Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Podsumowanie

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Streszczenie

Oksydaza NADPH jest kluczowym enzymem pośredniczącym w przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybiczej obronie organizmu. Oprócz roli w przeciwdrobnoustrojowej obronie gospodarza, oksydaza NADPH pełni istotne funkcje sygnalizacyjne modulujące odpowiedź zapalną ¹. W związku z tym opracowanie metody pomiaru kinetyki generowania ROS pochodzących z oksydazy NADPH w czasie rzeczywistym powinno stanowić wartościowe narzędzie badawcze do zrozumienia mechanizmów istotnych dla obrony organizmu, stanu zapalnego oraz uszkodzeń tkanek.

Przewlekła ziarniniakoza (CGD) jest dziedziczną chorobą oksydazy NADPH, charakteryzującą się ciężkimi infekcjami i nadmiernym stanem zapalnym. Aktywacja oksydazy NADPH w fagocytach wymaga translokacji jej subunit cytozolowych (p47^phox, p67^phox oraz p40^phox) i Rac do związanego z błoną flawocytochromu (składającego się z heterodimeru gp91^phox i p22^phox). Mutacje powodujące utratę funkcji w dowolnym z tych komponentów oksydazy NADPH prowadzą do rozwoju CGD. Podobnie jak u pacjentów z CGD, myszy z niedoborem gp91^phox oraz myszy z niedoborem p47^phox wykazują defektywną aktywność oksydazy NADPH w fagocytach i upośledzoną odporność organizmu ^{2, 13}. Poza fagocytami, które zawierają opisane wyżej komponenty oksydazy NADPH, różne inne typy komórek wykazują ekspresję różnych izoform oksydazy NADPH.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego oznaczania produkcji ROS u żywych myszy oraz określania udziałuy NADPH oksydazy w generowaniu ROS w modelach stanu zapalnego i uszkodzeń. Metoda ta opiera się na reakcji ROS z L-012 (analogiem luminolu), w wyniku której emitowana jest luminescencja rejestrowana przez urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD). W pierwotnym opisie sondy L-012 wykazano, że chemiluminescencja zależna od L-012 była całkowicie zniesiona przez dysmutazę ponadtlenkową, co wskazuje, że głównym wykrywanym w tej reakcji ROS był anion ponadtlenkowy ¹⁴. Późniejsze badania wykazały, że L-012 może wykrywać inne wolne rodniki, w tym reaktywne formy azotu ^{15, 16}. Kielland et al. ¹⁶ wykazali, że miejscowe zastosowanie myristonianu forbolu, silnego aktywatora NADPH oksydazy, prowadzi do zależnej od NADPH oksydazy generacji ROS, którą można było wykryć u myszy przy użyciu luminescencyjnej sondy L-012. W tym modelu wykazali oni, że luminescencja zależna od L-012 była zniesiona u myszy z niedoborem p47^phox.

Porównaliśmy generowanie ROS u myszy typu dzikiego oraz u myszy z niedoboremy oksydazy NADPH p47^{phox-/- 2} w następujących trzech modelach: 1) podaniu intratrachealnym zymosanu, pro zapalnego produktu pochodzącego ze ścian komórkowych grzybów, który może aktywować oksydazę NADPH; 2) podwiązaniu i perforacji kątnicy (CLP), modelu sepsy wewnątrzbrzusznej z wtórnym ostrym zapaleniem i uszkodzeniem płuc; oraz 3) podaniu doustnym tetrachlorku węgla (CCl₄), modelu uszkodzenia wątroby zależnego od ROS. Modele te zostały wybrane specjalnie w celu oceny generowania ROS zależnego od oksydazy NADPH odpowiednio w kontekście stanu zapalnego o charakterze nieinfekcyjnym, sepsy polimikrobowej oraz uszkodzenia narządów indukowanego toksynami. Porównanie bioluminescencji u myszy typu dzikiego z myszami p47^phox-/- pozwala nam określić specyfny wkład ROS generowanych przez oksydazę NADPH zawierającą p47^phox w sygnał bioluminescencyjny w tych modelach.

Wyniki obrazowania bioluminescencyjnego, które wykazały zwiększone poziomy ROS u myszy typu dzikiego w porównaniu z myszami p47^phox-/-, wskazały, że oksydaza NADPH jest głównym źródłem generowania ROS w odpowiedzi na bodźce zapalne. Metoda ta zapewnia małoinwazyjne podejście do monitorowania generowania ROS w czasie rzeczywistym podczas stanu zapalnego in vivo.

Protokół

1. Modele zwierzęce

1. Myszy: Należy wykorzystać myszy p47^phox-/- oraz myszy C57BL6/DBA dopasowane pod względem wieku i płci. Należy uzyskać zgodę na przeprowadzenie eksperymentów z Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).
2. Znieczulenie: Do indukcji znieczulenia należy zastosować system ciągłego podawania izofluranu. System waporyzacji (VetEquip) wypełnia się izofluranem (2-3%). Należy potwierdzić pełne znieczulenie myszy, obserwując oddech, ruchy oraz odruch rogówkowy w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne.
3. Procedury chirurgiczne: Obszar chirurgiczny (blat) należy przemyć 70% etanolem. Należy założyć sterylne rękawiczki, czysty fartuch chirurgiczny i maskę. Myszy należy przygotować poprzez przycięcie sierści i naprzemienne nakładanie betadyny oraz 70% etanolu w miejscu, w którym zostanie wykonane cięcie. Operację należy przeprowadzić na sterylnej powierzchni, używając sterylnych instrumentów. Po operacji należy monitorować myszy do momentu odzyskania przytomności i swobodnego poruszania się.
4. Dotchawicze podanie zymosanu
   1. Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.
   2. Obszar chirurgiczny (szyja) należy zdezynfekować betadyną i 70% etanolem, a następnie odsłonić tchawicę poprzez dyssekcję chirurgiczną.
   3. Tchawicę należy przebić igłą 27G i wstrzyknąć zymosan (St. Louis, MO) w dawce 1 μg/g, stosując roztwór o stężeniu 0,5 μg/μl (objętość całkowita 50 μl dla myszy o masie 25 g) rozpuszczony w sterylnym PBS.
   4. Ranę na szyi myszy należy zamknąć sterylnymi szwami jedwabnymi 5-0 w warunkach aseptycznych.
   5. Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.
5. Ligacja i punkcja kątnicy
   1. Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.
   2. W obszarze chirurgicznym (brzuch) należy przyciąć sierść i zdezynfekować skórę betadyną oraz 70% etanolem.
   3. Należy wykonać laparotomię pośrodkową i zlokalizować kątnicę.
   4. Dystalną część odsłoniętej kątnicy (50%) należy podwiązać szwem jedwabnym 4-0, a następnie wykonać punkcję kątnicy dystalnie względem ligacji za pomocą jednego przejścia igły 21G.
   5. Cięcie należy zamknąć sterylnymi szwami jedwabnymi 4-0.
   6. Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.
6. Doustne podanie tetrachlorek węgla (CCl₄)
   1. Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.
   2. CCl₄ (2 μg/g, St. Louis, MO) rozpuszczony w oleju kukurydzianym należy podać poprzez zgłębnik doustny. Procedura podawania CCl4 powinna być przeprowadzona w wyznaczonym obszarze, zgodnie z wytycznymi IBC/EHS.
   3. Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.

2. Pozyskiwanie obrazu bioluminescencyjnego

1. Uruchomić system obrazowania IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA), ustawiając go w trybie luminescencji, i odczekać do ustabilizowania się temperatury matrycy CCD (charge-coupled device).
2. Wybrać ustawienia czasu ekspozycji, binningu (medium) oraz przysłony F/Stop (8).
3. Umieścić myszy w pozycji grzbietnej w komorze obrazowania na podgrzewanym stole, aby utrzymać normalną temperaturę ciała. Podać znieczulenie zgodnie z opisem w punkcie 1.2 za pomocą maski nosowej, gdy myszy znajdują się w komorze obrazowania IVIS.
4. W każdym punkcie czasowym wybranym do obrazowania podać dożylnie drogą zaoczno-orbitarną L-012 (20 μg/g) rozpuszczony w sterylnym PBS (10 μg/μl).
5. Przystąpić do rejestracji obrazów od 2 min po wstrzyknięciu L-012. Zazwyczaj stosujemy czas ekspozycji wynoszący 40 sec.

3. Analiza danych z wykorzystaniem obszaru zainteresowania (ROI)

1. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania Living Image v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
2. Otwórz obraz i wybierz narzędzia pomiaru obszaru zainteresowania (Region of Interest).
3. Wybierz kształt i rozmiar obszaru zainteresowania w obrębie klatki piersiowej i/lub brzucha, po nałożeniu pseudokolorowego obrazu cyfrowego (reprezentującego detekcję fotonów) na zdjęcie fotograficzne myszy.
4. Ilościowo określ intensywność sygnału (strumień fotonów) z obszaru zainteresowania.

4. Statystyka

1. Użyj pakietu oprogramowania do analizy statystycznej w celu przeprowadzenia dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Bonferroniego dla poszczególnych punktów czasowych.

5. Reprezentatywne wyniki

Zymosan jest prozapalnym produktem ścian komórkowych drożdży i silnym aktywatorem NADPH oksydazy ³. Wcześniej wykazaliśmy, że intratrachealne podanie zymosanu indukuje silniejszy neutrofilny stan zapalny płuc oraz produkcję cytokin prozapalnych u myszy p47^phox-/- w porównaniu do myszy typu dzikiego ¹. W niniejszym badaniu naszym celem było porównanie generowania ROS w płucach myszy typu dzikiego oraz myszy p47^phox-/- po podaniu zymosanu. 4 h po intratrachealnej administracji zymosanu zaobserwowaliśmy istotny wzrost emisji fotonów w obrębie klatki piersiowej u myszy typu dzikiego w porównaniu do poziomu bazowego, a także wzrost emisji fotonów u myszy typu dzikiego w porównaniu do myszy p47^phox-/- po 4 h i 24 h. W przeciwieństwie do tego, sygnały bioluminescencji u myszy p47^phox-/- pozostały na poziomach bazowych 4 h po podaniu zymosanu (Rys.1 A-B). Zatem NADPH oksydaza wydaje się być głównym źródłem generowania ROS w płucach po podaniu zymosanu.

Następnie oceniono produkcję ROS w modelu sepsy indukowanej przez CLP. Sepsis jest zagrażającym życiu zespołem związanym z uszkodzeniem narządów końcowych, w tym z ostrym uszkodzeniem płuc (ALI) i zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) ^{4, 5}. Uważa się, że uszkodzenia zapśredniczone przez ROS są istotnym czynnikiem napędzającym wielonarządową niewydolność wywołaną sepsą. Stwierdzono, że w myszach typu dzikiego po CLP poziom ROS był znacząco podwyższony w obrębie klatki piersiowej (4 hr) oraz brzucha (24 hr) w porównaniu z wartością bazową. Natomiast poziomy ROS u myszy p47^phox-/- były zbliżone do poziomów bazowych w obu punktach czasowych (Rys. 2 A-C). Wyniki te pokazują, że generowanie ROS w mysim modelu sepsy indukowanej przez CLP jest zależne od oksydazy NADPH.

Na koniec zastosowano obrazowanie bioluminescencyjne do wykrycia produkcji ROS w modelu uszkodzenia wątroby indukowanego CCl₄. CCl₄ wywołuje martwicę hepatocytów i jest stosowany do modelowania zarówno ostrego uszkodzenia wątroby, jak i włóknienia wątroby ⁶. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych modeli stanu zapalnego i uszkodzenia, stwierdzono, że produkcja ROS w jamie brzusznej u myszy p47^phox-/- była umiarkowanie (około 35%) zwiększona względem wartości bazowej w 4 h po podaniu CCl₄. Jednakże skala generowania ROS indukowanego przez CCl₄ była znacznie większa u myszy typu dzikiego niż u myszy p47^phox-/- (Rys. 3 A-B). Dane te sugerują, że w ostrym uszkodzeniu wątroby indukowanym przez CCl₄ zachodzi generowanie ROS zarówno zależne od NADPH oksydazy zawierającej p47^phox , jak i niezależne od niej.

Rycina 1. Produkcja ROS w płucach po podaniu zymosanu. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS. Zauważmy, że oprócz klatki piersiowej, luminescencję można wykryć nad brzuchem u myszy typu dzikiego oraz p47^phox-/-, a luminescencja brzuszna nie ulega zmianie po podaniu zymosanu. B) Liczba fotonów z klatki piersiowej myszy typu dzikiego i p47^phox-/- po pojedynczej intratrachealnej (IT) iniekcji zymosanu. Obrazowanie bioluminescencyjne wykonano w punkcie wyjściowym, po 4 h i po 24 h. Emisję światła z obszaru zainteresowania nad klatką piersiową określono przy użyciu wskazanej skali pseudo-kolorów. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE, n=6-9 na grupę, *=p<0.05. Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę.

Rycina 2. Wykrywanie ROS po CLP. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS, B) liczba fotonów z klatki piersiowej oraz C) liczba fotonów z jamy brzusznej myszy typu dzikiego i p47^phox-/- w stanie wyjściowym, 4 h i 24 h po CLP. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE; n=4-5 na grupę, *=p<0.05. Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę.

Rysunek 3. Produkcja ROS w jamie brzusznej po uszkodzeniu wątroby indukowanym CCl₄. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS oraz B) liczba fotonów w jamie brzusznej myszy typu dzikiego i myszy p47^phox-/- w stanie wyjściowym, 4 h i 24 h po doustnym podaniu CCl₄. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE; n=4-5 na grupę, *=p<0.05. Kliknij tutaj, aby powiększyć rysunek.

Dyskusja

Pomiar reaktywnych form tlenu (ROS) w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt można przeprowadzić z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych i chemiluminescencyjnych. Podczas gdy sondy fluorescencyjne charakteryzują się słabym stosunkiem sygnału do szumu ¹², opisana technika obrazowania wykazuje większą czułość w detekcji emisji światła następującej po reakcji chemicznej ROS z substratem L-012 opartym na luminolu. Podobnie jak wszystkie techniki obrazowania bioluminescencyjnego, metodologia ta jest ograniczona prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
tetrachlorek węgla	Sigma, St. Louis, MO	289116