Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów przy użyciu genomiki pojedynczego wirusa

DOI:

10.3791/3899

⸱

26 maja 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial and Environmental Genomics, The J. Craig Venter Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomika pojedynczego wirusa (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wironów. Zawiesiny wirusów w mieszanym zbiorowisku sortuje się za pomocą cytometrii przepływowej na szkiełko mikroskopowe z dyskretnymi studzienkami zawierającymi agarozę, wychwytując w ten sposób wirion i zmniejszając ścinanie genomu podczas dalszego przetwarzania. Amplifikację całego genomu uzyskuje się za pomocą amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA), w wyniku czego uzyskuje się materiał genomowy odpowiedni do sekwencjonowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja całego genomu i sekwencjonowanie pojedynczych komórek mikrobiologicznych umożliwia charakterystykę genomu bez potrzeby hodowli 1-3. Wirusy, które są wszechobecne i stanowią najliczniejsze istoty na naszej planecie 4 i są ważne we wszystkich środowiskach 5, nie zostały jeszcze ujawnione za pomocą podobnych metod. W tym miejscu opisujemy podejście do izolowania i charakteryzowania genomów pojedynczych wirionów zwane "genomiką pojedynczego wirusa" (SVG). SVG wykorzystuje cytometrię przepływową do izolowania pojedynczych wirusów i amplifikacji całego genomu w celu uzyskania genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (gDNA), które można wykorzystać w kolejnych reakcjach sekwencjonowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zawiesin wirusowych

Przed izolacją pojedynczych wirionów za pomocą cytometrii przepływowej, przygotuj nieutrwalone zawiesiny wirusa.

  1. Wyizoluj cząsteczki wirusa przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów, upewniając się, że końcowa zawiesina wirusa jest zawarta w przefiltrowanym 0,1 μm TE (Tris-EDTA, pH 8). Zalecamy stosowanie metod filtracji z przepływem stycznym (TFF) 6, chociaż opracowano inne metody, które wykorzystują flokulację chemiczną 7.
  2. Zlicz cząsteczki wirusa przy użyciu ustalonych protokołów, np. za pomocą epifluorescencji 8-10 lub cytometrii przepływowej 11,12.
  3. Podwielokrotną zawiesinę wirusa umieścić w dwóch probówkach Eppendorfa (zalecana ostateczna objętość wynosi 1 000 μl).

2. Cytometria przepływowa

  1. Aby sortować wirusy za pomocą cytometru przepływowego BD FACSAria II wyposażonego w niestandardowy Forward Scatter PMT (FSC PMT), rozcieńczyć cząsteczki wirusa w przefiltrowanym 0,1 μm TE, pH 8,0 do odpowiedniego miana dla częstości zdarzeń 200 zdarzeń sec-1.
  2. Ustaw progi, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, np. dla mieszanego zbioru zawierającego cząstki faga T4 i lambda zaleca się: FSC PMT na poziomie 1 000 i SSC na poziomie 200.
  3. Uruchomić 100 μl "ślepych" próbek zawierających tylko 1) TE przefiltrowane 0,1 μm i 2) przefiltrowane 0,1 μm TE i SybrGreen1 przy rozcieńczeniu 1e-4 (10 000X).
  4. Uruchom małą porcję (zalecane 100 μl) niebarwionej zawiesiny wirusa, aby ocenić tło, a następnie wybarwioną zawiesinę wirusa (SybrGreen1 w rozcieńczeniu 1e-4 bulionu), cząsteczki wirusa do łącznej liczby 5000 zdarzeń każda. Ma to na celu sprawdzenie stężenia i w razie potrzeby dostosowanie bramek sortujących przed sortowaniem. Zalecamy szczelną bramę w środku cząsteczek wirusa. Również do generowania bramek używamy wykresu SYBR Green i FSC PMT.
  5. Dodać 5 μl 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) (w buforze TBE) schłodzonej do 37 °C do każdej studzienki na szkiełku mikroskopowym z politetrafluoroetylenu (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
  6. Załaduj szkiełko mikroskopowe PTFE do cytometru przepływowego, aby wychwycić posortowane cząsteczki wirusa.
  7. Rozpocznij rodzaj zielonych cząstek wirusa SYBR bezpośrednio na szkiełku PTFE z agarozą LMP. Zalecamy sortowanie 10 lub więcej zdarzeń (cząstek wirusa) w niektórych studzienkach, aby pomóc w wykrywaniu głębokości wirusów podczas konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CSLM).
  8. Po zakończeniu sortowania usunąć szkiełko z cytometru przepływowego i dodać 5 μl więcej agarozy LMP schłodzonej do temperatury 37 °C do każdej studzienki, osadzając w ten sposób cząsteczkę (cząsteczki) wirusa.

3. Wizualizacja pojedynczych wirionów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Jeśli pożądany jest pojedynczy wirion, konieczne jest określenie, czy każda studzienka zawiera pojedynczego wirusa, a CLSM jest konieczne do wizualizacji osadzonego wirionu (wirionów) w 3D, aby sprawdzić, czy obecna jest tylko jedna cząstka i czy wiele wirusów nie jest ułożonych jeden na drugim.

  1. Ustaw laser mikroskopowy na długość fali wzbudzenia 488 nm.
  2. Zobrazuj osadzone cząsteczki wirusa za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej 63X.

4. Amplifikacja całego genomu

  1. Po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirusami za pomocą CLSM należy przeprowadzić amplifikację całego genomu za pomocą amplifikacji wielokrotnego przemieszczenia (MDA) w agarozie (in situ).
  2. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia zanieczyszczenia DNA, należy usunąć pożądane "kulki" agarozy ze szkiełka i umieścić w sterylnej probówce do PCR. Do tego kroku użyj sterylnej pęsety i/lub żyletki.
  3. Lizować cząsteczkę wirusa in situ za pomocą ciepła (94 °C) przez 3 minuty w bloku grzewczym termocyklera.
  4. Przeprowadzić reakcję MDA zgodnie z zaleceniami producenta (zestaw GenomiPhi HY, GE Healthcare) z następującymi modyfikacjami
    1. Zmniejszyć objętość próbki i reakcyjnych do 11,25 μl i inkubować w temperaturze 30 °C przez maksymalnie 2 godziny w celu zmniejszenia niespecyficznej amplifikacji.
  5. Oczyścić amplifikowany materiał genomowy, przenosząc genomowe DNA (gDNA) do probówki Eppendorfa o pojemności 1,7 ml i dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (NaOAc) do buforu TBE (ten sam bufor, który jest używany w preparacie agarozy LMP).
  6. Umieścić próbkę(-i) w temperaturze 55 °C na 10 minut w celu rozpuszczenia agarozy.
  7. Przesunąć probówkę (probówki) do temperatury 42 °C, aby obniżyć temperaturę przed dodaniem enzymu.
  8. Dodaj 2 jednostki β-agarazy do każdej probówki i inkubuj przez 2 godziny.
  9. Dodać 1 objętość nasyconego buforem roztworu fenolu do probówki, energicznie wymieszać i odwirować przy 3 500 x g przez 15 minut. Przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki Eppendorfa o pojemności 1,7 ml.
  10. Dodaj jedną objętość 100% izopropanolu i 1 μl Glycoblue. Dobrze wymieszaj, odwracając rurkę.
  11. Wirować przy 28 000 x g w temperaturze 4 °C przez 60 min. Zdekantować izopropanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Do każdej probówki dodać 150 μl 70% etanolu. Wiruj z prędkością 28 000 g i kątem obrotu przez 10 minut. Zdekantować etanol, wysuszyć na powietrzu osad DNA i ponownie zawiesić DNA w odpowiedniej objętości buforu TE.
  12. Zalecamy powtórzenie kroków 4.4-4.9 z następującymi modyfikacjami. Ustawić 3-5 powtórzonych reakcji MDA i zmniejszyć inkubację w temperaturze 30 °C do 1 godziny. Próbki należy pobrać po oczyszczeniu i wytrącić przy użyciu 95-100% etanolu w celu uzyskania pożądanego stężenia.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 podsumowuje proces SVG. Metody te wykorzystują cytometrię przepływową do sortowania cząstek wirusa na szkiełkach mikroskopowych z PTFE zawierających agarozę w celu wyizolowania pojedynczych wirionów z mieszanego zbiorowiska, a następnie MDA w celu uzyskania ilości gDNA wystarczających do sekwencjonowania.

Jako dowód słuszności koncepcji, bakteriofag lambda i T4 zostały zmieszane i poddane procesowi SVG 11. Po wychwyceniu wirionów i osadzeniu ich w agarozie, CLSM użyto do wizualizacji i potwierdzenia, że uzyskano pojedynczy wirion; Wyniki przedstawiono na rysunku 2. Po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirionami, wybrano je do MDA gDNA. Następnie użyliśmy multipleksowego PCR specyficznego dla T4 i lambda, aby zidentyfikować wyizolowany wirion, ryc. 3. Do sekwencjonowania genomu wybrano wyizolowany lambda.

Sekwencjonowanie genomu zostało przeprowadzone przy użyciu technologii 454-Titanium, a odczyty sekwencjonowania zostały poddane mapowaniu referencyjnemu w celu określenia poziomu pokrycia uzyskanego przy użyciu SVG. Rycina 4 pokazuje, że odzyskano prawie cały genom lambda (z wyjątkiem pierwszych 5 pz).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Metodologia SVG. Zawiesiny wirusa zawierające mieszany zespół są redukowane do pojedynczych cząstek wirusa za pomocą cytometrii przepływowej, które są następnie sortowane na pojedyncze "kulki" agarozy. Wirus jest osadzany w kulce agarozy poprzez nałożenie na nią dodatkowej warstwy sortowania cytometrycznego po przepływie agarozy. Na koniec amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana in situ.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Konfokalny, laserowy mikroskop skaningowy sortowanej cząsteczki wirusa osadzonej w kulce agarozy. A) Trójwymiarowa rekonstrukcja cząsteczki wirusa barwionej kolorem Sybr Green I w kulce agarozy. Wstawka: większe powiększenie wyizolowanej cząsteczki wirusa. B) Wykres profilu względnej fluorescencji wybarwionej pojedynczej cząstki wirusa w kulce agarozowej.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Identyfikacja bakteriofagów za pomocą PCR. A) Multiplex PCR z użyciem starterów T4 i specyficznych dla lambda do genotypu, Ścieżki: 1. TrackIt 1 kb plus drabinka (Invitrogen), 2. integraza lambda (750 pz), 3. Białko główne kapsydu T4 (1,050 pz), 4. Mieszanina integrazy lambda i białka kapsydu głównego T4. B) Późniejszy PCR swoisty lambda z dodatkowymi loci w celu dalszego potwierdzenia izolacji genomu faga, Pasy: 1. Integraza lambda (750 pz), 2. Represor lambda (356 pz) 3. Lambda sie (wykluczenie nadkażenia) (456 pz) 4. TrackIt 1 kb plus drabinka (Invitrogen).

figure-protocol-4
Rysunek 4. Atrybuty i pokrycie genomu lambda. A) wykres GC, B) Mapa genomu lambdy (zaadaptowana z http://img.jgi.doe.gov), oraz C) Mapowanie SVG odczytuje do referencyjnego lambda bakteriofaga, oś x to pozycja genomu, oś y to % pokrycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy stosowaniu podejść SVG należy wziąć pod uwagę kilka ważnych czynników. Genotypowanie, które przeprowadzono podczas eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji 13, nie jest ważną opcją dla izolatów środowiskowych lub nieznanych, ponieważ konserwatywne startery nie są dostępne we wszystkich grupach wirusów. Również synteza DNA w tle lub amplifikacja niespecyficzna jest często zgłaszana podczas amplifikacji przy użyciu reakcji MDA 14. Amplifikację niespecyficzną przypisuje się zanieczyszczen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Kenowi Nealsonowi za jego spostrzeżenia i rady podczas procesu przygotowania manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X Bufor TEInvitrogen12090-015
Fenol nasycony buforemInvitrogen15513-039
Zestaw GenomiPhi HYGE Healthcare25-6600-22
GlycoblueInvitrogenAM951615 mg/ml
LMP agarozaInvitrogen16520100
Szkiełko mikroskopowe PTFEElektron Mikroskopia Sciences63430-0424 dołki, średnica 4 mm
SybrGreenInvitrogenS758510,000X
β-agaraseNew England BiolabsM0392S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
  2. Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
  3. Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
  4. Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
  5. Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
  6. Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456(2008).
  7. John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
  8. Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  9. Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
  10. Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
  11. Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
  12. Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
  13. Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
  14. Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Virus GenomicsFlow Cytometry SortingWhole Genome AmplificationConfocal Microscopy ValidationMultiple Displacement AmplificationHigh Throughput SequencingBioinformatic AnalysisViral Genome AssemblySingle Virion IsolationGenome Amplification

Powiązane artykuły