanie latencji w hodowlach SCG, nie można wykryć cząstek zakaźnych ani produktów litycznych genów wirusowych. Jedynym wykrywanym produktem genu wirusowego w neuronach z latentną infekcją je...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70μfiltr nylonowy (sito do komórek)	BD Biosciences	352350
1x roztwór Hanksa’zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)-/-)	Invitrogen	14175	bez CaCl₂2 oraz MgCl22
1x podłoże Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11095-080
5-fluoro-2-’-deoksyurydyna	Sigma-Aldrich	F0503	przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20 mM w 1x MEM; przechowywać w temperaturze -20°C°C
płytki TC z 96 płaskimi dołkami	Corning	3599
acyklowir	Calbiochem	114798	przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 31 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Afidikolina	Calbiochem	178273	przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Suplement B-27	Invitrogen	17504-44
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	C2674	przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/ml w HBSS-/-; przechowywać w temperaturze -20°C°C
D-(+)-glukoza	Sigma-Aldrich	G6152	przygotuj 40% roztwór zapasowy w H2O2O; sterylizować przez filtr &i przechowywać w temperaturze 4°C°C
L-glutamina	Invitrogen	25030-081
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml w H2O2O; szybkie zamrażanie 20 μalikwoty &przechowywać w temperaturze -80°C°C; rozcieńczyć do 2 μg/ml stężenie robocze w sterylnym H2O
Leibovitz’z pożywki L-15	Invitrogen	11415
Czynnik wzrostu nerwów	Harlan Laboratories	BT.5017	przygotować 50 μroztwór stokowy o stężeniu g/ml w HBSS-/-; przechowywać w temperaturze -80°C°C
pożywka Neurobasal	Invitrogen	12348
Kwas fosfonooctowy (PAA)	Sigma-Aldrich	P6909	przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 75 mg/ml w H2O2O; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Hydrobromek poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	P0899	przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w H2O2O; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Kolagen z ogonów szczura	EMD Millipore	08-115	Stężenie różni się w zależności od partii produktu; przechowywać w temperaturze 4°C°C i rozcieńczyć do stężenia roboczego 0,66 mg/ml w sterylnej H2O
Trichostatyna A	Sigma-Aldrich	T8552	przygotować roztwór stokowy 1 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C°C
Trypsyna 2,5%	Invitrogen	15090-04