Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Polianhydrydy to klasa biomateriałów o doskonałej biokompatybilności i właściwościach umożliwiających dostarczanie leków. Choć były one szeroko badane przy użyciu konwencjonalnych technik syntezy polegających na analizie jednej próbki na raz, opracowano nowsze podejście wysokoprzepustowe, które umożliwia syntezę i testowanie dużych bibliotek polianhydrydów.1Ułatwi to bardziej efektywny proces optymalizacji i projektowania tych biomateriałów do zastosowań w dostarczaniu leków i szczepionek. Metoda opisana w niniejszej pracy dotyczy kombinatorycznej syntezy bibliotek biodegradowalnych folii i nanocząstek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustowej detekcji uwalniania białek z tych bibliotek. W tej metodzie sterowanej robotycznie (Rysunek 1), siłowniki liniowe oraz pompy strzykawkowe są sterowane przez system LabVIEW, co umożliwia realizację zautomatyzowanego protokołu bez konieczności ręcznej obsługi, eliminując tym samym błędy użytkownika. Ponadto metoda ta pozwala na szybkie wytwarzanie bibliotek polimerów w skali mikro, co zmniejsza wielkość partii, prowadząc jednocześnie do stworzenia wielowariantowych systemów polimerowych. Takie kombinatoryczne podejście do syntezy polimerów ułatwia otrzymanie do 15 różnych polimerów w czasie równoważnym czasowi potrzebnemu na konwencjonalną syntezę jednego polimeru. Dodatkowo, po rozpuszczeniu biblioteki polimerów w rozpuszczalniku i wytrąceniu w nie-rozpuszczalniku (w przypadku nanocząsteczek) lub poprzez suszenie próżniowe (w przypadku filmów), kombinatoryczną bibliotekę polimerów można uformować w puste lub obciążone białkiem geometrie, w tym filmy lub nanocząsteczki. Po wprowadzeniu białka sprzężonego z fluorochromem do bibliotek polimerowych, kinetykę uwalniania białka można ocenić w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu metody detekcji opartej na fluorescencji (Rycina 2 i 3) zgodnie z wcześniejszym opisem1Ta platforma kombinatoryczna została zwalidowana za pomocą konwencjonalnych metod2 a biblioteki folii i nanocząsteczek polianhydrydów zostały scharakteryzowane za pomocą 1H NMR oraz FTIR. Biblioteki zostały przesianie pod kątem kinetyki uwalniania białek, stabilności i antygeniczności; in vitro toksyczność komórkowa, produkcja cytokin, ekspresja markerów powierzchniowych, adhezja, proliferacja i różnicowanie; oraz in vivo biodystrybucja i mukoordhezja1-11Opracowana w niniejszej pracy metoda kombinatoryczna umożliwia wysokoprzepustową syntezę polimerów oraz wytwarzanie bibliotek nanopartykuł i filmów obciążonych białkami, które z kolei mogą zostać poddane przesiewowi. in vitro i in vivo w celu optymalizacji właściwości biomateriału.
Protokół
1. Synteza kombinatorycznej biblioteki polimerów (zróżnicowana pod kątem chemii polimerów) – konfigurację robotyczną przedstawiono na Rysunku 1
- Rozpuścić każdy monomer w odpowiednim rozpuszczalniku (stężenie = 25 mg/ml) i pobrać każdą z roztworów do szczelnej strzykawki gazowej o pojemności 10cc.
- Przymocować do końców strzykawek kapilary z systemem Luer-lock odporne na rozpuszczalniki.
- Umieścić strzykawki w pompach strzykawkowych (programowalne pompy strzykawkowe New Era) i zablokować je w odpowiedniej pozycji.
- Ustawić siłowniki liniowe (Zaber) w pozycji startowej.
- Za pomocą zacisków do statywu ustawić końce obu kapilar w początkowej fiolce/dołku przeznaczonym do nanoszenia monomerów.
- Uruchomić program LabVIEW, który pompuje zmienne objętości każdego monomeru do każdego dołka, zależnie od pożądanego składu kopolimeru. Jest to realizowane w programie poprzez wydanie polecenia do siłownika osi Z, aby opuścił kapilary do fiolki/dołka, a następnie do każdej pompy, aby dozowała pożądaną objętość. Następnie program nakazuje siłownikowi Z powrót do pozycji domyślnej, a siłownikom X i Y przemieszczenie się do pozycji kolejnej fiolki/dołka. Proces ten jest powtarzany do momentu, aż do każdego dołka zostanie naniesiona pożądana objętość monomeru.
- Po naniesieniu monomerów wielodołkowa lub wielofiolkowa biblioteka monomerów jest przenoszona do wstępnie podgrzanej piecyka próżniowego i inkubowana w próżni przez czas trwania reakcji polimeryzacji kondensacyjnej. W przypadku syntezy CPH:SA reakcję prowadzi się w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 torr przez 1,5 hr, jednak warunki reakcji będą się różnić w zależności od systemu polimerowego.
2. Tworzenie kombinatorycznej biblioteki pustych i obciążonych białkiem polimerowych nanocząsteczek oraz filmów – patrz Rysunek 1 w celu zapoznania się z konfiguracją robotyczną
- Strzykawka w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana rozpuszczalnikiem (biblioteka blank) lub rozpuszczalnikiem z rozproszonym w nim białkiem (biblioteka z obciążeniem białkowym), podczas gdy strzykawka w drugiej pompie pozostaje pusta. Probówki do otrzymywania nanocząsteczek w sąsiednim uchwycie na próbki są napełniane nie-rozpuszczalnikiem (stosunek rozpuszczalnika do nie-rozpuszczalnika wynosi 1 do 100). Do otrzymywania filmów zamiast probówek w sąsiednim uchwycie na próbki wykorzystuje się pustą płytkę wielodołkową.
- Za pomocą programu LabVIEW rozpuszczalnik jest naniesiony do wszystkich fiolek/dołków z polimerem w bibliotece (stężenie = 20 mg/ml) i inkubowany przez 1-5 min. Można wprowadzić opcjonalny etap sonikacji (30 s przy 40 Hz), aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru.
- Następnie, poprzez uruchomienie oddzielnego programu LabVIEW, próbka jest pobierana do pustej strzykawki i naniesiona do odpowiadającej jej probówki z nie-rozpuszczalnikiem (nanocząsteczki) lub pustego dołka (filmy) w sąsiednim uchwycie na próbki.
- Proces ten jest przeprowadzany dla każdego składu dyskretnej biblioteki polimerów.
- Biblioteka nanocząsteczek lub filmów jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu usunięcia rozpuszczalnika i nie-rozpuszczalnika (bibliotekę nanocząsteczek można również odzyskać za pomocą filtracji próżniowej).
3. Wysokoprzepustowa kinetyka uwalniania białek
- W celu badania kinetyki uwalniania białek o wysokiej przepustowości z biblioteki polimerów, modyfikuje się 96-dołkową płytkę głęboką (2 ml/dołek) z polipropylenu w taki sposób, aby górna 1/3 ścianek dołków w sąsiednich kolumnach (np. A i B, C i D, E i F, G i H) została usunięta, co pozwala na połączenie dołków. Filmy obciążone białkiem muszą zostać wykonane w tej płytce lub nanocząstki muszą zostać do niej przeniesione, aby przeprowadzić badania kinetyki uwalniania o wysokiej przepustowości. Próbki nanocząstek lub filmów obciążonych białkiem należy umieścić tylko w jednym dołku z sąsiadujących kolumn (np. A, C, E i G). Szczegóły przedstawiono na Rysunku 4.
- Po przeniesieniu nanocząstek do 96-dołkowej płytki do uwalniania, pozwala się cząstkom osiąść. Bufor PBS (0,1 mM, pH 7,4) jest powoli dodawany do każdego dołka z próbką (kolumny A, C, E i G), a następnie do każdego sąsiedniego dołka (kolumny B, D, F i H), aż dołki zostaną wypełnione, a bufor będzie swobodnie przepływał między połączonymi dołkami. W przypadku nanocząstek proces ten należy przeprowadzić ze szczególną ostrożnością, aby upewnić się, że cząstki pozostają na dnie dołka z próbką (kolumny A, C, E i G) i nie zostaną przeniesione do sąsiedniego dołka uwalniającego (kolumny B, D, F i H). W niektórych przypadkach wymagane jest wirowanie, aby zlokalizować próbki nanocząstek na dnie dołka z próbką (kolumny A, C, E i G).
- Następnie płytka do uwalniania zostaje zamknięta pokrywką i umieszczona w pożądanej temperaturze (np. 37 °C) pod wpływem mieszania przez cały czas trwania eksperymentu.
- W określonych odstępach czasu (np. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 i 30 dni) ilość uwolnionego białka sprzężonego z fluorochromem jest ilościowo określana przy użyciu skanera fluorescencyjnego 9,400 Typhoon Flatbed Fluorescent Scanner (GE Healthcare). Płytkę do uwalniania umieszcza się na powierzchni skanera, skanuje przy użyciu odpowiedniego lasera wzbudzenia i filtrów emisyjnych, a następnie określa intensywność fluorescencji uwolnionego białka w dołkach uwalniających (kolumny B, D, F i H) (Image Quant). Sugeruje się dołączenie do płytki standardów białek o znanych stężeniach w celu obliczenia ilości białka oraz uwzględnienia gaszenia fluorochromu.
4. Reprezentatywne wyniki
Po otrzymaniu biblioteki polimerów przeprowadzono charakterystykę za pomocą 1H NMR, GPC oraz FTIR w celu walidacji tej metody kombinatorycznej1,7,8,11. Masa cząsteczkowa mieści się w zakresie 10 000-20 000 g/mol, indeks polidyspersyjności wynosi od 1,5 do 3,0, a skład chemiczny okazał się prawidłowy i zgodny z konwencjonalnymi metodami syntezy polianhydrydów12-15. Podobnie obrazy SEM bibliotek nanocząsteczek wykazały morfologię powierzchni, rozmiar i rozkład wielkości zbliżone do nanocząsteczek otrzymanych w sposób konwencjonalny2. Kinetykę uwalniania białka z nanocząsteczek lub folii polianhydrydowych przeprowadzono w zmodyfikowanej płytce wielodołkowej, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Wyniki wykazały uwalnianie przybliżone do rzędu zerowego, z efektem gwałtownego wyrzutu lub bez niego, w zależności od stopnia załadowania białka i chemii polimeru (Rysunki 2 i 3) 1,12,14,16.
Rycina 1. Aparat do kombinatorycznego wytwarzania filmów polimerowych i nanocząsteczek.
Rysunek 2. Wysokoprzepustowe uwalnianie Texas Red albuminy surowicy bydlęcej (TRBSA) z biblioteki nanocząstek polimerowych CPH:SA. Chemia polimerów bogatych w SA uwalnia enkapsulowane TRBSA najszybciej, podczas gdy chemia polimerów bogatych w CPH uwalnia je najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=4. Przedrukowano za zgodą Petersen et. al.1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Rysunek 3. Wysokoprzepustowe uwalnianie Texas Red bovine serum albumin (TRBSA) z biblioteki filmów polimerowych CPTEG:CPH. Chemia polimerów bogata w CPTEG uwalnia enkapsulowane TRBSA najszybciej, natomiast chemia polimerów bogata w CPH uwalnia je najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=3.
Rysunek 4. Obraz przedstawiający dwa sąsiadujące dołki „przed” i „po” modyfikacji w 96-dołkowej polipropylenowej płytce głębokiej. Obraz „po” modyfikacji po prawej stronie przedstawia również dodanie filmu polimerowego (dno lewego dołka) z uwalnianą pomiędzy dwoma dołkami do roztworu buforowego enkapsulowaną cząsteczką fluorescencyjną. Uwolniona cząsteczka fluorescencyjna jest następnie wykrywana w prawym dołku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znajomość niezbędnych warunków syntezy oraz temperatur przejścia szklistego (Tgs) syntetyzowanych polimerów jest kluczowa dla wytwarzania biblioteki. Jeśli Tgs znajdują się poniżej temperatury pokojowej, etap wytwarzania nanocząstek może wymagać przeprowadzenia w środowisku o kontrolowanej temperaturze, niższej niż Tg polimerów. Ponadto należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że cały sprzęt mający kontakt z wysokimi temperaturami i rozpuszczalnikami jest przystosowany do pracy w taki...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe przyznane w ramach nagrody ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) oraz przez U.S. Army Medical Research and Materiel Command (Grant nr W81XWH-10-1-0806). Materiał ten powstał w ramach prac wspieranych przez National Science Foundation w ramach grantów nr EEC 0552584 oraz 0851519.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zmotoryzowany stół XYZ: 3x T-LSM050A, zakres ruchu 50 mm na oś | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| Jednopompowy dozownik strzykawkowy NE-1000 | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Szklane probówki hodowlane wielokrotnego użytku Pyrex* Vista* bez kołnierza | Corning | 07-250-125 | |
| Kuwety szklane | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| Strzykawki gazoszczelne SGE, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| Płytki głębokich dołków U96 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Maty do zamykania dołków | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Krążki filtracyjne Whatman Grade 50 90 mm | Whatman | 1450-090 |
Bibliografia
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
