Artykuł metodologiczny

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

DOI:

10.3791/3891

⸱

20 lutego 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izotopy stabilne są niezbędnymi narzędziami w biologicznej spektrometrii mas. Historycznie izotopy stabilne 18O były szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów katalitycznych enzymów proteolitycznych1-3. Wraz z pojawieniem się proteomiki opartej na spektrometrii mas, katalityczne włączanie atomów 18O z wody wzbogaconej izotopowo stało się popularną metodą ilościowego porównywania poziomów ekspresji białek (przegląd w pracach Fenselau i Yao4, Miyagi i Rao5 oraz Ye et al.6). Znakowanie 18O stanowi prostą i niskokosztową alternatywę dla technik znakowania chemicznego (np. iTRAQ, ICAT) i metabolicznego (np. SILAC)7. W zależności od zastosowanej proteazy, znakowanie 18O może prowadzić do wbudowania do dwóch atomów 18O w grupie karboksylowej końca C produktu cięcia3. Reakcję znakowania można podzielić na dwa niezależne procesy: rozszczepienie wiązania peptydowego oraz reakcję wymiany tlenu karboksylowego8. W naszej adaptacji enzymatycznego znakowania 18O o nazwie PALeO (protease-assisted labeling employing 18O-enriched water), wykorzystaliśmy wodę wzbogaconą w 18O w stopniu 50% w celu uzyskania charakterystycznych sygnatur izotopowych. W połączeniu z wysokorozdzielczą tandemową spektrometrią mas MALDI-TOF/TOF MS/MS (desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana macierzą z pomiarem czasu przelotu), charakterystyczne obwiednie izotopowe mogą być użyte do identyfikacji produktów cięcia z wysokim poziomem specyficzności. Wcześniej wykorzystaliśmy metodologię PALeO do wykrywania i charakterystyki endogennych proteaz9 oraz monitorowania reakcji proteolitycznych10-11. Ponieważ PALeO koduje samą istotę reakcji cięcia proteolitycznego, układ eksperymentalny jest prosty, a etapy biochemicznego wzbogacania produktów cięcia mogą zostać pominięte. Metodę PALeO można łatwo rozszerzyć o (i) eksperymenty kinetyczne monitorujące dynamikę reakcji cięcia proteolitycznego oraz (ii) analizę proteolizy w złożonych próbkach biologicznych odzwierciedlających warunki fizjologiczne. Eksperymenty PALeO-TimeCourse pomagają w identyfikacji etapów limitujących szybkość procesu oraz produktów pośrednich w złożonych reakcjach szlaków proteolitycznych. Ponadto reakcja PALeO pozwala nam zidentyfikować enzymy proteolityczne, takie jak serynowa proteaza trypsyna, która jest zdolna do ponownego wiązania swoich produktów cięcia i katalizowania wbudowania drugiego atomu 18O. Takie enzymy umożliwiające „podwójne znakowanie” mogą być wykorzystywane do znakowania 18O po trawieniu, w którym peptydy są znakowane wyłącznie poprzez reakcję wymiany tlenu karboksylowego. Nasza trzecia strategia rozszerza znakowanie z użyciem wody wzbogaconej w 18O poza enzymy, wykorzystując niskie pH do wprowadzania sygnatur izotopów stabilnych 18O do peptydów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione przepływy pracy LeO umożliwiają stabilne znakowanie izotopowe trawionych białek oraz syntetycznych peptydów. Te eksperymenty w funkcji czasu (Rysunek 1) mają zastosowanie w badaniach proteomiki porównawczej i ilościowej, a także w badaniach nad proteazami. Każdy przepływ pracy składa się z dwóch etapów doświadczalnych (Rysunek 2): A) pobierania próbek w określonych odstępach czasu z odpowiedniej reakcji kodowanej stabilnym izotopem 18O (rozszczepienie peptydów katalizowane przez proteazę; reakcja wymiany tlenu karboksylowego katalizowana przez proteazę; reakcja wymiany tlenu karboksylowego katalizowana przez kwas) oraz B) analizy za pomocą spektrometrii mas i graficznej reprezentacji kinetyki wbudowy 18O.

A. Eksperymenty z przebiegiem czasowym

I. PALeO-TimeCourse: Oznaczanie miejsc cięcia proteolitycznego za pomocą etykietowania katalizowanego przez proteazy

  1. (Opcjonalnie) Mostki disiarczkowe białek (10 μM) i peptydów (250 μM) redukuje się za pomocą DTT (stężenie końcowe 2,5 mM) w 25 mM NH4HCO3 (obie substancje świeżo przygotowane) poprzez inkubację przez 30 min w 50 °C.
  2. (Opcjonalnie) Wolne cysteiny alkiluje się jodoacetamidem (stężenie końcowe 10 mM) w 25 mM NH4HCO3 poprzez inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. W zależności od analizowanej proteazy, roztwory białek/peptydów muszą zostać oczyszczone w celu usunięcia pozostałości buforu i czynnika alkilującego. Do oczyszczania peptydów należy użyć kolumn wirowych PepClean C-18 (Thermo), a do wymiany buforów w próbkach białek koncentratorów odśrodkowych Vivaspin (Sartorius).
  4. Peptydy/białka należy ponownie rozpuścić lub poddać wymianie w 20 μl buforu reakcyjnego do proteazy (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8.0) zawierającego 1:1 (v/v) końcowo H218O (95%, Sigma Isotec).
  5. Przed dodaniem proteazy należy pobrać próbkę dla punktu czasowego zero: zmieszać 0,5 μl mieszaniny reakcyjnej i 0,5 μl matrycy z kwasu alfa-cyjno-4-hydroksycynamowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA). Nanieść próbkę na płytkę docelową MALDI Opti-TOF 384 (AB SCIEX) i pozostawić krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia (około 5 min).
  6. Rozdzielić roztwór reakcyjny na dwie alykwoaty. Pierwszy alykwoat inkubuje się z odpowiednią proteazą (ECE-1: 75 nM; trypsyna: 0,04 nM) w temperaturze pokojowej lub w temperaturze zalecanej dla danego enzymu. Drugi alykwoat inkubuje się bez proteazy, co służy jako próbka kontrolna. Pierwszy alykwoat stanowi standardową próbkę dla znakowania 18O katalizowanego przez proteazę i może być wykorzystany do identyfikacji peptydów i białek, wykrywania aktywności proteolitycznej oraz monitorowania reakcji cięcia proteolitycznego. Drugi alykwoat służy do wykazania, że inkorporacja 18O jest indukowana przez proteazę; w związku z tym w tej próbce nie oczekuje się ani znakowania, ani cięcia.
  7. Monitorować przebieg reakcji, pobierając alykwoaty reakcyjne i nanosząc je zgodnie z opisem w kroku 5 w odpowiednich odstępach czasu. Opisane powyżej warunki reakcji są stosowane do monitorowania reakcji proteolitycznej do czterech dni (ok. 24 punktów naniesienia). Pobieranie próbek należy rozpocząć co 5 min do 30 min, następnie nanosić co 30 min do 2 h, potem co 1 h do 8 h i co 8 h do 4 dni. Produkty cięcia powinny pojawić się w ciągu pierwszych 12 h, a substrat powinien zostać całkowicie zhydrolizowany po 24 h. Przedłużony czas inkubacji reakcji pozwala na zdefiniowanie stabilnych produktów reakcji, które są odrębne od produktów pośrednich, podlegających dalszemu przetwarzaniu. W zależności od pytania badawczego i danych par enzym-substrat, czasy nanoszenia i temperatura inkubacji muszą być modyfikowane, aby zapewnić optymalne próbkowanie reakcji.
  8. Po naniesieniu ostatniego punktu czasowego reakcji lub w przerwach między wydłużonymi interwałami nanoszenia, płytka docelowa MALDI zostaje poddana analizie MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z poniższym opisem (Sekcja B).

II. PALeO-TimeCourse: znakowanie końców proteolitycznych po trawieniu

  1. (Opcjonalnie) Mostki dwusiarczkowe białek (10 μM) i peptydów (250 μM) redukuje się za pomocą DTT (stężenie końcowe 2,5 mM) w 25 mM NH4HCO3 (oba roztwory świeżo przygotowane) poprzez inkubację przez 30 min w 50 °C.
  2. (Opcjonalnie) Wolne cysteiny alkiluje się jodoacetamidem (stężenie końcowe 10 mM) w 25 mM NH4HCO3 poprzez inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. W zależności od wybranej proteazy, roztwory białek/peptydów należy oczyścić w celu usunięcia pozostałości buforu i czynnika alkilującego. Do oczyszczania peptydów należy użyć kolumienek wirówkowych PepClean C-18, a do wymiany buforu białek koncentratorów wirówkowych Vivaspin.
  4. Oczyszczone produkty peptydowe/białka należy ponownie rozpuścić/wymienić w 20 μl buforu do reakcji proteazy (np. trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8,0) i poddać całkowitemu trawieniu wybraną proteazą (np. trypsyna: 0,04 nM; 37 °C; 12 hr).
  5. Produkty cięcia oczyszcza się za pomocą kolumienek wirówkowych PepClean C-18. Krok ten wyeliminuje resztkową aktywność proteazy.
  6. Oczyszczone produkty peptydowe należy ponownie rozpuścić/wymienić w 20 μl buforu do reakcji proteazy (trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8,0) zawierającego końcowe H218O w stosunku 1:1 (v/v).
  7. Przed dodaniem enzymu należy pobrać próbkę dla punktu czasowego zero: zmieszać 0,5 μl mieszaniny reakcyjnej i 0,5 μl macierzy kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA). Próbkę nanosi się na płytkę docelową MALDI i pozostawia krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do wyschnięcia (około 5 min).
  8. Roztwór reakcyjny dzieli się na dwie aliquoty. Pierwszą aliquotę inkubuje się z wybraną proteazą (np. trypsyna: 0,04 nM) w temperaturze pokojowej lub w temperaturze zalecanej dla danego enzymu. Drugą aliquotę inkubuje się bez proteazy, co służy jako kontrola. Pierwsza aliquota stanowi standardową próbkę dla znakowania 18O po trawieniu katalizowanego przez proteazę i może być wykorzystana do ilościowego oznaczania peptydów i białek. Druga aliquota służy do wykazania, że wbudowanie 18O jest katalizowane przez proteazę; w związku z tym w tej próbce nie spodziewamy się znakowania.
  9. Przebieg reakcji monitoruje się poprzez pobieranie aliquot reakcyjnych i nanoszenie ich zgodnie z opisem w kroku 7 w odpowiednich odstępach czasu. Na przykład, w celu monitorowania reakcji wymiany tlenu karboksylowego katalizowanej przez trypsynę, nanosiliśmy próbki początkowo co 5 min przez 30 min, a następnie co 15 min.
  10. Po naniesieniu próbki dla ostatniego punktu czasowego lub pomiędzy wydłużonymi odstępami nanoszenia, płytkę docelową MALDI poddaje się analizie MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z opisem poniżej (Sekcja B).

III. ALeO-TimeCourse: Etap znakowania grup karboksylowych katalizowany kwasem

  1. Inkubować poszczególne peptydy (50 nM) z wodą wzbogaconą w 18O w stosunku 1:1 (v/v) w obecności lub w nieobecności (kontrola) 0,1% (v/v) końcowego stężenia kwasu trifluorooctowego (objętość całkowita 30 μl).
  2. Pobierać próbki produktów reakcji codziennie przez 48 dni, nakładając 0,5 μl aliquotu mieszaniny wraz z 0,5 μl matrycy z kwasu alfa-cyjanop-4-hydroksycynnamowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA) bezpośrednio na płytkę docelową MALDI.
  3. W przerwach między nakładaniem próbek oraz po nakładaniu próbki z ostatniego punktu czasowego reakcji, przekazać płytkę docelową MALDI do analizy MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z opisem w sekcji B.

B. Pozyskiwanie i analiza danych MALDI-TOF/TOF MS/MS

  1. Widma masowe są rejestrowane przy użyciu analizatora 4800 MALDI TOF/TOF (AB SCIEX).
  2. Przed analizą instrument jest kalibrowany za pomocą mieszaniny standardów peptydowych (Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments) z maksymalną dopuszczalną tolerancją błędu pomiaru masy ± 50 ppm i minimalną liczbą sześciu dopasowanych pików.
  3. Widma MS (zakres mas 400 - 4,000 m/z) są rejestrowane w trzech powtórzeniach w trybie jonów dodatnich z regulowaną intensywnością lasera (3,400 - 3,800; krok 50), przy dopuszczalnym zakresie intensywności piku bazowego 2,000 - 45,000. Dla podwidm rejestrowane są pojedyncze strzały, łącznie 400 strzałów/widmo; warunki zatrzymania wchodzą w życie po zarejestrowaniu 800 podwidm (zatwierdzonych lub odrzuconych) lub po zatwierdzeniu 400 podwidm zgodnie z kryteriami akceptacji. W przypadku próbek o niskiej zawartości analitów lub w obecności złożonego tła biologicznego dolna granica zakresu detekcji MS powinna zostać podniesiona do 800 m/z. Dodatkowo może być konieczne usunięcie soli i innych związków zakłócających za pomocą etapu oczyszczania próbek opisanego wcześniej lub poprzez rozdział LC.
  4. Pliki danych MS (pliki .t2d) są eksportowane z oprogramowania do akwizycji danych 4000 Series Explorer i importowane do wewnętrznego laboratoryjnego systemu informatycznego, który wykorzystuje oprogramowanie MASCOT Distiller (Matrix Science) do przetwarzania widm i detekcji pików. Obwiednie izotopowe są dekonwolucjonowane, a stosunki wbudowania 18O automatycznie wyznaczane przy użyciu algorytmu podobnego do opisanego przez Mason et al.12 i zaadaptowanego przez nasz zespół9. Alternatywnie do dekonwolucji danych typu 18O15,16 można wykorzystać narzędzia programistyczne takie jak ZoomQuant13 i Viper14 oraz komercyjne pakiety oprogramowania, takie jak BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) i Mascot Distiller Quantitation Toolbox (Matrix Science). Stosunki wbudowania 18O są wyrażone jako względne wkłady poszczególnych form izotopowych peptydów (t.j. peptydów zawierających 16O, 18O1 lub 18O2) do całej obwiedni izotopowej.
  5. Dla każdego eksperymentu TimeCourse masy cząsteczkowe ([M+H]+) wszystkich wykrytych form peptydowych są wyodrębniane z powiązanych plików danych MS, a wartości są grupowane w koszyki (bins) o szerokości masy 100 ppm.
  6. Ustalono, że do wypełnienia koszyka wymagane są co najmniej trzy wartości [M+H]+. W przypadku znanych substratów przefiltrowana lista koszyków jest porównywana z listą produktów cięcia proteolitycznego przewidzianych na podstawie sekwencji peptydowej substratu przy użyciu narzędzia ExPASy FindPept17 (http://au.expasy.org/tools/findpept.html) i dopuszczalnej tolerancji błędu masy 200 ppm.
  7. Widma MS/MS są rejestrowane dla wszystkich wartości mas produktów cięcia przewidzianych przez narzędzie FindPept oraz dla wartości koszyków, z którymi powiązane jest wbudowanie 18O. Dane MS/MS są rejestrowane na analizatorze 4800 MALDI TOF/TOF w trybie jonów dodatnich z reflektorem 1kV, przy stałej intensywności lasera 4200 i wyłączonym gazie CID. Dla każdego podwidma rejestrowanych jest 50 strzałów w układzie losowym, do maksymalnie 40 podwidm na plamkę (co daje łącznie 2,000 strzałów/plamka).
  8. Pliki danych MS/MS (pliki .t2d) są eksportowane z oprogramowania do akwizycji danych 4000 Series Explorer i importowane do wewnętrznego laboratoryjnego systemu informatycznego, gdzie detekowane są piki, a listy pików MS/MS są przypisywane do odpowiadających im zgrupowanych danych MS.
  9. W celu identyfikacji peptydów listy pików MS/MS są przeszukiwane w bazie danych SwissProt przy użyciu wyszukiwarki MASCOT z następującymi parametrami: brak specyficzności enzymu, tolerancja masy jonu prekursorowego 150 ppm i jonu fragmentacyjnego 0,2 Da.
  10. Identyfikacje peptydów mogą być dodatkowo walidowane za pomocą oprogramowania Data Explorer (AB SCIEX) poprzez potwierdzenie charakterystycznych wzorów wbudowania 18O w jonach fragmentacyjnych serii y, zgodnie z opisem Shevchenko et al.18.

C. Przygotowanie wykresów czasowych widm oraz wbudowania 18O

Wykresy czasowo-spektralne: pliki danych MS (.t2d) dla każdego punktu czasowego reakcji są eksportowane z oprogramowania Data Explorer jako pliki ASCII za pomocą makra, a następnie importowane do programu do analizy danych i grafiki (np. Origin firmy OriginLab) i przedstawiane w formie wykresów kaskadowych (Rycina 3).

Wykresy wbudowywania 18O: Dla każdego zgrupowanego produktu rozszczepienia peptydów wyznaczono wzglهny wkład poszczególnych gatunków izotopowych peptydów (16O, 18O1 lub 18O2) dla wszystkich punktów czasowych reakcji i narysowano je w funkcji czasu (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy schemat PALeO-TimeCourse do dynamicznego monitorowania wbudowywania stabilnych izotopów 18O w produkty cięcia peptydów generowane przez enzymy proteolityczne. Przedstawione podejście jest wszechstronnym narzędziem do porównawczych badań ścieżek przetwarzania proteolitycznego dla różnych kombinacji substratu i proteazy. Poprzez wielokrotne pobieranie próbek z reakcji proteolitycznych w jej trakcie, eksperyment PALeO-TimeCourse dostarcza rozdzielonych w czasie migawek obfitości substratu i produk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki połączeniu znakowania izotopami stabilnymi i wysokorozdzielczej spektrometrii mas w ujęciu czasowym, metoda PALeO-TimeCourse umożliwia dynamiczną analizę powstawania produktów peptydowych. Test ten może być wykorzystany do generowania peptydów znakowanych izotopami stabilnymi na potrzeby ilościowych i jakościowych badań proteomiki oraz do oceny kinetyki powstawania peptydów proteotypowych. Co więcej, PALeO-TimeCourse została zaprojektowana do oceny szlaków proteolitycznych w specyficznych, fizjologicznie istotnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez grant NIH/NIDCR 1R01DE019796.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumny do oczyszczania PepClean C-18Thermo89870
Płyta docelowa Opti-TOF 384 MALDIAB SCIEX1016629
4800 MALDI TOF/TOFAB SCIEX
Tabela 1. Materiały
Alfa-cyano-4-hydroksycyjanowa kwasSigma Aldrich70990-1G-F
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA3294-10G
Ditiotreitol (DTT)Acros16568-0050
Jodoacetamid (IAM)Sigma Aldrich1149-5G
Endotelina konwertaza-1 (ECE-1)R&D Systems1784-ZN
Trypsyna GoldPromegaV5280
Woda-18O, 97 atom % 18OSigma Aldrich329878-1G
Kwas trifluorooctowy (TFA)Thermo28904
Zestaw standardów masy do kalibracji instrumentów AB SCIEX TOF/TOFAB SCIEX4333604
Tabela 2. Odczynniki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie tlenem 18znakowanie katalizowane proteazprzebieg czasowy PALeOanaliza MALDI TOF MSprodukty rozszczepienia peptyd wwymiana tlenu karboksylowegoanaliza obwiedni izotopowejdynamika szlak w proteolitycznychproteomika izotop w trwa ych

Powiązane artykuły