Artykuł metodologiczny

Kombinatoryczna synteza i wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek folii polimerowych i nanocząstek

DOI:

10.3791/3882

⸱

6 września 2012

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda opisuje kombinatoryczną syntezę biodegradowalnych warstw polibezwodnikowych i bibliotek nanocząsteczek oraz wysokoprzepustowe wykrywanie uwalniania białek z tych bibliotek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezwodniki to klasa biomateriałów o doskonałej biokompatybilności i możliwościach dostarczania leków. Chociaż były one szeroko badane za pomocą konwencjonalnych technik syntezy jednej próbki na raz, opracowano nowsze podejście o wysokiej przepustowości, umożliwiające syntezę i testowanie dużych bibliotek polibezwodników1. Ułatwi to bardziej efektywny proces optymalizacji i projektowania tych biomateriałów do zastosowań związanych z dostarczaniem leków i szczepionek. Metoda opisana w niniejszej pracy opisuje kombinatoryczną syntezę biodegradowalnych warstw polibezwodników i bibliotek nanocząstek oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek. W tej zrobotyzowanej metodzie (ilustracja 1) siłowniki liniowe i pompy strzykawkowe są sterowane przez LabVIEW, który umożliwia korzystanie z automatycznego protokołu bez użycia rąk, eliminując błędy użytkownika. Co więcej, metoda ta umożliwia szybkie wytwarzanie bibliotek polimerów w mikroskali, zmniejszając wielkość partii, a jednocześnie prowadząc do tworzenia wielowariantowych systemów polimerowych. To kombinatoryczne podejście do syntezy polimerów ułatwia syntezę do 15 różnych polimerów w równoważnym czasie potrzebnym do konwencjonalnej syntezy jednego polimeru. Ponadto kombinatoryczna biblioteka polimerów może być wytwarzana w geometriach ślepej próby lub załadowanych białkami, w tym folii lub nanocząstek, po rozpuszczeniu biblioteki polimerów w rozpuszczalniku i wytrąceniu do nierozpuszczalnika (w przypadku nanocząstek) lub przez suszenie próżniowe (w przypadku folii). Po załadowaniu białka sprzężonego z fluorochromem do bibliotek polimerów, kinetykę uwalniania białka można ocenić przy wysokiej przepustowości przy użyciu metody wykrywania opartej na fluorescencji (ryc. 2 i 3), jak opisano wcześniej1. Ta platforma kombinatoryczna została zwalidowana przy użyciu metodkonwencjonalnych 2, a biblioteki folii polibezwodnikowej i nanocząstek scharakteryzowano za pomocą 1H NMR i FTIR. Biblioteki zostały przebadane pod kątem kinetyki uwalniania białek, stabilności i antygenowości; toksyczność komórkowa in vitro, wytwarzanie cytokin, ekspresja markerów powierzchniowych, adhezja, proliferacja i różnicowanie; oraz biodystrybucja i mukoadhezja in vivo1-11. Opracowana w ten sposób metoda kombinatoryczna umożliwia wysokoprzepustową syntezę polimerów i wytwarzanie bibliotek nanocząstek i filmów obciążonych białkami, które z kolei mogą być poddawane badaniom przesiewowym in vitro i in vivo w celu optymalizacji wydajności biomateriałów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kombinatoryczna synteza biblioteki polimerów (różna w chemii polimerów) - zobacz Rysunek 1 dla konfiguracji robotycznej

  1. Rozpuść każdy monomer w odpowiednim rozpuszczalniku (stężenie = 25 mg/ml) i załaduj go do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 cm3.
  2. Przymocuj odporne na rozpuszczalniki rurki kapilarne z blokadą przynęty na końcu każdej strzykawki.
  3. Umieścić strzykawki na pompach strzykawkowych (programowalne pompy strzykawkowe New Era) i zablokować na miejscu.
  4. Ustaw siłowniki liniowe (Zaber) w pozycji wyjściowej.
  5. Za pomocą statywu pierścieniowego clamps umieść koniec obu rurek kapilarnych w początkowej fiolce/studzience w celu osadzenia monomeru.
  6. Zainicjuj program LabVIEW, który pompuje zmienne objętości każdego monomeru do każdej studzienki w zależności od pożądanego składu kopolimeru. Osiąga się to w programie poprzez poinstruowanie siłownika osi Z, aby opuścił rurki kapilarne do fiolki/studzienki, a następnie każdą pompę dozuje żądaną objętość. Następnie program instruuje siłownik Z, aby powrócił do pozycji wyjściowej, a siłowniki X i Y przesunęły się do pozycji następnej fiolki/studzienki. Odbywa się to do momentu, gdy w każdej studzience zostanie osadzona pożądana objętość monomeru.
  7. Po osadzaniu monomerów biblioteka monomerów wielodołkowych lub wielofiolkowych jest przenoszona do wstępnie nagrzanego pieca próżniowego i inkubowana w próżni przez czas trwania reakcji polimeryzacji kondensacyjnej. W przypadku syntezy CPH:SA reakcję przeprowadza się w temperaturze 180 °C, 0,3 torr, przez 1,5 godziny, ale te warunki reakcji będą się różnić w zależności od różnych układów polimerowych.

2. Kombinatoryczne wytwarzanie pustych i załadowanych białkiem nanocząstek polimerowych i filmów - zobacz Rysunek 1 dla konfiguracji robota

  1. Strzykawka w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana rozpuszczalnikiem (ślepa biblioteka) lub rozpuszczalnikiem z rozproszonym w nim białkiem (biblioteka załadowana białkiem), podczas gdy strzykawka w drugiej pompie strzykawkowej pozostaje pusta. Probówki do wytwarzania nanocząstek w sąsiednim uchwycie na próbkę są wypełnione roztworem niezawierającym rozpuszczalnika (stosunek rozpuszczalnika do nierozpuszczalnika wynosi od 1 do 100). Do wytwarzania folii zamiast probówek w sąsiednim uchwycie na próbkę wykorzystuje się pustą płytkę wielodołkową.
  2. Za pomocą programu LabVIEW rozpuszczalnik jest umieszczany we wszystkich polimerowych fiolkach/studzienkach biblioteki (stężenie = 20 mg/ml) i inkubowany przez 1-5 minut. Można wprowadzić opcjonalny etap sonikacji (30 s przy 40 Hz), aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru.
  3. Następnie, poprzez zainicjowanie oddzielnego programu LabVIEW, próbka jest pobierana do pustej strzykawki i umieszczana w odpowiedniej probówce z rozpuszczalnikiem (nanocząstki) lub pustej studzience (folie) w sąsiednim uchwycie na próbkę.
  4. Proces ten jest przeprowadzany dla każdego składu dyskretnej biblioteki polimerów.
  5. Biblioteka nanocząstek lub filmów jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu usunięcia rozpuszczalników i bezrozpuszczalników (bibliotekę nanocząstek można również odzyskać za pomocą filtracji próżniowej).

3. Kinetyka uwalniania białek o wysokiej przepustowości

  1. W celu zbadania wysokoprzepustowej kinetyki uwalniania białek z biblioteki polimerów, 96 głęboko zanurzoną (2 ml / studzienkę) płytkę polipropylenową jest modyfikowana w taki sposób, że górna 1/3 ściany studni w sąsiednich kolumnach (np. A i B, C i D, E i F, G i H) jest usuwana, aby przylegać do studzienek. Warstwy obciążone białkiem muszą zostać wytworzone lub nanocząstki przeniesione do tej płytki, aby przeprowadzić wysokoprzepustowe badania kinetyki uwalniania. Próbki nanocząstek lub filmów zawierających białko mogą być umieszczane tylko w jednym dołku z przylegających kolumn (np. A, C, E i G). Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku 4.
  2. Po przeniesieniu nanocząstek na głęboko wydrążoną płytkę uwalniającą 96, cząstki pozostawia się do osiadania. Bufor PBS (0,1 mM, pH 7,4) jest powoli dodawany do każdej studzienki na próbkę (kolumny A, C, E i G), a następnie do każdej sąsiedniej studzienki (kolumny B, D, F i H), aż studzienki zostaną pełne, a bufor zacznie swobodnie przepływać między sąsiednimi studzienkami. W przypadku nanocząstek proces ten należy przeprowadzać ze szczególną ostrożnością, aby zapewnić, że cząstki pozostaną na dnie dołka próbki (kolumny A, C, E i G) i nie zostaną przeniesione do sąsiedniego dołka uwalniającego (kolumny B, D, F i H). W niektórych przypadkach wymagane jest odwirowanie w celu zlokalizowania próbek nanocząstek na dnie studzienki na próbkę (kolumny A, C, E i G).
  3. Następnie płytkę zwalniającą zamyka się pokrywką i umieszcza w żądanej temperaturze (tj. 37 °C) pod wpływem mieszania na czas trwania doświadczenia.
  4. W przyrostowych punktach czasowych (tj. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 i 30 dni) ilość uwolnionego białka sprzężonego z fluorochromem jest oznaczana ilościowo za pomocą płaskiego skanera fluorescencyjnego 9,400 Typhoon (GE Healthcare). Płytkę uwalniającą umieszcza się na powierzchni skanera, skanuje za pomocą odpowiedniego lasera wzbudzającego i filtrów emisyjnych, a następnie określa się ilościowo intensywność fluorescencji uwolnionego białka w studzienkach uwalniających (kolumny B, D, F i H) (Image Quant). Sugeruje się, aby wzorce białek o znanych stężeniach były włączone do płytki studzienkowej w celu obliczenia ilości białka i uwzględnienia wygaszania fluorochromu.

4. Reprezentatywne wyniki

Po stworzeniu biblioteki polimerów, przeprowadzono charakterystykę za pomocą 1H NMR, GPC i FTIR w celu walidacji tej metody kombinatorycznej1,7,8,11. Masa cząsteczkowa waha się od 10 000-20 000 g/mol, wskaźnik polidyspersyjności waha się od 1,5-3,0, a skład chemiczny okazał się dokładny i zgodny z konwencjonalnymi metodami syntezy polibezwodnika12-15. Podobnie, obrazy SEM bibliotek nanocząstek wykazały podobną morfologię, rozmiar i rozkład wielkości powierzchni, jak w przypadku konwencjonalnie wytwarzanych nanocząstek2. Kinetykę uwalniania białek z nanocząstek lub warstw polibezwodnika przeprowadza się w zmodyfikowanej płytce studzienki, jak opisano wcześniej1. Wyniki ujawniły przybliżone uwalnianie rzędu zerowego z lub bez impulsu, w zależności od obciążenia białkami i chemii polimeru (ryc. 2 i 3) 1,12,14,16.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Kombinatoryczna aparatura do wytwarzania folii polimerowych i nanocząstek.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Wysokoprzepustowe uwalnianie albuminy surowicy bydlęcej Texas Red (TRBSA) z biblioteki nanocząstek polimerowych CPH:SA. Chemia polimerów bogatych w SA uwalnia kapsułkowany TRBSA najszybciej, podczas gdy chemia polimerów bogatych w CPH uwalnia się najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=4. Przedruk za zgodą Petersena i wsp.1. Prawa autorskie 2010 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wysokoprzepustowe uwalnianie albuminy surowicy bydlęcej bydła rasy Texas Red (TRBSA) z biblioteki filmów polimerowych CPTEG:CPH. Chemia polimerów bogatych w CPTEG uwalnia kapsułkowany TRBSA najszybciej, podczas gdy chemia polimerów bogatych w CPH uwalnia się najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=3.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Zdjęcie przedstawiające dwie sąsiadujące ze sobą studzienki "przed" i "po" modyfikacji w płycie polipropylenowej z 96 głębokim odwiertem. Obraz "po" modyfikacji po prawej stronie przedstawia również dodanie folii polimerowej (dno lewej studzienki) z kapsułkowaną cząsteczką fluorescencyjną uwalnianą między dwoma studzienkami do roztworu buforowego. Uwolniona cząsteczka fluorescencyjna jest następnie wykrywana w odpowiedniej studzience.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiedza na temat niezbędnych warunków syntezy i temperatur zeszklenia(TGS) syntetyzowanych polimerów jest niezbędna do produkcji bibliotek. JeśliTG ssą niższe od temperatury pokojowej, może być konieczne przeprowadzenie etapu wytwarzania nanocząstek w środowisku o kontrolowanej temperaturzeponiżej TG polimerów. Ponadto należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że wszystkie urządzenia, które mają kontakt z wysokimi temperaturami i rozpuszczalnikami, muszą być zdolne do radzenia sobie z t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Nagrodzie ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) oraz Dowództwu Badań Medycznych i Materiałów Armii Stanów Zjednoczonych (Grant nr W81XWH-10-1-0806) za wsparcie finansowe. Niniejszy materiał oparty jest na pracach wspieranych przez National Science Foundation w ramach grantu nr. EWG 0552584 i 0851519.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmotoryzowany stolik XYZ: 3x T-LSM050A, skok 50 mm na ośZaber TechnologiesT-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Pojedyncza pompa strzykawkowaNew Era Systemy pompNE-1000
Pyrex* Vista* Bezramkowe szklane probówki hodowlane wielokrotnego użytkuCorning07-250-125
Kuwety szklaneStrategie naukoweG102
LabVIEWNational Instruments776671-35
SGE Gazoszczelne strzykawki, Luer LocSigma Aldrich509507
U96 DeepWell Plates 1,3 ml i 2,0 mlThermo Scientific:
WellThermo Scientific: Nunc276000
Typhoon 9400GE Healthcare63-0055-79
Whatman Grade 50 Koła 90 mmWhatman1450-090
Maty Nunc 278743

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
  2. Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
  3. Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
  4. Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
  5. Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
  6. Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
  7. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
  8. Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
  9. Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
  10. Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
  11. Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
  12. Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
  13. Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
  14. Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
  16. Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Combinatorial SynthesisPolyanhydride LibrariesHigh throughput DetectionProtein Release KineticsAutomated DepositionNanoparticle FabricationFluorescence based DetectionPolymer CharacterizationDrug Delivery SystemsBiomaterial Optimization

Powiązane artykuły