Method Article

Mikrofluidyka śródbłonkowa do badania interakcji mikronaczyniowych w chorobach hematologicznych

DOI:

10.3791/3958

⸱

June 22nd, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 3Aflac Cancer Center and Blood Disorders Service of Children's Healthcare of Atlanta , 4Winship Cancer Institute of Emory University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikroprzepływowego z kanałami o rozmiarach mikrokrążeniowych (<30 μm). Ten model mikrokrążenia in vitro umożliwia badanie biofizycznych interakcji między komórkami krwi, komórkami śródbłonka i czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w technikach mikroprodukcji umożliwiły produkcję tanich i powtarzalnych systemów mikroprzepływowych do przeprowadzania eksperymentów biologicznych i biochemicznych w mikro- i nanoskali 1,2. Ponadto mikrofluidyka została również specjalnie wykorzystana do ilościowej analizy procesów hematologicznych i mikronaczyniowych, ze względu na ich zdolność do łatwego kontrolowania dynamicznego środowiska płynowego i warunków biologicznych3-6. W związku z tym naukowcy wykorzystali ostatnio systemy mikroprzepływowe do badania odkształcalności komórek krwi, agregacji komórek krwi, przepływu krwi w mikronaczyniach krwionośnych i interakcji komórek krwi-śródbłonka6-13. Jednak te systemy mikroprzepływowe albo nie zawierały hodowanych komórek śródbłonka, albo były większe niż skala rozmiarów istotna dla mikronaczyniowych procesów patologicznych. Platforma mikroprzepływowa z hodowanymi komórkami śródbłonka, która dokładnie rekapituluje komórkowe, fizyczne i hemodynamiczne środowisko mikrokrążenia, jest potrzebna do lepszego zrozumienia patofizjologii biofizycznej leżącej u podstaw chorób hematologicznych, które obejmują mikrokrążenie.

Tutaj przedstawiamy metodę tworzenia "endotelializowanego" modelu mikrokrążenia in vitro, przy użyciu prostego, pojedynczego procesu mikrofabrykacji maski w połączeniu ze standardowymi technikami hodowli komórek śródbłonka, do badania patologicznych biofizycznych interakcji mikronaczyniowych, które występują w chorobie hematologicznej. Ta "mikrokrążność na chipie" zapewnia badaczowi solidny test, który ściśle kontroluje warunki biologiczne i biofizyczne i jest obsługiwany przy użyciu standardowej pompy strzykawkowej i mikroskopii jasnopolowej/fluorescencyjnej. Parametry takie jak mikrokrążące warunki hemodynamiczne, typ komórek śródbłonka, grupa i stężenie komórek krwi, stężenie leku/hamowania itp., można łatwo kontrolować. W związku z tym nasz mikrosystem zapewnia metodę ilościowego badania procesów chorobowych, w których przepływ mikronaczyniowy jest upośledzony z powodu zmian w adhezji komórek, agregacji i odkształcalności, co jest niedostępne w istniejących testach.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykonanie mikrourządzenia śródbłonka

  1. Utwórz fotomaskę, przesyłając rysunek projektu wspomaganego komputerowo (CAD) urządzenia mikroprzepływowego do zewnętrznego dostawcy maski. Zastosowana maska składała się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapniowym. W tym przypadku szerokość kanału mikroprzepływowego wynosiła 30 μm.
  2. Oczyść gołą płytkę silikonową piranią (stosunek 10:1 kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru) przez 15 minut i zanurz w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund. Płukać wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.
  3. Za pomocą powlekarki wirowej odwirować fotorezystor Microchem SU-8 2025 na płytce do wysokości 30 μm. W przypadku SU-8 2025 zalecana jest prędkość wirowania 3000 obr./min. Dostępne są inne lepkości SU-8, które pozwolą osiągnąć tę wysokość. Pełna instrukcja użycia SU-8 jest dostępna pod adresem www.microchem.com
  4. Umieść wafel z SU-8 na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 5 minut, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika.
    Uwaga: Piekarnik wysuszy wafel inaczej niż płyta grzejna i nie jest zalecany.
  5. Umieść maskę o pożądanym kształcie cechy na płytce i wystaw na działanie światła UV (160 mJ/cm2 mierzone przy 365 nm) w nakładce do maski (Karl Suss, MA-6). Ten krzyż łączy fotorezyst.
  6. Umieść wafel z powrotem na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na dodatkowe 5 minut, aby jeszcze bardziej przyspieszyć polimeryzację SU-8.
  7. Zanurz wafel w SU-8 Developer, składającym się głównie z PGMEA (octan eteru metylowego glikolu propylenowego) na 4 minuty, aby usunąć nieusieciowany SU-8.
  8. Nowo opracowany wafel płucz 100% alkoholem izopropylowym (IPA) przez 10 sekund. Wafel może być następnie suszony przy użyciu azotu pod ciśnieniem lub pozwalając rozpuszczalnikowi odparować z płytki w czystym dygestoriach przez kilka minut.
  9. Przyklej krawędzie suchego wafla wzorzystym SU-8 do szalki Petriego, aby zapobiec ruchomości.
  10. Nałóż 1 ml Sigmacote na wafel za pomocą pipety, przykryj górną częścią szalki Petriego i zakręć waflem, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki, zdejmij pokrywę i pozostaw wafel do wyschnięcia na kilka minut, aż cały rozpuszczalnik wyparuje.

2. Przygotowanie PDMS (Polidimetylosiloksan)

  1. Wymieszać polimer PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 (w/w) i usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą eksykatora próżniowego. Czas potrzebny do odgazowania PDMS różni się w zależności od siły dostępnego systemu próżniowego, ale zwykle waha się od kilku minut do jednej godziny. W przypadku sześciocalowej szalki Petriego bez wcześniej nalanego PDMS zalecana jest całkowita objętość 60 ml polimeru.
  2. Wylej mieszaninę na wafel o grubości około 5 mm. Wlej również na naczynie z płaskim dnem, aby utworzyć cienki arkusz PDMS o grubości około 1 mm. Utwardzać w temperaturze 60 °C w piekarniku przez noc.
  3. Za pomocą noża lub skalpela wytnij okolice utwardzonego urządzenia PDMS i usuń je z wafla. Dodatkowo wytnij cienki arkusz PDMS nieco większy niż urządzenie.
  4. Utwórz otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu PDMS za pomocą dziurkacza 1,0 mm. Można to osiągnąć za pomocą imadła pinowego, Harris Uni-Core lub podobnego urządzenia.
  5. Oczyść powierzchnie urządzenia i arkusza za pomocą taśmy klejącej.
  6. Za pomocą myjki plazmowej wystawiaj powierzchnie urządzenia PDMS i arkusza PDMS na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund. Plazma tlenowa tworzy reaktywne formy na odsłoniętej powierzchni PDMS, które łączą się w kontakcie fizycznym.
  7. Podłącz mniejszą rurkę do małej długości (kilka centymetrów) dużej rurki, która z kolei jest podłączona do strzykawki z igłą, wypełnioną 50 μg/ml fibronektyny z ludzkiego osocza w PBS. Rurka i igła są zwymiarowane w taki sposób, aby między rurkami powstało pasowanie cierne. Włóż mniejszą rurkę do wlotu mikrourządzenia PDMS i dociśnij strzykawkę, aby całkowicie napełnić kanały roztworem fibronektyny i wytworzyć małą kroplę 100 μl w porcie wylotowym, aby zapewnić, że kanały pozostaną mokre. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C przez 40-60 minut.
  8. Podłączyć świeżą strzykawkę wypełnioną PBS do igły z końcem. Uciskać strzykawkę, aby przepłukać urządzenie PBS.

3. Wyposażenie urządzenia mikroprzepływowego w komórki śródbłonka

  1. Przygotuj 1 000 000 komórek/ml ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w pożywce wzrostowej śródbłonka z 8% dekstranem. Z powodzeniem zastosowano zakres od 500 000 do 2 000 000 komórek/ml. Dodanie dekstranu do pożywki ładującej komórkę zwiększa lepkość płynu, co zmniejsza prędkość komórek śródbłonka, gdy wchodzą one do układu mikroprzepływowego pokrytego fibronektyną. To z kolei zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki będą z powodzeniem przylegać i hodować w mikrourządzeniu.
  2. Podłączyć nową strzykawkę i rurkę jak w kroku 2.7, ale z dłuższym przewodem (o długości około 1 metra).
  3. Aby zoptymalizować wydajność tego systemu, w tym momencie bardzo ważne jest, aby zapobiec wszelkim wyciekom lub pęcherzykom w całym systemie perfuzyjnym; każdy wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w pożywce zmieni przepływ i uniemożliwi pomyślne wysiew komórek śródbłonka. Dlatego szczelne dopasowanie rurki jest niezbędne, aby wyeliminować wycieki między dowolnymi połączeniami. Pęcherzyki w strzykawce i/lub rurki muszą zostać usunięte przed wprowadzeniem komórek do mikrourządzenia, a cały system perfuzyjny powinien zostać zalany roztworem komórkowym przed podłączeniem rurki do mikroprzepływu, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
  4. Za pomocą pompy strzykawkowej wlewać zawiesinę komórek do urządzenia PDMS przy objętościowym natężeniu przepływu 1,23 μl/min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Optymalne wyniki osiągnięto, gdy pompa strzykawkowa znajdowała się na tej samej wysokości co urządzenie PDMS. W przypadku wlotu, dłuższe rurki, które można zwinąć w inkubatorze, zapewniają odpowiednie ogrzanie komórek i mediów przed kontaktem z urządzeniem. W naszym systemie objętościowe natężenie przepływu wynoszące 1,23 μl/min jest zbliżone do prędkości środkowej strumienia ~1 mm/s w najmniejszych mikrokanałach, co odpowiada naprężeniu ścinającemu ścianki wynoszącemu ~1 dyn/cm2 w tych kanałach przy użyciu krwi pełnej.
  5. Używając tej samej pompy strzykawkowej i długich przewodów, perfunduj świeżą pożywkę wzrostową przez 2-8 dni w stosunku 1,23 μl/min. Udane urządzenie będzie miało monowarstwę komórek śródbłonka rosnących wewnątrz urządzenia w ciągu 24-48 godzin. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że zlewające się monowarstwy odpowiednio eksprymują kadherynę VE na połączeniach komórka-komórka w całym urządzeniu14.
  6. Wstrzyknąć krew lub zawiesinę komórkową do systemu w celu eksperymentowania.

4. Reprezentatywne wyniki

Korzystając z tego protokołu, standardowe techniki mikroprodukcji litograficznej są używane do stworzenia formy potrzebnej do wytworzenia kanałów mikroprzepływowych, które fizjologicznie naśladują skalę wielkości mikrokrążenia (Rysunek 1A). Wykorzystując zoptymalizowaną technikę perfuzji, komórki śródbłonka następnie zasiewają i zlewają się z całą wewnętrzną powierzchnią układu mikroprzepływowego w ciągu 24-48 godzin od wysiewu komórek (ryc. 1B). Ponieważ system mikroprzepływowy jest przezroczysty, całe mikrourządzenie można umieścić na stoliku mikroskopu jasnego pola/fluorescencji w celu obrazowania i zbierania danych.

Nasz system może być następnie zastosowany do badania chorób hematologicznych, które mają zmienione właściwości biofizyczne, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, w której zwiększona sztywność sierpowatych krwinek czerwonych oraz nieprawidłowa leukocyty i adhezja śródbłonka przyczyniają się do niedrożności mikronaczyniowej. Klinicznie zatwierdzony lek, hydroksymocznik, łagodzi objawy, ale jego bezpośredni wpływ na przepływ mikronaczyniowy jest nieznany. Nasz test uwzględnia zarówno sztywność komórek, jak i adhezję i pokazuje, że hydroksymocznik znacznie poprawia przepływ w niedokrwistości sierpowatokrwinkowej (ryc. 2).

Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa to tylko jeden z przykładów zastosowania mikrokrążenia na chipie, ponieważ ten system idealnie nadaje się do badania dowolnego procesu hematologicznego, w którym komórki krwi oddziałują ze sobą i komórki śródbłonka w mikrokrążeniu. Inne klinicznie istotne zastosowania obejmują zaburzenia zapalne, sepsę/uszkodzenie płuc, mikroangiopatie zakrzepowe, malarię i przerzuty raka, podczas gdy bardziej podstawowe zastosowania obejmują między innymi biologię leukocytów i biologię hematopoetycznych komórek macierzystych.

figure-protocol-1
Rysunek 1. A) początkowe urządzenie mikroprzepływowe PDMS przed śródbłonkiem. W tym przypadku mikrourządzenie jest wstrzykiwane z barwnikiem spożywczym, aby zilustrować skalę rozmiaru i ogólny projekt systemu. B) Mikroskopia Brightfield pokazuje, że układ mikroprzepływowy jest całkowicie śródbłonkowy w ciągu 48 godzin od wysiewu komórek przy użyciu opisanego tutaj protokołu.

figure-protocol-2
Rysunek 2. A) Mikrokrążenie na chipie z mikrokanalikami jest zbliżone wielkością do żyłek zawłosionych (30 μm), miejsca większości zdarzeń niedrożności mikrokrążenia sierpowatokrwinkowego. Krew pełna od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową otrzymujących hydroksymocznik i od pacjentów nieotrzymujących hydroksymocznika jest przepływana przez dwa różne urządzenia do mikrokrążenia na chipie. B) Krew pełna od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową otrzymujących hydroksymocznik przepływa ze względną łatwością w mikrokanalikach śródbłonka. C) W tych samych warunkach hemodynamicznych krew pełna od pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową, którzy nie otrzymują hydroksymocznika, wykazuje jednak znacznie wolniejszy przepływ z niedrożnością mikrokanałów. Dolny kanał jest całkowicie zatkany bez przepływu, a prędkości przepływu w innych śródbłonkowych mikrokanałach są znacznie niższe niż w stanie hydroksymocznika. Podziałka skali na wszystkich trzech obrazach wynosi 30 μm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz system mikrourządzeń śródbłonkowych najlepiej sprawdza się w połączeniu z eksperymentami in vivo , a jego redukcjonistyczne podejście może pomóc w wyjaśnieniu biofizycznych mechanizmów procesów hematologicznych obserwowanych u ludzi i modeli zwierzęcych. Co więcej, nasz system nie jest pozbawiony ograniczeń. Na przykład nasze kanały mikroprzepływowe mają kwadratowy przekrój. Chociaż technicznie można wytworzyć mikrokanałykołowe 10,11, zdecydowaliśmy się na użycie bardziej uproszczonej i standardo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy T. Huntowi, M. Rosenbluthowi i Lam Lab za ich rady i użyteczne dyskusje. Dziękujemy za wsparcie ze strony firmy G. Spinner oraz Instytutu Elektroniki i Nanotechnologii w Georgia Institute of Technology. Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione przez grant NIH K08-HL093360, nagrodę UCSF REAC, nagrodę NIH Nanomedicine Development Center Award PN2EY018244 oraz finansowanie z Center for Endothelial Cell Biology of Children's Healthcare w Atlancie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
igłaOK International920050-TEPrecyzyjna igła TE 20 Gauge x 1/2", różowy
dekstranSigma-Aldrich31392
FibronectinSigma-AldrichF0895
Dziurkacz (imadło do szpilek)Innowacje
Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVEC)LonzaCC-2519
Środek do czyszczenia plazmyPlazma PDC-326
Polidimetylosiloksan (PDMS)Fisher ScientificNC9285739Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych
SigmacoteSigma-AldrichSL2
SU-8 2025MicrochemY111069
SU-8 DeveloperMicrochemY020100
Pompa strzykawkowaRurki Harvard Apparatus70-3008PHD-ULTRA
(większe)Cole-Parmer Instrument Company06418-02Rurki z mikrootworem Tygonreg, rurki o średnicy zewnętrznej 0,020 "ID x 0,060" (
mniejsze)Cole-Parmer Instrument Company06417-11Rurka z mikrootworem PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD
techniczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
  2. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  3. Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
  4. Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
  5. Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  6. Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
  7. Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
  8. Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
  9. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
  10. Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
  11. Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
  12. Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
  13. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  14. Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
  15. Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelialized MicrofluidicsMicrovascular InteractionsHematologic DiseasesPDMS Channel FabricationEndothelial Cell SeedingSyringe Pump PerfusionBrightfield MicroscopyConfocal MicroscopyBlood Cell DeformabilityLeukocyte Biology

Related Articles