Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (<30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Postępy w technikach mikrowytwarzania umożliwiły produkcję tanich i powtarzalnych systemów mikrofluidycznych do przeprowadzania eksperymentów biologicznych i biochemicznych w skalach mikro- i nanometrycznych 1,2. Ponadto mikrofluidyka była specjalnie wykorzystywana do ilościowej analizy procesów hematologicznych i mikronaczyniowych ze względu na możliwość łatwego kontrolowania dynamicznego środowiska płynowego i warunków biologicznych3-6. W związku z tym badacze w ostatnim czasie wykorzystywali systemy mikrofluidyczne do badania deformowalności komórek krwi, agregacji komórek krwi, przepływu krwi w mikronaczyniach oraz oddziaływań między komórkami krwi a komórkami śródbłonka6-13. Jednakże systemy mikrofluidyczne te albo nie zawierały hodowanych komórek śródbłonka, albo były większe niż skala rozmiarów istotna dla patologicznych procesów mikronaczyniowych. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat podstaw biofizycznej patofizjologii chorób hematologicznych obejmujących mikronaczynia, niezbędna jest platforma mikrofluidyczna z hodowanymi komórkami śródbłonka, która dokładnie odwzorowuje środowisko komórkowe, fizyczne i hemodynamiczne mikrokrążenia.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę tworzenia „uendotelyzowanego” modelu mikrokrążenia in vitro, z wykorzystaniem prostego procesu mikrowytwarzania z jedną maską w połączeniu ze standardowymi technikami hodowli komórek śródbłonka, w celu badania patologicznych biofizycznych oddziaływań mikro naczyniowych występujących w chorobach hematologicznych. Ten „układ mikrokrążenia na chipie” dostarcza badaczowi niezawodnego testu, który ściśle kontroluje warunki biologiczne i biofizyczne, a jego obsługa odbywa się przy użyciu standardowej pompy strzykawkowej oraz mikroskopii w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej. Parametry takie jak hemodynamiczne warunki mikrokrążenia, typ komórek śródbłonka, typ(y) i stężenie(ia) komórek krwi, stężenie leku/inhibitora itp., mogą być łatwo kontrolowane. W ten sposób nasz mikrosystem zapewnia metodę ilościowego badania procesów chorobowych, w których przepływ mikro naczyniowy jest upośledzony z powodu zmian w adhezji, agregacji i odkształcalności komórek, co stanowi funkcjonalność niedostępną w istniejących testach.
Protokół
1. Wykonanie mikro urządzenia śródbłonkowego
- Przygotuj fotomaskę, przesyłając rysunek urządzenia mikrofluidycznego wykonany w programie do wspomaganego projektowania komputerowego (CAD) do zewnętrznego dostawcy masek. Wykorzystana maska składała się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapniowym. W tym przypadku szerokość kanału mikrofluidycznego wynosiła 30 μm.
- Wyczyść niepowlekany wafelek krzemowy roztworem piranha (stosunek kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru 10:1) przez 15 minut, a następnie zanurz w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund. Płucz wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.
- Za pomocą powlekarki rotacyjnej nanieś fotorezyst Microchem SU-8 2025 na wafelek, aby uzyskać wysokość 30 μm. Dla SU-8 2025 zalecana prędkość obrotowa wynosi 3000 rpm. Dostępne są inne lepkości SU-8, które pozwolą osiągnąć tę wysokość. Pełne instrukcje dotyczące stosowania SU-8 są dostępne na stronie www.microchem.com
- Umieść wafelek z SU-8 na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika.
Uwaga: Suszenie wafelka w piekarniku przebiega inaczej niż na płycie grzewczej i nie jest zalecane. - Umieść maskę z pożądanym kształtem elementów nad wafelkiem i naświetl światłem UV (160 mJ/cm2 mierzone przy 365 nm) w naświetlarce z wyrównywaczem masek (Karl Suss, MA-6). Powoduje to sieciowanie fotorezystu.
- Umieść wafelek ponownie na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dodatkowe 5 minut, aby dalej przyspieszyć polimeryzację SU-8.
- Zanurz wafelek w wywoływaczu SU-8 Developer, składającym się głównie z PGMEA (octanu metylowego eteru glikolu propylenowego), na 4 minuty w celu usunięcia niesieciowanego SU-8.
- Płucz nowo wywołany wafelek 100% alkoholem izopropylowym (IPA) przez 10 s. Następnie wafelek można wysuszyć za pomocą sprężonego azotu lub pozwalając rozpuszczalnikowi odparować z wafelka w czystej dygestorium przez kilka minut.
- Przyklej krawędzie wysuszonego wafelka z naniesionym wzorem SU-8 do szalki Petriego, aby zapobiec jego przesuwaniu się.
- Nanieś 1 mL Sigmacote na wafelek za pomocą pipety, przykryj pokrywką szalki Petriego i obracaj wafelkiem, aby zapewnić jego całkowite pokrycie, następnie zdejmij pokrywkę i pozostaw wafelek do wyschnięcia na kilka minut, aż cały rozpuszczalnik odparuje.
2. Przygotowanie PDMS (polidimetylosiloksanu)
- Wymieszać polimer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (w/w) i usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą desykatora próżniowego. Czas potrzebny na odgazowanie PDMS zależy od mocy dostępnego systemu próżniowego, ale zazwyczaj wynosi od kilku minut do jednej godziny. Dla sześciocalowej szalki Petriego, w której wcześniej nie wlewano PDMS, zaleca się całkowitą objętość 60 mL polimeru.
- Wlać mieszaninę na podłoże krzemowe, tworząc warstwę o grubości około 5 mm. Wlać również do naczynia z płaskim dnem, aby stworzyć cienką arkusz PDMS o grubości około 1 mm. Utwardzać w piecu w temperaturze 60 °C przez noc.
- Za pomocą noża lub skalpela wyciąć obszar wokół utwardzonego urządzenia z PDMS i zdjąć je z podłoża krzemowego. Dodatkowo wyciąć cienki arkusz PDMS nieco większy niż urządzenie.
- Wyciąć otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu z PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 1,0 mm. Można to zrobić przy użyciu uchwytu precyzyjnego, Harris Uni-Core lub podobnego narzędzia.
- Oczyścić powierzchnie urządzenia i arkusza za pomocą taśmy klejącej.
- Za pomocą oczyszczacza plazmowego poddać powierzchnie urządzenia z PDMS i arkusza PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 s. Plazma tlenowa tworzy reaktywne grupy na odsłoniętej powierzchni PDMS, które wiążą się po zetknięciu fizycznym.
- Połączyć cieńszą rurkę z krótkim odcinkiem (kilka centymetrów) grubszej rurki, która z kolei jest połączona ze strzykawką z tępyj igłą, wypełnioną roztworem 50 μg/ml fibronektyny z ludzkiej plazmy w PBS. Rurki i igła są tak dobrane, aby zapewnić ciasne dopasowanie między rurkami. Włożyć cieńszą rurkę do wlotu mikrourządzenia z PDMS i wywrzeć nacisk na strzykawkę, aby całkowicie wypełnić kanały roztworem fibronektyny i stworzyć małą kroplę o objętości 100 μL w porcie wylotowym, aby zapewnić zwilżenie kanałów. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C przez 40-60 min.
- Podłączyć nową strzykawkę wypełnioną PBS do tępej igły. Wywrzeć nacisk na strzykawkę, aby przepłukać urządzenie roztworem PBS.
3. Zasiewanie komórek śródbłonka w urządzeniu mikrofluidycznym
- Przygotować zawiesinę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) o stężeniu 1 000 000 cells/mL w pożywce wzrostowej dla komórek śródbłonka z dodatkiem 8% dekstranu. Pomyślnie stosowano zakres od 500 000 do 2 000 000 cells/mL. Dodanie dekstranu do medium do ładowania komórek zwiększa lepkość cieczy, co zmniejsza prędkość komórek śródbłonka podczas wprowadzania ich do systemu mikroprzepływowego powleczonego fibronektyną. Zwiększa to z kolei prawdopodobieństwo, że komórki przylgną i będą pomyślnie hodowane wewnątrz mikrourządzenia.
- Podłączyć nową strzykawkę i rurkę zgodnie z krokiem 2.7, ale z użyciem dłuższej rurki (o długości około 1 metra).
- W celu optymalizacji pracy systemu krytyczne jest na tym etapie zapobieganie wszelkim wyciekom lub powstawaniu pęcherzyków powietrza w całym systemie perfuzji; jakikolwiek wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w medium zmieni przepływ i uniemożliwi pomyślne zasiewanie komórek śródbłonka. Dlatego niezbędne jest szczelne dopasowanie rurek, aby wyeliminować nieszczelności na wszystkich połączeniach. Pęcherzyki w strzykawce i/lub rurkach muszą zostać usunięte przed wprowadzeniem komórek do mikrourządzenia, a cały system perfuzji należy przepłukać roztworem komórek przed podłączeniem rurki do układu mikroprzepływowego, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
- Używając pompy strzykawkowej, wprowadzić zawiesinę komórkową do urządzenia PDMS z natężeniem przepływu objętościowego 1,23 μl/min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Optymalne wyniki uzyskano, gdy pompa strzykawkowa znajdowała się na tej samej wysokości co urządzenie PDMS. W przypadku wlotu dłuższa rurka, którą można zwinić wewnątrz inkubatora, zapewnia odpowiednie ogrzanie komórek i medium przed kontaktem z urządzeniem. W naszym systemie natężenie przepływu objętościowego 1,23 μl/min odpowiada prędkości w głównym nurcie wynoszącej ~1 mm/s w najmniejszych mikrokanałach, co przy zastosowaniu pełnej krwi odpowiada naprężeniu ścinającemu na ściankach o wartości ~1 dyne/cm2 w tych kanałach.
- Używając tej samej pompy strzykawkowej i długiej rurki, perfundować świeżą pożywkę wzrostową przez 2-8 dni z natężeniem 1,23 μl/min. W sprawnie działającym urządzeniu warstwa pojedyncza komórek śródbłonka powinna wyrosnąć na wewnętrznej powierzchni urządzenia w ciągu 24-48 godzin. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że konfluentne warstwy pojedyncze odpowiednio eksponują VE-cadherin w złączach międzykomórkowych w całym urządzeniu14.
- Wstrzyknąć krew lub zawiesinę komórkową do systemu w celu przeprowadzenia eksperymentów.
4. Reprezentatywne wyniki
Zgodnie z tym protokołem, standardowe techniki litograficznego mikrowytwarzania są wykorzystywane do stworzenia formy niezbędnej do produkcji kanałów mikroprzepływowych, które fizjologicznie naśladują skalę rozmiarów mikrokrążenia (Ryc. 1A). Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanej techniki perfuzji, komórki śródbłonka zasiedlają i tworzą konfluentną kulturę na całej wewnętrznej powierzchni systemu mikroprzepływowego w ciągu 24-48 godzin od wysiania komórek (Ryc. 1B). Ponieważ system mikroprzepływowy jest przezroczysty, całe mikrourządzenie można umieścić na stole mikroskopu w świetle przechodzącym/fluorescencyjnym w celu obrazowania i gromadzenia danych.
Nasz system można następnie zastosować do badania chorób hematologicznych związanych ze zmienionymi właściwościami biofizycznymi, takich jak anemia sierpowata, w której zwiększona sztywność sierpowatych erytrocytów oraz zaburzona adhezja leukocytów i komórek śródbłonka przyczyniają się do niedrożności mikronaczyniowej. Hydroksymocznik, lek zatwierdzony klinicznie, łagodzi objawy, jednak jego bezpośredni wpływ na przepływ mikronaczyniowy pozostaje nieznany. Nasz test uwzględnia zarówno sztywność komórek, jak i adhezję, wykazując, że hydroksymocznik znacząco poprawia przepływ w anemii sierpowatej (Rysunek 2).
Anemia sierpowata jest tylko jednym z przykładów zastosowania układu mikrokrążenia na chipie (microvasculature-on-a-chip), ponieważ system ten jest idealnie dostosowany do badania wszelkich procesów hematologicznych, w których komórki krwi oddziałują ze sobą oraz z komórkami śródbłonka w mikrokrążeniu. Inne istotne klinicznie zastosowania obejmują schorzenia zapalne, sepsę/uszkodzenie płuc, mikroangiopatie zakrzepowe, malarię oraz przerzuty nowotworowe, natomiast zastosowania bardziej podstawowe obejmują m.in. biologię leukocytów i biologię hematopoetycznych komórek macierzystych.
Rycina 1. A) początkowe urządzenie mikrofluidyczne z PDMS przed endotelializacją. W tym przypadku do mikrourządzenia wstrzyknięto barwnik spożywczy, aby zilustrować skalę rozmiarów i ogólną konstrukcję systemu. B) Mikroskopia w polu jasnym pokazuje, że system mikrofluidyczny został całkowicie endotelializowany w ciągu 48 godzin od wysiania komórek zgodnie z opisanym tutaj protokołem.
Rycina 2. A) Urządzenie mikroprzepływowe do modelowania mikrokrążenia (microvasculature-on-a-chip) z mikrokanałami o rozmiarach zbliżonych do żylek poprzystaczkowych (30 μm), które są miejscem większości incydentów zatorowości mikro naczyniowej w anemii sierpowatej. Krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą przyjmujących hydroksymocznik oraz od pacjentów nieprzyjmujących hydroksymoczniku jest przepuszczana przez dwa różne urządzenia typu microvasculature-on-a-chip. B) Krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą przyjmujących hydroksymoczniki przepływa z relatywną łatwością w obrębie endotelializowanych mikrokanałów. C) W tych samych warunkach hemodynamicznych krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą nieprzyjmujących hydroksymoczniku wykazuje znacznie wolniejszy przepływ z obturacją mikrokanałów. Dolny kanał jest całkowicie zablokowany, bez przepływu, a prędkości przepływu w pozostałych endotelializowanych mikrokanałach są znacznie niższe niż w przypadku stosowania hydroksymoczniku. Pasek skali na wszystkich trzech obrazach wynosi 30 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz system mikro urządzeń z endotelizacją najlepiej sprawdza się w połączeniu z eksperymentami in vivo, a jego redukcjonistyczne podejście może pomóc w wyjaśnieniu biofizycznych mechanizmów procesów hematologicznych obserwowanych u ludzi i w modelach zwierzęcych. Co więcej, nasz system nie jest pozbawiony ograniczeń. Na przykład nasze kanały mikrofluidyczne mają kwadratowy przekrój poprzeczny. Choć technicznie możliwe jest wytworzenie okrągłych mikrokanałów10,11, zdecydowaliśmy się na zastosowanie pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy T. Huntowi, M. Rosenbluthowi oraz zespołowi Lam Lab za rady i pomocne dyskusje. Wyrażamy wdzięczność G. Spinnerowi oraz Instytutowi Elektroniki i Nanotechnologii w Georgia Institute of Technology za udzielone wsparcie. Finansowanie niniejszej pracy zapewniły grant NIH K08-HL093360, nagroda UCSF REAC, grant NIH Nanomedicine Development Center PN2EY018244 oraz fundusze z Center for Endothelial Cell Biology w Children's Healthcare of Atlanta.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| igła tępokrawędziowa | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", różowa |
| dekstran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronektyna | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Dziurkacz (uchwyt precyzyjny) | Technical Innovations | ||
| Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Oczyszczacz plazmowy | Plasma | PDC-326 | |
| Polidimetylosiloksan (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| Developer SU-8 | Microchem | Y020100 | |
| Pompa strzykawkowa | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| przewód (większy) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Przewód mikrobore Tygonreg, 0,020" ID x 0,060" OD |
| przewód (mniejszy) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | Przewód mikrobore PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD |
Bibliografia
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
