Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Podsumowanie

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Streszczenie

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) bierze udział w wielu stanach patologicznych, takich jak udar mózgu, zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie jelit, a także występuje po przeszczepach i operacjach naczyniowo-sercowych.¹ Reperfuzja uprzednio niedokrwionej tkanki, choć jest niezbędna do zapobiegania nieodwracalnym uszkodzeniom tkanek, wywołuje nadmierny stan zapalny w dotkniętym obszarze. Obok produkcji reaktywnych form tlenu, aktywacji układu dopełniacza i zwiększonej przepuszczalności mikro naczyniowej, aktywacja leukocytów jest jednym z głównych czynników w patologicznej kaskadzie zapalnego uszkodzenia tkanek podczas reperfuzji.^{2, 3} Aktywacja leukocytów jest procesem wieloetapowym, składającym się z toczenia, trwałej adhezji oraz transmigracji, a jest ona mediowana przez złożoną interakcję cząsteczek adhezyjnych w odpowiedzi na chemoatraktanty, takie jak czynniki dopełniacza, chemokiny lub czynnik aktywujący płytki krwi.⁴

Podczas gdy toczenie się leukocytów w żylkach pocapilarnych jest głównie zapośredniczone przez oddziaływanie selektyn⁵ z ich przeciwligandami, trwała adhezja leukocytów do śródbłonka jest kontrolowana przez selektyny poprzez wiązanie z cząsteczkami adhezyjnymi międzykomórkowymi (ICAM) oraz cząsteczkami adhezyjnymi komórek naczyniowych (VCAM).^{6, 7}

Złotym standardem w obserwacji in vivo oddziaływań leukocytów z endotelium jest technika mikroskopii witalnej, opisana po raz pierwszy w 1968 roku.⁸

Choć opisano różne modele IRI (uszkodzenia niedokrwienno-reperfozyjnego) dla wielu organów, ^9-12 tylko kilka z nich nadaje się do bezpośredniej wizualizacji rekrutacji leukocytów w łożysku mikronaczyniowym przy wysokiej jakości obrazowania.⁸

W niniejszej pracy promujemy cyfrową intravitalną mikroskopię epifluorescencyjną żyłcek pomostkowych w mikrokrążeniu mięśnia kremaster szczura ¹³ jako wygodną metodę jakościowej i ilościowej analizy rekrutacji leukocytów w badaniach nad niedokrwienno-reperfuzją (IRI) w tkance mięśni poprzecznie prążkowanej, a także przedstawiamy szczegółowy instruktaż wykonania tej techniki. Ponadto ilustrujemy częste błędy i podajemy przydatne wskazówki, które pozwolą czytelnikowi w pełni zrozumieć i bezpiecznie przeprowadzić tę metodę.

W protokole krok po kroku przedstawiamy sposób rozpoczęcia znieczulenia kontrolowanego przez oddychanie przy zastosowaniu odpowiedniego monitorowania, aby utrzymać zwierzę w stanie głębokiej anestezji przez dłuższy czas. Następnie opisujemy przygotowanie mięśnia żylnego (cremasteric preparation) w formie cienkiego, płaskiego arkusza dla uzyskania doskonałej rozdzielczości optycznej oraz przedstawiamy ugruntowany w naszych laboratoriach protokół obrazowania leukocytów w procesie IRI.

Protokół

1. Znieczulenie i monitorowanie

1. Przed przeprowadzeniem eksperymentów na zwierzętach należy uzyskać odpowiednie zgody krajowe i instytucjonalne z zakresu etyki. Po uzyskaniu zatwierdzenia przez komisję etyczną znieczulone należy być samce szczurów Sprague Dawley o masie ciała od 120 - 180 g. Do skrzynki z pleksiglasu za pomocą waporyzatora podaje się 2 - 3 vol% izofluranu, a następnie umieszcza w niej szczura.
2. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak reakcji na ściśnięcie palca u nogi lub ogona) szczura ważymy i golimy w przedniej części szyi.
3. Szczura umieszcza się w pozycji grzbietnej na podgrzewaczu w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C i podaje się 2 vol% izofluranu za pomocą silikonowej maski.

Następujące etapy przygotowania najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu chirurgicznego.

4. W celu przygotowania tchawicy, tętnicy szyjnej wspólnej i żyły szyjnej, wykonaj 2 cm poziome nacięcie skóry w okolicy wcięcia nadmostkowego i odsuń gruczoły ślinowe bocznie.
5. Obecnie widoczne są brzuszne mięśnie szyi. Należy je ostrożnie rozdzielić w linii środkowej i odsłonić tchawicę. Wyeksponuj 1 - 2 cm tchawicy i umieść pod nią mikropincetę, aby ją unieść.
6. Następnie wykonaj nacięcie przez około połowę brzusznej ściany tchawicy. Należy uważać, aby nie przeciąć jej całkowicie; w przeciwnym razie odcięty koniec tchawicy może cofnąć się do klatki piersiowej, co znacznie utrudni dalszą pracę.
7. Wprowadź kaniulę Abbocath (14G) pełniącą rolę rurki intubacyjnej do dolnej części tchawicy, która została wcześniej podłączona do respiratora dla zwierząt. Wskazówka: Stabilna fiksacja na zaciskach magnetycznych oraz przeszycie tchawicy wokół rurki są niezbędne do utrzymania rurki w miejscu. Zazwyczaj stosujemy nici Terylene 5/0, jednak można użyć podobnego materiału szewnego.
8. Wentylację można następnie prowadzić w trybie kontroli objętości (częstość: 35 - 45 oddechów/minutę; objętość oddechowa: 4.5 - 5 ml; FiO₂: 0.35 - 0.50; izofluran: 1.5 - 2 vol%).¹⁴ Atelektazję można zapobiegać poprzez utrzymanie dodatniego ciśnienia końcowowydechowego (PEEP) na poziomie 5 do 10 mm H₂O.¹⁵
9. W celu kanulacji tętnicy szyjnej, prawy mięsień mostkowo-gnykowy jest rozdzielany poprzez rozczepianie tępe, aby zlokalizować tętnicę szyjną wspólną.
10. Ostrożnie oddziel nerw błędny od tętnicy szyjnej i uchwyć tętnicę kątową mikropincetą, aby zatrzymać przepływ krwi z serca.
11. Przełóż dwa kawałki nici o tej samej długości pod tętnicą szyjną. Biorąc pod uwagę położenie serca, nić bardziej dystalną zawiąż ciasno, aby zablokować przepływ krwi z obszaru głowy, natomiast nić proksymalną zawiąż luźno wokół tętnicy szyjnej.
12. Za pomocą mikronozycyc wykonaj niewielkie nacięcie w tętnicy szyjnej pomiędzy dwiema ligaturami.
13. Wprowadź cewnik polietylenowy (średnica wewnętrzna 0.28 mm) wypełniony roztworem soli fizjologicznej, podłączony do przetwornika ciśnienia.
14. Usuń mikropincetę i wprowadź cewnik głębiej do tętnicy. Następnie zaciśnij ligaturę proksymalną wokół tętnicy i cewnika. Wskazówka: Założenie drugiej szwy proksymalnej zapobiega krwawieniu po usunięciu mikropincety.
15. Zawiąż ligaturę dystalną wokół tętnicy i cewnika dla dodatkowej stabilizacji.
16. Stale monitoruj znieczulenie, kontrolując częstość akcji serca oraz ciśnienie tętnicze. Wykonuj okresowe analizy gazometryczne krwi tętniczej za pomocą analizatora gazometrii.¹⁶ Kryteriami wykluczenia są: częstość akcji serca poniżej 300 bpm lub powyżej 360 bpm, a także spadek średniego ciśnienia tętniczego poniżej 80 mmHg przez czas dłuższy niż 5 minut.^{17, 18} Utrzymuj pH krwi w granicach fizjologicznych (7.35 - 7.45). W przypadku konieczności przerwania eksperymentu z powodu nieprawidłowych parametrów monitorowania, uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie szyi lub upuszczenie krwi.

W przypadku dożylnego podania barwników fluorescencyjnych lub innych interesujących leków, należy wykonać następujące czynności:

17. Skupić obraz na obszarze lewej żyły szyjnej za pomocą mikroskopu chirurgicznego.
18. Używając pęset w obu dłoniach, rozdzielić cienką powięź, aby odsłonić żyłę szyjną. Unieść żyłę za pomocą kątowej mikropęsety. Spowoduje to zatrzymanie przepływu krwi.
19. Za pomocą pęsety wprowadzić dwa kawałki sznurka chirurgicznego o tej samej długości pod żyłę szyjną, analogicznie do kaniulacji tętnicy szyjnej. Związać mocno szew dystalny oraz luźno szew proksymalny wokół żyły szyjnej.
20. wykonać niewielkie nacięcie w żyle szyjnej i wprowadzić przepłukany solą fizjologiczną cewnik polietylenowy (średnica wewnętrzna 0,28 mm). Należy zaznaczyć, że nacięcie i kaniulacja ta mogą być bardziej wymagające i czasochłonne niż w przypadku tętnicy szyjnej.
21. Przesunąć cewnik w kierunku serca i zaciągnąć ligaturę znajdującą się najbliżej serca wokół żyły i cewnika.
22. Po potwierdzeniu drożności zawiązać ligaturę dystalną wokół cewnika. Wskazówka: Dodatkowe przymocowanie obu cewników taśmą może zapobiec ich wysunięciu.
23. Często przepłukiwać cewniki, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów w ich świetle.

2. Przygotowanie mięśnia opuszkowego

1. Do obrazowania mięśnia opuszkowego stosujemy aluminiowy podest o grubości 1,5 - 2 cm. Podest szybko przyjmuje pożądaną temperaturę podkładki grzewczej, co ułatwia kontrolę termiczną tkanki opuszkowej. Jest to kluczowe w badaniach nad stanem zapalnym. Alternatywnie można zastosować platformę z pleksiglasu, choć regulacja temperatury mięśnia opuszkowego jest wtedy trudniejsza. Umieść mosznę w centrum podestu.
2. Pierwsze nacięcie wykonuje się w skórze i zewnętrznej powięzi nasiennej powyżej moszny, na jej najbardziej dystalnym końcu, a następnie ostrożnie rozszerza się przestrzeń podskórną za pomocą cienkich nożyczek. Należy unikać dotykania instrumentami leżących poniżej tkanek.
3. Natychmiast po odsłonięciu tkanka jest nawilżana podgrzanym (37 °C) roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu. Roztwór należy regularnie nanosić na każdą odsłoniętą tkankę.
4. Tkankę łączną między zewnętrzną powięzią nasienną a mięśniem opuszkowym ostrożnie usuwa się, aby uwolnić mięsień opuszkowy z otaczających go tkanek.
5. Następnie z powierzchni zewnętrznej mięśnia opuszkowego ostrożnie usuwa się tkankę łączną. Ciągła superfuzja podczas preparowania nawilża tkankę łączną, co ułatwia jej widoczność i usunięcie.
6. Przyszyj dystalny koniec worka opuszkowego, aby go unieruchomić i lekko rozciągnąć końcówkę worka.
7. Nacinaj dystalny koniec worka od strony brzusznej i wydłuż nacięcie proksymalnie za pomocą mikronożyczek. Ostrożnie koaguluj krwawiące naczynia wzdłuż linii nacięcia, używając koagulatora termicznego. Unikaj niepotrzebnej koagulacji, aby ograniczyć dodatkowe bodźce zapalne. Wskazówka: Dynamika przepływu krwi w pobliżu obwodu preparatu ulega zmianie w wyniku tego uszkodzenia tkanki.¹⁹ Dlatego, aby zminimalizować ten wpływ na gromadzenie danych, do obrazowania należy wykorzystywać naczynia krwionośne znajdujące się w centrum preparatu.
8. Otwarty mięsień opuszkowy leży płasko na aluminiowym podestcie, będąc nadal połączonym cienkim więzadłem z najądrzem pod jądrem. Odsuniecie jądra na bok odsłania to więzadło, w tym małą tętnicę i żyłę łączącą się z najądrzem. Użyj koagulatora do zamknięcia naczyń i mikronożyczek do przecięcia więzadła łącznego między jądrem a tkanką opuszkową.
9. Delikatnie odepchnij wyizolowane jądro z powrotem do kanału pachwinowego. Inni autorzy resekują jądro po podwiązaniu proksymalnym (orchiektomia) wraz z powiązaną tkanką tłuszczową pachwinową.²⁰ W czułym modelu, takim jak aktywacja leukocytów indukowana przez IRI, staramy się unikać wszelkich dodatkowych bodźców chirurgicznych, dlatego rezygnujemy z resekcji jądra, co zazwyczaj nie jest konieczne do uzyskania wystarczającej ekspozycji mięśnia opuszkowego.
10. Oprócz pierwszego szwu mocującego, przyszyj cztery krawędzie tkanki (po dwie z każdej strony) i przymocuj nici do taśm, aby ostrożnie rozłożyć tkankę opuszkową promieniście na aluminiowym podestcie. Pozostawienie przerwy między aluminiowym podestem a zewnętrznym wejściem do kanału pachwinowego ułatwia późniejsze zaciskanie mięśnia opuszkowego w celu wywołania niedokrwienia.
11. Umieść dwa końce cewnika polietylenowego (średnica wewnętrzna 0,28 mm) blisko tkanki opuszkowej w celu przygotowania układu do superfuzji. Upewnij się, że w świetle cewnika nie ma powietrza, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w docelowej komorze z cieczą.
12. Za pomocą strzykawki nanieś linię wazeliny wokół mięśnia opuszkowego. Linia ta musi być większa niż rozmiar szkiełka nakrywkowego używanego do przykrycia.
13. Aby stworzyć komorę z cieczą, połóż kwadratowe szkiełko nakrywkowe (32×32 mm) na tkance opuszkowej i mocno przyciśnij krawędzie do linii wazeliny.
14. W przypadku, gdy tkanka opuszkowa nie jest superfundowana konkretnym lekiem, ciągła wymiana otaczającej cieczy nie jest niezbędna. Wówczas wystarczające może być jednorazowe wprowadzenie do stworzonej komory roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu. Lokalna stymulacja lekami powinna być jednak prowadzona w sposób ciągły za pomocą pompy mikroperfuzyjnej z szybkością 3 ml na godzinę.
15. Tkanka opuszkowa jest teraz gotowa do obrazowania mikroskopowego.

3. Konfiguracja intravitalna

Podstawowa konfiguracja do obrazowania intravitalnego może się różnić. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego eksperymenty należy przeprowadzać w ciemni.

1. Zwierzę przenosi się na stolik mikroskopu epifluorescencyjnego do obrazowania intravitalnego, wyposażonego w źródło światła LED o długości fali 470 nm do oświetlenia epi. Należy użyć obiektywu imersyjnego z wodą (20×/1.0), aby uzyskać powiększenie około 800×. Obserwacje rejestruje się za pomocą cyfrowej kamery o wysokiej rozdzielczości, a nagrania zapisuje na komputerze osobistym w celu późniejszej analizy.
2. W celu znakowania leukocytów, rhodaminę 6G wlewa się dożylnie przez cewnikt żyły szyjnej w stężeniu 0,4 mg/kg masy ciała.
3. Do obserwacji wybiera się żyłkę poprzecapilarną. Średnica naczynia powinna mieścić się w przedziale 20-60 μm, a przepływ krwi powinien być wystarczający. Aby zminimalizować wpływ uprzedniej aktywacji tkanki, do dalszej analizy można wykorzystać wyłącznie naczynia, w których rolling leukocytów wynosi <20 komórek/30 sekund, a liczba komórek adherentnych <10 komórek/200 μm śródbłonka żyłki.
4. Jeśli to możliwe, do obserwacji można wykorzystać do trzech żyłek poprzecapilarnych; powinny one być jednak zlokalizowane w tym samym obszarze tkanki mięśnia kremastora, aby uniknąć pomyłki w identyfikacji naczyń w różnych punktach czasowych.

4. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfozyjne (IIR)

1. Pozostawić tkankę do stabilizacji na 30 minut.
2. Wykonać 30-sekundowy zapis w celu ustalenia wartości bazowych dla toczenia i adhezji leukocytów. W idealnych warunkach należy w sumie przeprowadzić trzy zapisy bazowe, aby zweryfikować liczbę komórek i wyznaczyć odchylenia standardowe.
3. Za pomocą pęsety aplikacyjnej delikatnie przymocować klips do naczyń Biemera wokół najbardziej proksymalnego końca odsłoniętej tkanki mięśnia kremastra. Zastój powinien wystąpić natychmiast, co można zwizualizować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej w obserwowanym odcinku naczynia.
4. W zależności od wymaganego stopnia uszkodzenia można zastosować różne ramy czasowe. Stosujemy 30 minut czasu niedokrwienia, zgodnie z opisami innych autorów.^21-23 Następnie należy usunąć zacisk naczyniowy. Pozostawić przepływ krwi do stabilizacji przez kolejne 15 minut.
5. W okresie reperfuzji można wykonywać kolejne zapisy o czasie trwania 30 sekund (np. 30 sekund co 15 minut). Zapisy należy zapisać cyfrowo do późniejszej analizy offline.
6. W celu zakończenia eksperymentu szczura uśmierca się poprzez zwichnięcie szyi pod odpowiednią narkozą, dociskając tępym narzędziem, takim jak tępe ostrze nożyczek, do podstawy czaszki. Drugą ręką należy szybko pociągnąć za nasadę ogona, powodując oddzielenie kręgów szyjnych od czaszki.

5. Analiza odtwarzania wideo w trybie offline

1. Do analizy nagrań wideo w trybie offline pomocne jest użycie oprogramowania umożliwiającego wybór poszczególnych klatek oraz obserwację sekwencji wideo w spowolnionym tempie. Odpowiednio dostosuj kontrast i jasność. W naszej pracy wykorzystujemy oprogramowanie dostarczone przez producenta mikroskopu, które umożliwia dokonywanie pomiarów długości oraz powiększanie cyfrowe.
2. W celu kwantyfikacji tocznia leukocytów wyznacz wirtualną linię przecinającą naczynie w pionie, która będzie stała dla wszystkich nagrań. Ręcznie policz liczbę toczących się leukocytów, które przekroczą linię w ciągu 30 sekund.
3. W celu kwantyfikacji leukocytów adherentnych wyznacz odcinek naczynia o długości 200 μm, który będzie stały dla wszystkich nagrań.²³ Policz liczbę wyraźnie widocznych leukocytów, które pozostają w spoczynku przez 30 sekund – zdefiniowano je w ten sposób jako adherentne.²⁴

6. Reprezentatywne wyniki

IRI mięśnia kremastra nie wpływa na średnie ciśnienie tętnicze (MAP), częstość akcji serca oraz pH krwi

Wykorzystując wspomnianą konfigurację (Rycina 1), zbadaliśmy mikrokrążenie w IRI w ramach dwugodzinnego protokołu; możliwy jest jednak znacznie dłuższy czas obserwacji, wynoszący do 6 godzin. Jak pokazano na Rycynie 2, IRI mięśnia kremastra nie wywołuje istotnych efektów makrohemodynamicznych w krążeniu szczura, ponieważ średnie ciśnienie tętnicze i częstotliwość akcji serca pozostają stabilne przez cały okres badania. Ponadto monitorowano homeostazę poprzez częste pomiary pH krwi tętniczej, które mieściły się w granicach fizjologicznych i nie wykazały istotnych różnic między grupami.

IRI indukuje toczenie leukocytów w krążeniu mięśnia wstępnego

Interakcja leukocytów z śródbłonkiem jest kluczowym zdarzeniem w ostrym stanie zapalnym. Za pomocą mikroskopii wewnątrzorganizowej stwierdzono zależny od czasu wzrost liczby toczących się leukocytów w IRI mięśnia czebrowatego (Rysunek 3A), co jest zgodne z wcześniejszymi danymi ^{21, 25}. W ciągu dwóch godzin obserwacji liczba toczących się leukocytów wzrastała do maksymalnie 137,63 ± 22,55 % wartości bazowej po 120 minutach reperfuzji, osiągając poziom istotny statystycznie w porównaniu z zwierzętami z grupy pozorowanej (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04 % wartości bazowej).

IRI indukuje adhezję leukocytów w krążeniu mięśnia dźwigacza jądra

W celu dalszej oceny interakcji leukocytarno-śródbłonkowej przeanalizowano adhezję leukocytów w sekcji naczynia o długości 200 μm. IRI wywołało wzrost liczby adhezyjnych leukocytów, który po 60 minutach znacząco przekroczył wartości u zwierząt w grupie sham (118.33 ± 6.83 vs. 96.27 ± 5.78 % wartości wyjściowej), a następnie nadal wzrastał do 120 minuty reperfuzji (Rysunek 3B).

Podsumowując, opisany model in vivo dostarcza spójnych danych na temat ostrej aktywacji leukocytów w IRI, zapewniając jednocześnie przeżywalność zwierząt i stabilność krążenia.

Rysunek 1. A. Schemat blokowy przeprowadzenia intravitalnej mikroskopii epifluorescencyjnej w modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia kremaster szczura. Po wykonaniu niezbędnych przygotowań do znieczulenia i monitorowania, mięsień kremaster szczura zostaje odsłonięty w celu obrazowania. Rejestracja aktywacji leukocytów odbywa się przed i po niedokrwieniu tkanki. Następująca analiza wideo powinna być przeprowadzona w trybie offline. B. Schemat proponowanej konfiguracji intravitalnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rysunek 2. IRI mięśnia kremastra nie wpływa na średnie ciśnienie tętnicze (MAP), częstość akcji serca i pH krwi. Średnie ciśnienie tętnicze (A) oraz częstość akcji serca (B) monitorowano co 30 minut przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą przetwornika ciśnienia po kaniulacji prawej tętnicy szyjnej. Pomiar pH krwi tętniczej (C) wykonano po 0, 60 i 120 minutach. Wartości stanowią średnią ±SEM z 6 różnych szczurów i mieściły się w granicach poziomów fizjologicznych bez istotnych różnic między grupami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 3. IRI zwiększa interakcję leukocytów z śródbłonkiem w krążeniu mięśnia kremastra. Po znakowaniu leukocytów rhodaminą 6G (0,4 mg/kg masy ciała) zastosowano intravitalną mikroskopię epifluorescencyjną w celu określenia interakcji leukocytów ze śródbłonkiem w obrazie uszkodzenia reperfuzyjnego w protokole trwającym 120 minut po 30 minutach niedokrwienia tkanki. Rejestrację prowadzono przy powiększeniu około ×800. A. IRI znacząco zwiększa liczbę toczących się leukocytów w żylkach postkapilarnych mięśnia kremastra do 120 minuty reperfuzji, podczas gdy toczenie leukocytów pozostaje stabilne przez cały czas trwania eksperymentu w tkance kremastra, która nie była poddana niedokrwieniu. Wartości stanowią średnią ± SEM z 6 obserwowanych szczurów. # p<0,05 przy użyciu nieparzystego testu t. B. Liczba adherentnych leukocytów jest znacząco zwiększona w losowo wybranym 200μm odcinku naczynia postkapilarnego po 30 minutach niedokrwienia kremastra i następnych 60 minutach reperfuzji tkanki. Wyniki stają się jeszcze bardziej wyraźne po dwugodzinnym okresie reperfuzji. Wartości stanowią średnią ± SEM z 6 obserwowanych szczurów. # p<0,05 przy użyciu nieparzystego testu t. C. Reprezentatywne zdjęcia żylki postkapilarnej przed niedokrwieniem (lewo) oraz 120 minut po IRI (prawo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

Oddziaływanie leukocytów z śródbłonkiem, produkcja reaktywnych form tlenu oraz aktywacja układu dopełniacza są kluczowymi cechami dysfunkcji tkanek wywołanej przez IRI.²⁶ Mikrokrążenie dotkniętej tkanki jest uważane za główną lokalizację inicjacji stanu zapalnego. Poza eksperymentami ex vivo, takimi jak testy w komorach przepływowych^{27, 28}, niezbędne jest zapewnienie dobrze ugruntowanych modeli obrazowania intravitalnego w celu dalszej oceny istotności in vivo. Choć IRI jest powiąz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa sprzętu:	Firma:	Nr katalogowy:	Uwagi:
Forene 100% (V/V)	Abbot	B506	izofluran API
Szew terylenowy	Serag Weissner	OC108000
Polietylenowa rurka o małej średnicy Portex	Smiths Medical	800/100/100	średnica wewnętrzna 0,28 mm
0,9% roztwór soli fizjologicznej	Fresinus Kabi	808771
Zestaw do kauteryzacji Change-A-tip deluxe	Bovie Medical	DEL1
Kaniula Abbocath -T 14G	Venisystems	G713 - A01	używana jako rurka soczewkowa
Wentylator Servo 900C	Maquet		używany jako respirator dla zwierząt
Logiczny przetwornik ciśnienia	Smiths Medical	MX1960
Monitor Sirecust 404	Siemens
Analizator blatu ABL 700	Radiometer		do pomiaru gazów krwi
Mata grzewcza	Effenberger	8319
Stolik aluminiowy	Alfun	AW7022
Mikroskop chirurgiczny OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Laboratoryjny zestaw instrumentów mikrochirurgicznych	S&T	767
Klamra naczyniowa Biemera	Diener	64.562
Kleszczyki do klamer	Diener	64.568	do klamer naczyniowych Biemera
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Wazelina biała DAB	Winthrop	2726853
Szkiełka nakrywkowe			32x32 mm
Układ intravitalny
Zeis Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeis	490036	mikroskop epifluorescencyjny
LED 470 nm	Carl Zeis	423052	źródło światła fluorescencyjnego
System Colibri 2	Carl Zeis	423052
W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC	Carl Zeis	421452	obiektyw z imersją w wodzie
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeis	426509	cyfrowa kamera wysokiej rozdzielczości
Oprogramowanie Axio vision LE	Carl Zeis	410130	do analizy offline