Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Podsumowanie

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Streszczenie

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) bierze udział w wielu stanach patologicznych, takich jak udar mózgu, zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie jelit, a także występuje po przeszczepach i operacjach naczyniowo-sercowych.¹ Reperfuzja uprzednio niedokrwionej tkanki, choć jest niezbędna do zapobiegania nieodwracalnym uszkodzeniom tkanek, wywołuje nadmierny stan zapalny w dotkniętym obszarze. Obok produkcji reaktywnych form tlenu, aktywacji układu dopełniacza i zwiększonej przepuszczalności mikro naczyniowej, aktywacja leukocytów jest jednym z głównych czynników w patologicznej kaskadzie zapalnego uszkodzenia tkanek podczas reperfuzji.^{2, 3} Aktywacja leukocytów jest procesem wieloetapowym, składającym się z toczenia, trwałej adhezji oraz transmigracji, a jest ona mediowana przez złożoną interakcję cząsteczek adhezyjnych w odpowiedzi na chemoatraktanty, takie jak czynniki dopełniacza, chemokiny lub czynnik aktywujący płytki krwi.⁴

Podczas gdy toczenie się leukocytów w żylkach pocapilarnych jest głównie zapośredniczone przez oddziaływanie selektyn⁵ z ich przeciwligandami, trwała adhezja leukocytów do śródbłonka jest kontrolowana przez selektyny poprzez wiązanie z cząsteczkami adhezyjnymi międzykomórkowymi (ICAM) oraz cząsteczkami adhezyjnymi komórek naczyniowych (VCAM).^{6, 7}

Złotym standardem w obserwacji in vivo oddziaływań leukocytów z endotelium jest technika mikroskopii witalnej, opisana po raz pierwszy w 1968 roku.⁸

Choć opisano różne modele IRI (uszkodzenia niedokrwienno-reperfozyjnego) dla wielu organów, ^9-12 tylko kilka z nich nadaje się do bezpośredniej wizualizacji rekrutacji leukocytów w łożysku mikronaczyniowym przy wysokiej jakości obrazowania.⁸

W niniejszej pracy promujemy cyfrową intravitalną mikroskopię epifluorescencyjną żyłcek pomostkowych w mikrokrążeniu mięśnia kremaster szczura ¹³ jako wygodną metodę jakościowej i ilościowej analizy rekrutacji leukocytów w badaniach nad niedokrwienno-reperfuzją (IRI) w tkance mięśni poprzecznie prążkowanej, a także przedstawiamy szczegółowy instruktaż wykonania tej techniki. Ponadto ilustrujemy częste błędy i podajemy przydatne wskazówki, które pozwolą czytelnikowi w pełni zrozumieć i bezpiecznie przeprowadzić tę metodę.

W protokole krok po kroku przedstawiamy sposób rozpoczęcia znieczulenia kontrolowanego przez oddychanie przy zastosowaniu odpowiedniego monitorowania, aby utrzymać zwierzę w stanie głębokiej anestezji przez dłuższy czas. Następnie opisujemy przygotowanie mięśnia żylnego (cremasteric preparation) w formie cienkiego, płaskiego arkusza dla uzyskania doskonałej rozdzielczości optycznej oraz przedstawiamy ugruntowany w naszych laboratoriach protokół obrazowania leukocytów w procesie IRI.

Protokół

1. Znieczulenie i monitorowanie

1. Przed przeprowadzeniem doświadczeń na zwierzętach należy uzyskać stosowne zgody krajowe i instytucjonalne z zakresu etyki. Po zatwierdzeniu przez komisję etyczną należy znieczulić samce szczurów Sprague Dawley o masie ciała od 120 - 180 g. Do skrzynki z pleksiglasu należy podać 2 - 3 vol% izofluranu za pomocą waporyzatora do izofluranu, a następnie umieścić w niej szczura.
2. Gdy tylko osiągnięty zostanie odpowiedni poziom znieczulenia (brak reakcji na uciśnięcie palca lub ogona), szczura należy zważyć i ogolić w przednim obszarze szyi.
3. Szczura należy ułożyć na plecach na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, i podawać izofluran w stężeniu 2 vol% za pomocą silikonowej maski.

Następujące kroki przygotowawcze najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu chirurgicznego.

4. W celu przygotowania tchawicy, tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej, wykonaj 2 cm poziome nacięcie skóry w okolicy dołka nadmostkowego i odsuń gruczoły ślinowe bocznie.
5. W ten sposób odsłonięte zostaną brzuszne mięśnie szyi. Ostrożnie rozdziel je w linii środkowej i zlokalizuj tchawicę. Odsłoń 1 - 2 cm tchawicy i umieść pod nią mikrochwytak, aby ją unieść.
6. Następnie wykonaj nacięcie w obrębie strony brzusznej tchawicy, sięgające mniej więcej do połowy jej grubości. Należy uważać, aby nie przeciąć jej całkowicie; w przeciwnym razie przecięty koniec tchawicy może cofnąć się do klatki piersiowej, co bardzo utrudni dalszą pracę.
7. Wprowadź kaniulę typu Abbocath (14G) jako rurkę intubacyjną do dolnej części tchawicy, która została wcześniej podłączona do respiratora dla zwierząt. Wskazówka: Mocne zamocowanie na zaciskach magnetycznych oraz zaszycie tchawicy wokół rurki jest niezbędne do utrzymania rurki intubacyjnej na miejscu. Zazwyczaj stosujemy szwy Terylene 5/0, jednak można użyć podobnego materiału szewnego.
8. Oddychanie może być następnie kontrolowane objętościowo (częstość: 35 - 45 oddechów/minutę; objętość tidalna: 4,5 - 5 ml; FiO₂: 0,35 - 0,50; Isoflurane: 1,5 - 2 vol%).¹⁴ Przeciwstawianiem niedodmą można zapobiegać poprzez utrzymanie dodatniego ciśnienia końcowowydechowego na poziomie od 5 do 10 mm H₂O.¹⁵
9. W celu kanulacji tętnicy szyjnej, prawy mięsień mostkowo-tarczycowy rozdziela się poprzez tępą dyssekcję, aby zlokalizować tętnicę szyjną.
10. Ostrożnie oddziel nerw błędny od tętnicy szyjnej i uchwyć tętnicę zakrzywionym mikrochwytakiem, aby zatamować przepływ krwi z serca.
11. Przełóż dwa fragmenty nici chirurgicznej o tej samej długości pod tętnicą szyjną. W odniesieniu do serca, szew bardziej dystalny zawiąż mocno, aby zablokować przepływ krwi z obszaru głowy, natomiast szew proksymalny zawiąż luźno wokół tętnicy szyjnej.
12. Za pomocą mikronożyczek wykonaj małe nacięcie w tętnicy szyjnej pomiędzy dwiema ligaturami.
13. Wprowadź cewnik polietylenowy (średnica wewnętrzna 0,28 mm) wypełniony roztworem soli fizjologicznej i podłączony do przetwornika ciśnienia.
14. Usuń mikrochwytak i wprowadź cewnik głębiej do tętnicy. Następnie zaciśnij ligaturę proksymalną wokół tętnicy i cewnika. Wskazówka: Zastosowanie drugiej szwy proksymalnej zapobiega krwawieniu po usunięciu mikrochwytaka.
15. Zawiąż ligaturę dystalną wokół tętnicy szyjnej i cewnika dla dodatkowego zakotwiczenia.
16. Stale monitoruj znieczulenie, kontrolując częstotliwość akcji serca i ciśnienie tętnicze. Wykonuj okresowe analizy gazometryczne krwi tętniczej za pomocą analizatora gazów krwi.¹⁶ Kryteriami wykluczenia są: częstość akcji serca niższa niż 300 bpm lub przekraczająca 360 bpm, a także spadek średniego ciśnienia tętniczego poniżej 80 mmHg przez okres dłuższy niż 5 minut.^{17, 18} Utrzymuj pH krwi w granicach fizjologicznych (7,35 - 7,45). W przypadku konieczności przerwania eksperymentu z powodu nieprawidłowych parametrów monitorowania, uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie karku lub upuszczenie krwi.

W przypadku dożylnego podawania barwników fluorescencyjnych lub innych interesujących leków, należy wykonać następujące czynności:

17. Użyj mikroskopu chirurgicznego, aby ustawić ostrość na obszarze lewej żyły szyjnej wewnętrznej.
18. Używając pęset w obu dłoniach, przerwij cienką powięź, aby odsłonić żyłę szyjną. Przymocuj żyłę za pomocą kątowej mikropęsety. Powoduje to zatrzymanie przepływu krwi.
19. Za pomocą pęsety przeprowadź dwa nici chirurgiczne o równej długości pod żyłą szyjną, analogicznie do kaniulacji tętnicy szyjnej. Zawiąż mocno szew dystalny oraz luźno szew proksymalny wokół żyły szyjnej.
20. Wykonaj niewielkie nacięcie w żyle szyjnej i wprowadź przemyty solą fizjologiczną cewnik polietylenowy (średnica wewnętrzna 0.28 mm). Należy pamiętać, że nacięcie i kaniulacja żyły mogą być bardziej wymagające i czasochłonne niż w przypadku tętnicy szyjnej.
21. Wsuń cewnik w kierunku serca i zaciśnij podwiązkę znajdującą się najbliżej serca wokół żyły i cewnika.
22. Po potwierdzeniu drożności zawiąż podwiązkę dystalną wokół cewnika. Wskazówka: Dodatkowe przymocowanie obu cewników taśmą może zapobiec ich wysunięciu.
23. Często przemywaj cewniki, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów wewnątrz światła.

2. Przygotowanie mięśnia kremaster

1. Do obrazowania mięśnia kremaster używamy aluminiowej podstawy o grubości 1,5 – 2 cm. Podstawa szybko przyjmuje temperaturę z podkładki grzewczej, co ułatwia kontrolę termiczną tkanki kremaster. Jest to kluczowe w badaniach nad stanami zapalnymi. Alternatywnie można użyć platformy z pleksiglasu, choć regulacja temperatury mięśnia kremaster jest wtedy trudniejsza. Umieść mosznę w centrum podstawy.
2. Pierwsze nacięcie wykonuje się w skórze i zewnętrznej powięzi nasiennej powyżej moszny, w jej najbardziej dystalnej części, a następnie ostrożnie rozszerza się przestrzeń podskórną za pomocą cienkich nożyczek. Należy unikać dotykania instrumentami tkanek leżących głębiej.
3. Zaraz po odsłonięciu tkanka jest nawilżana podgrzanym (37 °C) roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu. Roztwór należy regularnie nakładać na każdą odsłoniętą tkankę.
4. Tkankę łączną między zewnętrzną powięzią nasienną a mięśniem kremaster ostrożnie usuwa się, aby uwolnić mięsień kremaster z otaczających go tkanek.
5. Następnie ostrożnie oczyszcza się zewnętrzną powierzchnię mięśnia kremaster z tkanki łącznej. Ciągła superfuzja podczas dyssekcji nawilża tkankę łączną, co ułatwia jej widoczność i usuwanie.
6. Przyszyj dystalny koniec worka kremaster, aby go unieruchomić i lekko rozciągnąć.
7. Nacięcie dystalnego końca worka wykonuje się od strony brzusznej, a następnie wydłuża nacięcie proksymalnie za pomocą mikronożyczek. Naczynia krwawiące wzdłuż linii nacięcia należy ostrożnie koagulować przy użyciu kauteryzatora termicznego. Należy unikać niepotrzebnej kauteryzacji, aby ograniczyć dodatkowe bodźce zapalne. Wskazówka: Dynamika przepływu krwi w pobliżu peryferii preparatu jest zmieniona przez to uszkodzenie tkanki.¹⁹ Dlatego, aby zminimalizować ten wpływ na zbieranie danych, do obrazowania należy wykorzystywać naczynia krwionośne znajdujące się w centrum preparatu.
8. Otwarty mięsień kremaster spoczywa płasko na aluminiowej podstawie, będąc wciąż połączonym cienką więzadłem z najądrzem pod jądrem. Odchylenie jądra na bok odsłania to więzadło, w tym małą tętnicę i żyłę łączącą się z najądrem. Użyj kauteryzatora do zamknięcia naczyń i mikronożyczek do przecięcia więzadła łącznego między jądrem a tkanką kremaster.
9. Ostrożnie odsuń wyizolowane jądro z powrotem do kanału pachwinowego. Inni autorzy resekują jądro po podwiązaniu proksymalnym (orchiektomia) wraz z powiązaną tkanką tłuszczową pachwinową.²⁰ W wrażliwym modelu, takim jak aktywacja leukocytów indukowana niedokrwieniem i reperfuzją (IRI), staramy się unikać wszelkich dodatkowych bodźców chirurgicznych, dlatego rezygnujemy z resekcji jądra, co zazwyczaj nie jest konieczne do uzyskania wystarczającego odsłonięcia mięśnia kremaster.
10. Oprócz pierwszego szwu mocującego, przyszyj cztery krawędzie tkanki (po dwie po każdej stronie) i przymocuj nici do taśm, aby ostrożnie rozłożyć tkankę kremaster promieniście na aluminiowej podstawie. Pozostawienie przerwy między aluminiową podstawą a zewnętrznym wejściem do kanału pachwinowego ułatwia późniejsze zaciskanie mięśnia kremaster w celu wywołania niedokrwienia.
11. Umieść dwa końce cewnika polietylenowego (średnica wewnętrzna 0,28 mm) blisko tkanki kremaster do konfiguracji superfuzji. Upewnij się, że światło cewnika jest wolne od powietrza, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w końcowej komorze z płynem.
12. Za pomocą strzykawki nanieś linię z wazeliną wokół mięśnia kremaster. Linia musi być szersza niż użyte do przykrycia szkiełko nakrywki.
13. Aby stworzyć komorę z płynem, połóż kwadratowe szkiełko nakrywkowe (32×32 mm) na tkance kremaster i mocno przytwierdź krawędzie do linii z wazeliny.
14. W przypadku, gdy tkanka kremaster nie jest poddawana superfuzji konkretnym lekiem, ciągła wymiana otaczającego płynu nie jest niezbędna. Wówczas wystarczające może być jednorazowe wprowadzenie do stworzonej komory roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym z dodatkiem wapnia i magnezu. Lokalna stymulacja lekami powinna być jednak prowadzona w sposób ciągły za pomocą pompy mikroperfuzyjnej z prędkością 3 ml na godzinę.
15. Tkanka kremaster jest teraz gotowa do obrazowania mikroskopowego.

3. Konfiguracja obrazowania intravitalnego

Podstawowa konfiguracja do obrazowania intravitalnego może się różnić. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego eksperymenty powinny być przeprowadzane w ciemni.

1. Zwierzę przenosi się na stolik mikroskopu epifluorescencyjnego do badań intravitalnych, wyposażonego w źródło światła LED o długości fali 470 nm do oświetlenia epifluorescencyjnego. Należy użyć obiektywu imersyjnego (20×/1.0), aby uzyskać powiększenie około 800×. Obserwacje rejestruje się za pomocą cyfrowej kamery o wysokiej rozdzielczości i przechowuje na komputerze osobistym do późniejszej analizy.
2. W celu znakowania leukocytów, rhodaminę 6G wstrzykuje się dożylnie przez cewnik żylny w stężeniu 0,4 mg/kg masy ciała.
3. Do obserwacji wybiera się żyłkę pocapilarną. Średnica naczynia powinna mieścić się w zakresie 20-60 μm, a przepływ krwi powinien być wystarczający. Aby zminimalizować wpływ preaktywacji tkanki, do dalszych analiz można wykorzystać jedynie naczynia, w których liczba toczących się leukocytów wynosi <20 komórek/30 sekund, a liczba komórek adherentnych <10 komórek/200 μm śródbłonka żyłki.
4. Jeśli to możliwe, do obserwacji można wykorzystać do trzech żyłek pocapilarnych; powinny one jednak znajdować się w odpowiadającym sobie obszarze tkanki mięśnia dźwigacza (cremasteric tissue), aby uniknąć pomyłki naczyń w różnych punktach czasowych.

4. Uszkodzenie reperfuzyjne (IIR)

1. Pozostawić tkankę do stabilizacji na 30 minut.
2. Wykonać 30-sekundowy pomiar w celu ustalenia wartości bazowych dla toczenia się i adhezji leukocytów. W idealnym przypadku należy przeprowadzić łącznie trzy pomiary bazowe, aby zweryfikować liczbę komórek i obliczyć odchylenia standardowe.
3. Za pomocą pęsety aplikacyjnej delikatnie założyć zacisk naczyniowy Biemera na najbardziej proksymalny koniec odsłoniętej tkanki mięśnia kremaster. Staza powinna nastąpić natychmiast, co można zwizualizować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej w obserwowanym odcinku naczynia.
4. W zależności od wymaganego stopnia uszkodzenia można zastosować różne przebiegi czasowe. Stosujemy 30 minut czasu niedokrwienia, zgodnie z opisami innych autorów.^21-23 Następnie należy usunąć zacisk naczyniowy. Pozostawić przepływ krwi do stabilizacji przez kolejne 15 minut.
5. Kolejne pomiary o czasie trwania 30 sekund można wykonywać w trakcie okresu reperfuzji (np. 30 sekund co 15 minut). Nagrania należy zapisać cyfrowo do późniejszej analizy offline.
6. W celu zakończenia eksperymentu szczura uśmierca się poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych pod odpowiednim znieczuleniem, dociskając tępym narzędziem, np. tępą krawędzią ostrza nożyczek, do podstawy czaszki. Drugą ręką szybko pociąga się za nasadę ogona, co powoduje oddzielenie kręgów szyjnych od czaszki.

5. Analiza odtwarzania wideo w trybie offline

1. W przypadku analizy nagrań wideo w trybie offline pomocne jest zastosowanie oprogramowania umożliwiającego wybór poszczególnych klatek oraz obserwację sekwencji wideo w zwolnionym tempie. Odpowiednio dostosuj kontrast i jasność. Wykorzystujemy oprogramowanie dostarczone przez producenta mikroskopu, które umożliwia wykonywanie pomiarów długości oraz powiększenia cyfrowego.
2. W celu kwantyfikacji toczenia się leukocytów wyznacz wirtualną linię przecinającą naczynie pionowo, która będzie jednakowa dla wszystkich nagrań. Ręcznie policz liczbę toczących się leukocytów, które przekroczą tę linię w ciągu 30 sekund.
3. W celu kwantyfikacji leukocytów adherentnych wyznacz odcinek naczynia o długości 200 μm, który będzie jednakowy dla wszystkich nagrań.²³ Policz liczbę wyraźnie widocznych leukocytów, które pozostają w spoczynku przez 30 sekund – zdefiniowano je w ten sposób jako adherentne.²⁴

6. Reprezentatywne wyniki

IRI mięśnia opuszkowego nie wpływa na średnie ciśnienie tętnicze (MAP), częstotliwość akcji serca i pH krwi

Wykorzystując wspomnianą konfigurację (Rysunek 1), zbadaliśmy mikrokrążenie podczas IRI w ramach dwugodzinnego protokołu; możliwy jest jednak znacznie dłuższy czas obserwacji, wynoszący do 6 godzin. Jak pokazano na Rysunku 2, IRI mięśnia kremastra nie wywołuje istotnych efektów makrohemodynamicznych w krążeniu szczura, ponieważ średnie ciśnienie tętnicze oraz częstość akcji serca pozostają stabilne przez cały okres badania. Ponadto monitorowano homeostazę poprzez częste pomiary pH krwi tętniczej, które mieściły się w granicach fizjologicznych i nie wykazały istotnych różnic między grupami.

IRI indukuje toczenie się leukocytów w krążeniu mięśnia krezmowego

Oddziaływanie leukocytów z śródbłonkiem jest kluczowym zdarzeniem w ostrym stanie zapalnym. Za pomocą mikroskopii wewnątrzorganicznej stwierdziliśmy zależny od czasu wzrost liczby toczących się leukocytów w IRI mięśnia kremaster (Rysunek 3A), co jest zgodne z wcześniejszymi danymi ^{21, 25}. Liczba toczących się komórek rosła w ciągu dwóch godzin obserwacji, osiągając maksimum 137,63 ± 22,55 % wartości bazowej po 120 minutach czasu reperfuzji, a następnie osiągnęła istotność statystyczną w porównaniu z zwierzętami z grupy operacji pozornej (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04 % wartości bazowej).

IRI indukuje adhezję leukocytów w krążeniu mięśnia kremastra

W celu dalszej oceny interakcji leukocytów z śródbłonkiem przeanalizowano adhezję leukocytów w przekroju naczynia o szerokości 200 μm. IRI wywołało wzrost liczby adherentnych leukocytów, który po 60 minutach znacząco przekroczył wartości uzyskane u zwierząt w grupie sham (118,33 ± 6,83 vs. 96,27 ± 5,78 % wartości wyjściowej) i nadal wzrastał do 120 minuty reperfuzji (Rysunek 3B).

Podsumowując, opisany model in vivo dostarcza spójnych danych dotyczących ostrej aktywacji leukocytów w IRI, zapewniając jednocześnie przeżywalność zwierząt oraz stabilność krążenia.

Rysunek 1. A. Schemat przepływu dla intravitalnej mikroskopii epifluorescencyjnej w modelu urazu reperfuzyjnego po niedokrwieniu mięśnia opuszkowego szczura. Po niezbędnym przygotowaniu do znieczulenia i monitorowania, mięsień opuszkowy szczura zostaje odsłonięty w celu przeprowadzenia obrazowania. Rejestracja aktywacji leukocytów odbywa się przed i po niedokrwieniu tkanki. Dalsza analiza wideo powinna być wykonywana w trybie offline. B. Schemat proponowanego układu intravitalnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 2. IRI mięśnia kremaster nie wpływa na średnie ciśnienie tętnicze (MAP), częstość akcji serca i pH krwi.Średnie ciśnienie tętnicze (A) oraz częstość akcji serca (B) monitorowano co 30 minut przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą przetwornika ciśnienia po kaniulacji prawej tętnicy szyjnej. Pomiar pH krwi tętniczej (C) przeprowadzano po 0, 60 i 120 minutach. Wartości stanowią średnią ±SEM dla 6 różnych szczurów i mieściły się w granicach fizjologicznych, bez istotnych różnic między grupami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 3. IRI zwiększa interakcję leukocytów z śródbłonkiem w krążeniu mięśnia kremaster. Po znakowaniu leukocytów rhodamine 6G (0,4 mg/kg masy ciała) zastosowano intravitalną mikroskopię epifluorescencyjną w celu określenia interakcji leukocytów ze śródbłonkiem w urazie reperfuzyjnym w ramach protokołu trwającego 120 minut po 30 minutach niedokrwienia tkanki. Rejestracje wykonano przy powiększeniu około ×800. A. IRI znacząco zwiększa liczbę toczących się leukocytów w żylkach pokapilarnych mięśnia kremaster po 120 minutach reperfuzji, podczas gdy toczenie się leukocytów pozostaje stabilne przez cały czas trwania eksperymentu w tkance kremaster, która nie była poddana niedokrwieniu. Wartości stanowią średnią ± SEM z 6 obserwowanych szczurów. # p<0,05 przy użyciu nieparzystego testu t. B. Liczba adherentnych leukocytów jest znacząco zwiększona w losowo wybranym 200μm odcinku naczynia pokapilarnego po 30 minutach niedokrwienia kremaster i następnych 60 minutach reperfuzji tkanki. Wyniki stają się jeszcze bardziej wyraźne po dwugodzinnym okresie reperfuzji. Wartości stanowią średnią ± SEM z 6 obserwowanych szczurów. # p<0,05 przy użyciu nieparzystego testu t. C. Reprezentatywne obrazy żylki pokapilarnej przed niedokrwieniem (lewo) i 120 minut po IRI (prawo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Oddziaływanie leukocytów z śródbłonkiem, produkcja reaktywnych form tlenu oraz aktywacja układu dopełniacza są kluczowymi cechami dysfunkcji tkanek wywołanej przez IRI.²⁶ Mikrokrążenie dotkniętej tkanki jest uważane za główną lokalizację inicjacji stanu zapalnego. Poza eksperymentami ex vivo, takimi jak testy w komorach przepływowych^{27, 28}, niezbędne jest zapewnienie dobrze ugruntowanych modeli obrazowania intravitalnego w celu dalszej oceny istotności in vivo. Choć IRI jest powiąz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa sprzętu:	Firma:	Nr katalogowy:	Uwagi:
Forene 100% (V/V)	Abbot	B506	izofluran API
Szew terylenowy	Serag Weissner	OC108000
Polietylenowa rurka o małej średnicy Portex	Smiths Medical	800/100/100	średnica wewnętrzna 0,28 mm
0,9% roztwór soli fizjologicznej	Fresinus Kabi	808771
Zestaw do kauteryzacji Change-A-tip deluxe	Bovie Medical	DEL1
Kaniula Abbocath -T 14G	Venisystems	G713 - A01	używana jako rurka soczewkowa
Wentylator Servo 900C	Maquet		używany jako respirator dla zwierząt
Logiczny przetwornik ciśnienia	Smiths Medical	MX1960
Monitor Sirecust 404	Siemens
Analizator blatu ABL 700	Radiometer		do pomiaru gazów krwi
Mata grzewcza	Effenberger	8319
Stolik aluminiowy	Alfun	AW7022
Mikroskop chirurgiczny OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Laboratoryjny zestaw instrumentów mikrochirurgicznych	S&T	767
Klamra naczyniowa Biemera	Diener	64.562
Kleszczyki do klamer	Diener	64.568	do klamer naczyniowych Biemera
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Wazelina biała DAB	Winthrop	2726853
Szkiełka nakrywkowe			32x32 mm
Układ intravitalny
Zeis Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeis	490036	mikroskop epifluorescencyjny
LED 470 nm	Carl Zeis	423052	źródło światła fluorescencyjnego
System Colibri 2	Carl Zeis	423052
W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC	Carl Zeis	421452	obiektyw z imersją w wodzie
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeis	426509	cyfrowa kamera wysokiej rozdzielczości
Oprogramowanie Axio vision LE	Carl Zeis	410130	do analizy offline