W niniejszym artykule opisano procedurę syntezy hydrofobowo modyfikowanej membrany Nafion do unieruchamiania enzymów, sposób unieruchamiania białek i/lub enzymów wewnątrz membrany oraz metodę testowania ich aktywności specyficznej.
Artykuł metodologiczny
Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatniej dekady pojawiło się wiele zastosowań unieruchomionych i stabilizowanych enzymów, w tym w biokatalizie, biosensorach i ogniwach paliwowych.1-3 W większości zastosowań bioelektrochemicznych enzymy lub organella są unieruchamiane na powierzchni elektrody przy użyciu odpowiedniego rodzaju macierzy polimerowej. Rusztowanie polimerowe powinno zapewniać stabilność enzymów oraz umożliwiać łatwą dyfuzję cząsteczek i jonów do macierzy i z niej. Większość polimerów stosowanych do tego typu unieruchamiania opiera się na poliaminach lub polialkoholach – polimerach, które naśladują naturalne środowisko kapsułkowanych enzymów i stabilizują je poprzez wiązania wodorowe lub jonowe. Inna metoda stabilizacji enzymów polega na wykorzystaniu miceli, które zawierają regiony hydrofobowe zdolne do kapsułkowania i stabilizacji enzymów.4,5 W szczególności grupa Minteera opracowała polimer micelarny na bazie komercyjnie dostępnego Nafionu.6,7 Sam Nafion jest polimerem micelarnym, który umożliwia wspomaganą kanałami dyfuzję protonów i innych małych kationów, jednak micele i kanały są niezwykle małe, a polimer jest bardzo kwasowy ze względu na łańcuchy boczne kwasu sulfonowego, co jest niekorzystne dla unieruchamiania enzymów. Jednakże, gdy Nafion zostanie zmieszany z nadmiarem hydrofobowych soli alkilowych amoniu, takich jak bromek tetrabutylamoniu (TBAB), kationy amoniowe czwartorzędowe zastępują protony i stają się przeciwjonami grup sulfonowych w łańcuchach bocznych polimeru (Rysunek 1). Prowadzi to do powstania większych miceli i kanałów wewnątrz polimeru, które umożliwiają dyfuzję dużych substratów i jonów niezbędnych do funkcji enzymatycznych, takich jak nikotynamido-adenyno-dinukleotyd (NAD). Ten zmodyfikowany polimer Nafion był wykorzystywany do unieruchamiania wielu różnych typów enzymów, a także mitochondriów, w zastosowaniach w biosensorach i ogniwach paliwowych.8-12 Niniejsza praca opisuje nową procedurę wytwarzania tej micelarnej polimerowej membrany do unieruchamiania enzymów, która pozwala na ich stabilizację. Poniżej szczegółowo opisano syntezę micelarnej membrany do unieruchamiania enzymów, procedurę unieruchamiania enzymów w membranie oraz analizy służące do badania aktywności specyficznej unieruchomionego enzymu.
Protokół
1. Modyfikacja Nafionu solami amonu czwartorzędowego
- Energicznie wstrząsać butelką z 5% w/v zawiesiną Nafion przez około 30 sekund, aby zapewnić jednolite zawieszenie Nafion w roztworze.
- Odpipetować 2 mL ponownie zawieszonego Nafion do szklanej fiolki (pojemność fiolki może wynosić od 2,5 mL do 10 mL).
- Odważyć 3-krotny nadmiar molowy (w stosunku do grup kwasu sulfonowego w polimerze Nafion) soli bromku alkiloamoniowego (odpowiednie masy przedstawiono w Tabeli 1) i dodać go do fiolki zawierającej 2 mL Nafion.
- Mieszać fiolkę na wstrząsarce typu Vortex z prędkością 1500 rpm przez 10-15 minut.
- Wlać lepki roztwór do plastikowej tacki wagowej o wymiarach około 3 x 3 cali, a następnie za pomocą pipety przenieść resztę roztworu z fiolki do tacki wagowej.
- Pozostawić rozpuszczalniki do odparowania z tacki wagowej, aż na dnie powstanie żółto-brązowa, przezroczysta błona (Rycina 2). Szybkość odparowania rozpuszczalnika powinna być taka, aby odparowanie całego rozpuszczalnika trwało ponad 6 godzin. Jeśli rozpuszczalnik odparuje zbyt szybko, zamiast przezroczystej błony utworzy się biały, skorupowaty materiał, co wskazuje na zniszczenie struktury micelarnej polimeru i konieczność powtórzenia procedury. Jeśli odparowanie rozpuszczalnika jest zbyt wolne, może być konieczne zastosowanie osuszacza powietrza, ponieważ zbyt powolne odparowanie zazwyczaj prowadzi do powstania lepkiego, pomarańczowego żelu i wymaga powtórzenia procedury. Typowy zakres temperatur odparowania rozpuszczalnika wynosi 20 - 37 °C. Rzeczywiste warunki suszenia zależą od wilgotności względnej i temperatury w pomieszczeniu, jednak ważne jest, aby suszenie przebiegało powoli w celu zachowania struktury miceli, ale nie tak wolno, by doprowadzić do powstania żelu.
- Wypełnić tackę wagową wodą dejonizowaną o rezystywności 18M Ωcm (10-20 mL wody), przykryć i pozostawić do namoczenia na 12-24 godziny, aby usunąć nadmiar soli bromku alkiloamoniowego i HBr.
- Wylać (lub odpipetować) wodę i wypłukać 3 razy wystarczającą ilością wody DI, aby za każdym razem wypełnić tackę. Należy uważać, aby nie uszkodzić i nie zgubić błony polimerowej podczas tego etapu.
- Pozostawić tackę wagową bez przykrycia, aż polimer całkowicie wyschnie. W tym momencie polimer powinien być przejrzystą i nieco kruchą błoną plastikową. Ponownie, jeśli powietrze jest bardzo wilgotne, może być konieczne zastosowanie osuszacza powietrza, aby zakończyć odparowanie w odpowiednim czasie.
- Za pomocą szpatułki ostrożnie usunąć wysuszoną błonę z tacki wagowej i przenieść ją do czystej szklanej fiolki.
- Dodać 2 mL etanolu oraz 3 ceramiczne kulki do mieszania i mieszać na wstrząsarce Vortex przez 4 godziny lub do całkowitego ponownego zawieszenia błony polimerowej.
2. Immobilizacja enzymów w Nafionie zmodyfikowanym TBAB do testów aktywności
- W przypadku enzymu w formie proszku, odważ 1-10 mg enzymu do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i dodaj 1 mL 100 mM buforu fosforanowego o pH 7, aby przygotować roztwór enzymu o stężeniu 1-10 mg/mL. W przypadku enzymu w formie roztworu, przeprowadź analizę kwasu bicinchoniminowego (BCA)13 w celu oznaczenia ilości białka, a następnie dodaj odpowiednią ilość 100 mM buforu fosforanowego, aby uzyskać stężenie białka 1-10 mg/mL. Stężenie 1-10 mg/mL zazwyczaj odpowiada 1-50 nanomolom/mL.
- Do 120 μL roztworu enzymu o stężeniu 1 mg/mL dodaj 60 μL roztworu Nafionu modyfikowanego alkilowym amoniakiem i mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 sekund. (Mieszaninę tę można przygotować w większej objętości dla dużej liczby powtórzeń. Zachowaj stosunek roztworu enzymu do polimeru wynoszący 2:1).
- Pipetą nanieś 60 μL roztworu enzymu/polimeru na dno 3 oddzielnych kuwet o powierzchni 1 cm2 i pozostaw do wyschnięcia przez noc.
3. Analiza aktywności unieruchomionego enzymu dehydrogenazy zależnej od NAD
- Do kuwety dodać 1,3 mL 50 mM pirofosforanu sodu (pH 8,8), 1,5 mL 15 mM NAD (świeżo przygotowanego) oraz 0,1 mL wody.
- Kuwetę umieścić w spektrofotometrze UV/Vis (np. ThermoScientific Evolution 260 Bio lub Thermo Spectronic Genesys 20) ustawionym na długość fali 340 nm.
- Wyzerować spektrometr, a następnie dodać 0,1 mL etanolu. Wymieszać odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 5 razy. W celu przygotowania próby ślepej zamiast 0,1 mL etanolu dodać 0,1 mL wody.
- Zmierzyć absorbancję przy 340 nm w 5. i 20. minucie po dodaniu odczynników do kuwety. Wykreślić dwa punkty danych, aby wyznaczyć nachylenie linii, które zostanie wykorzystane do obliczeń aktywności.
4. Analiza aktywności unieruchomionych dehydrogenaz zależnych od PQQ
- Do kuwety dodać 1,5 mL fosforanu sodu (pH 7,3) oraz 200 μL PMS o stężeniu 600 μM.
- Umieścić kuwetę w spektrofotometrze UV/Vis ustawionym na długość fali 600 nm, a następnie wyzerować spektrometr.
- Dodać 100 μL DCIP o stężeniu 700 μL oraz 200 μL odpowiedniego substratu (etanolu, acetaldehydu, glicerolu, glukozy lub gliceraldehydu) i wymieszać odczynniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 5 razy. W przypadku próby ślepej zamiast substratu użyć 200 μL wody.
- Zmierzyć absorbancję przy 600 nm w 5. oraz 20. minucie po dodaniu odczynników do kuwety.
5. Analiza aktywności unieruchomionej oksydazy glukozowej
- Do kuwety dodać 2,0 mL roztworu zawierającego 0,2 M kwas p-hydroksybenzoowy, 0,02 % (w/v) azoteku sodu, 128 U peroksydazy, 0,3 mM 4-aminoantipiryny, 1 M fosforanu potasu oraz 50 mM glukozy. Wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół 5 razy.
- Umieścić kuwetę w spektrofotometrze UV/Vis ustawionym na długość fali 510 nm.
- Zmierzyć absorbancję przy 510 nm w 5. minucie po dodaniu odczynników do kuwety oraz ponownie w 20. minucie.
6. Reprezentatywne wyniki
Struktura micelarna zmodyfikowanego polimeru Nafion może zostać zniszczona w przypadku zbyt szybkiego suszenia oryginalnej folii współodtłuszczonej z soli i polimeru. Rysunek 2 przedstawia mieszaninę soli i polimeru, która została wysuszona prawidłowo, w wyniku czego powstała przezroczysta, jasnobrązowa folia. Zbyt szybkie suszenie folii może doprowadzić do powstania nieprzezroczystych, białych płatków polimeru z powodu faktu, że proces suszenia może zniszczyć strukturę micelarną.
Po zmieszaniu zmodyfikowanego polimeru Nafion z enzymem i ich wspólnym odlewaniu na dno kuwety, można przeprowadzić testy aktywności enzymatycznej w celu oceny stabilności enzymu wewnątrz filmu polimerowego. Tabele 2-4 przedstawiają odpowiednio wyniki testów dla dwóch dehydrogenaz oraz oksydazy glukozowej unieruchomionych w różnych zmodyfikowanych filmach Nafion. Należy zwrócić uwagę na wyższą aktywność enzymów unieruchomionych w porównaniu do enzymów w roztworze buforowym, co wskazuje, że zmodyfikowane polimery Nafion mogą w rzeczywistości zwiększać aktywność niektórych enzymów (zjawisko to nazywa się superaktywnością). Inne enzymy wykazują ograniczenia transportowe, które zmniejszają ich aktywność właściwą po unieruchomieniu w polimerze (np. celulazy i amylazy, których substraty są bardzo dużymi makrocząsteczkami).
| Zastosowana sól quaternaryjna amoniaku | trzykrotny nadmiar |
| T3A (bromek tetrapropylammonium) | 32,37 mg/ml |
| TBAB (bromek tetrabutylammoniumu) | 39,19 mg/ml |
| TPAB (bromek tetrapentyloammony) | 46,01 mg/ml |
| TEHA (bromek trietyloheksyloamoniowy) | 32,37 mg/ml |
| TMHA (bromek trimetyloheksyloamoniu) | 27,25 mg/ml |
| TMOA (bromek trimetylooctyloamoniowy) | 30,66 mg/ml |
| TMDA (bromek trimetyldecyloamoniowy) | 34,07 mg/ml |
| TMDDA (bromek trimetyldodecyloamoniu) | 37,48 mg/ml |
| TMTDA (bromek trimetylotetradecyloamoniowy) | 40,89 mg/ml |
| TMHDA (bromek trimetyluheksadecyluamoniowy) | 44,31 mg/ml |
| TMODA (bromek trimetylooktadecyloamoniu) | 47,71 mg/ml |
Tabela 1. Ilości soli tetra-alkilowych amonu do modyfikacji polimeru Nafion.
| Typ Nafionu | Aktywność enzymatyczna (U/g) |
| Bufor (bez polimeru) | 16.63 ± 8.11 |
| Nafion (niemodyfikowany) | 9.25 ± 2.21 |
| TMTDA | 3.23 ± 2.92 |
| TBAB | 3.93 ± 3.33 |
| TMDDA | 4.19 ± 1.04 |
| TMOA | 3.51 ± 1.11 |
| TMDA | 8.00 ± 4.53 |
| TMHA | 1.68 ± 1.39 |
| TMHDA | 4.83 ± 0.99 |
| TMODA | 10.45 ± 3.20 |
Tabela 2. Aktywność dehydrogenazy glukozowej zależnej od NAD unieruchomionej w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność unieruchomiona jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
| Typ membrany Nafion | Aktywność enzymatyczna (mU/g) |
| Bufor (bez polimeru) | 7.18 ± 0.51 |
| Nafion (niezmodyfikowany) | 70.1± 0.5 |
| TMTDA | 133 ± 6 |
| TBAB | 244 ± 4 |
| TMDDA | 221 ± 6 |
| TMOA | 1.78 ± 0.63 |
| TMDA | 206 ± 5 |
| TEHA | 40.1 ± 50.6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1.45 ± 0.06 |
Tabela 3. Aktywność immobilizowanej glukozodehydrogenazy zależnej od PQQ w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność immobilizowana jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
| Typ Nafionu | Aktywność enzymatyczna (U/g) |
| Bufor (bez polimeru) | 103.61 ± 3.15 |
| Nafion (niemodyfikowany) | 19.93 ± 10.10 |
| TMTDA | 247.25 ± 12.49 |
| TBAB | 152.27 ± 5.29 |
| TMDDA | 262.05 ± 6.26 |
| TMOA | 129.18 ± 2.31 |
| TMDA | 141.23 ± 1.97 |
| TMHA | 131.75 ± 2.89 |
| TMHDA | 132.50 ± 1.18 |
| TMODA | 136.50 ± 0.96 |
Tabela 4. Reprezentatywna aktywność specyficzna oksydazy glukozowej unieruchomionej w wybranych modyfikowanych polimerach Nafion (uwaga: aktywność unieruchomiona jest funkcją początkowej aktywności specyficznej enzymu).
Rycina 1. Schemat wbudowania TBAB w polimer Nafion i jego późniejszego zastosowania w unieruchamianiu enzymów.
Rysunek 2. Fotografia optyczna początkowych filmów współodlewanych z Nafion i TBAB. Powolne suszenie pozwala na uzyskanie przezroczystej, jasnobrązowej błony pokrywającej dno naczynia wagowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W opisanym procesie sole tetra-alkiloamoniowe są wykorzystywane do modyfikacji handlowego Nafionu w celu stworzenia polimerów micelarnych, które mogą służyć do unieruchamiania i stabilizacji enzymów. Analizy opisane w procedurze wykazują, że polimer ten może być stosowany do unieruchamiania szerokiej gamy enzymów przy zachowaniu wysokiej aktywności. Jeśli badany enzym wykazuje bardzo niską aktywność lub jest nieczysty, może być wymagane zastosowanie wyższego stężenia, co nie powinno wpływać na proces unieruchamiania, chy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Office of Naval Research, United Soybean Board oraz National Science Foundation za dofinansowanie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Sole bromki tetraalkiloamoniowe | Sigma-Aldrich | n/a | |
| Dehydrogenaza alkoholowa | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nikotynamidoadenindynukleotyd (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Pirofosforan sodu | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Metosiarzan fenazyny (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-Dichlorindofenol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| Oksydaza glukozowa | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| Kwas 4-hydroksybenzoesowy | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| Azotek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroksydaza | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipiryna | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| Spektrofotometr UV/Vis | Thermo | Evolution 260 Bio lub Spectronic Genesys 20 | |
| Mieszadło Vortex Genie | |||
| Waga analityczna |
Bibliografia
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis. Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).
- Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. Enzyme-Based Biofuel Cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).
- Callahan, J. W., Kosicki, G. W. The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase. Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).
- Martinek, K. Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents. Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).
- Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).
- Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes. J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).
- Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes. Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).
- Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode. Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).
- Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell. Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).
- Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors. J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).
- Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes. Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie