Artykuł metodologiczny

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

18.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3995

⸱

3 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Streszczenie

Mapowanie rozkładu białek jest niezbędne do zrozumienia funkcji białek w komórce. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do lokalizacji białek, jednak w obrazach fluorescencyjnych często brakuje kontekstu subkomórkowego. Z kolei immunomikroskopia elektronowa pozwala na lokalizację białek, ale technika ta jest ograniczona przez brak kompatybilnych przeciwciał, słabe zachowanie morfologii oraz fakt, że większość antygenów nie jest wystawiona na powierzchnię preparatu. Metody korelacyjne umożliwiają najpierw uzyskanie obrazu fluorescencyjnego całej komórki, pochodzącego z immunofluorescencji lub od białek znakowanych genetycznie. Następnie próbka jest utrwalana i zatapiana do mikroskopii elektronowej, a obrazy są korelowane 1-3. Jednakże niska rozdzielczość obrazu fluorescencyjnego oraz brak markerów fiducjalnych uniemożliwiają precyzyjną lokalizację białek.

Alternatywnie obrazowanie fluorescencyjne można przeprowadzić po zakonserwowaniu preparatu w plastiku. W tym podejściu blok zostaje pocięty na sekcje, a następnie koreluje się obrazy fluorescencyjne i mikrografie elektronowe tej samej sekcji 4-7. Jednakże limit dyfrakcyjny światła w obrazie skorelowanym zaciera lokalizację poszczególnych cząsteczek, a fluorescencja często wykracza poza granice komórki.

Fluorescencyjna mikroskopia elektronowa o rozdzielczości nanometrycznej (nano-fEM) została opracowana w celu lokalizacji białek w skali nano poprzez obrazowanie tych samych przekrojów z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (PALM) oraz mikroskopii elektronowej. Metoda PALM pozwala przekroczyć limit dyfrakcyjny dzięki obrazowaniu poszczególnych białek fluorescencyjnych i następującemu temu mapowaniu centroidu każdej plamki fluorescencyjnej 8-10.

Przedstawiamy technikę nano-fEM w pięciu krokach. Po pierwsze, próbkę utrwalono i zatopiono w warunkach zapewniających zachowanie fluorescencji białek znakowanych. Po drugie, bloki żywiczne pocięto na ultrawąskie sekcje (70-80 nm), które zamontowano na szkiełku nakrywkowym. Po trzecie, w tych sekcjach wykonano obrazowanie fluorescencji przy użyciu mikroskopu Zeiss PALM. Po czwarte, w tych samych sekcjach obrazowano struktury gęste elektronowo za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Po piąte, mikrografie fluorescencyjne i elektronowe wyrównano, wykorzystując cząsteczki złota jako markery fiducjalne. Podsumowując, subkomórkowa lokalizacja białek znakowanych fluorescencyjnie może zostać określona z rozdzielczością nanometrową w ciągu około jednego tygodnia.

Protokół

1. Zamrażanie pod wysokim ciśnieniem

  1. Przygotować krioprotektant, dodając 0,2 g BSA do 1 ml odpowiedniego medium dla badanej próbki (np. medium hodowlane dla kultur komórkowych, M9 dla C. elegans). Inkubować probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozpuszczenia BSA.
  2. Przed mrożeniem napełnić automatyczne urządzenie do substytucji mrożenia (Leica AFS) ciekłym azotem.
  3. Ustawić program AFS: -90 °C przez 5-30 hr*, 5 °C/hr do -60 °C, -60 °C przez 2 hr (lub wybrać opcję „pause”, jeśli używany jest Leica AFS 2), 5 °C/hr do -30 °C oraz -30 °C przez 72 hr. Jeśli urządzenie AFS pozwala na więcej niż pięć kroków, krok -30 °C należy zastąpić opcją „pause” ustawioną na 0 hr i dodać dwa kolejne kroki: 10 °C/hr do -20 °C oraz 24 hr w -20 °C. Jeśli urządzenie jest ograniczone do pięciu kroków, należy przygotować inny program w osobnym slocie pamięci w następujący sposób: 10 °C/hr do -20 °C oraz 24 hr w -20 °C.
    *Czas ten można dostosować tak, aby krok -60 °C rozpoczął się wczesnym rano.
  4. Przygotować 1% roztwór zapasowy cztejrotlenku osmu, mieszając 0,1 g kryształów cztejrotlenku osmu (EMS, RT19134) z 10 ml bezwodnego acetonu (EMS, # RT10016). Przygotować utrwalacze w 50 ml probówce stożkowej w następujący sposób: najpierw dodać 1 ml wody milliQ, a następnie rozpuścić w niej 0,02 g nadmanganianu potasu (EMS, RT20200). Dodać 19 ml acetonu i dokładnie wymieszać. Na koniec dodać do probówki 20 μl 1% roztworu zapasowego osmu. Aceton jest sekwestratorem wolnych rodników11, co zapobiega polimeryzacji plastiku, jednak zastosowanie acetonu jako medium do substytucji mrożenia jest niezbędne dla zachowania morfologii ze względu na jego oddziaływanie z lipidami. Przed infiltracją plastikiem aceton zostanie zastąpiony etanolem. Rozdzielić po 1 ml do każdej krioprobówki i przechowywać utrwalacze w stanie zamrożonym w ciekłym azocie.
  5. Napełnić nośnik próbki 20% BSA lub bakteriami. Zarówno 20% BSA, jak i bakterie służą jako krioprotektanty. Wybór rodzaju nośnika zależy od próbki. Dla C. elegans należy użyć dołka o szerokości 100 μm.
  6. Umieścić próbkę w nośniku i zamrozić ją w zamrażarce wysokociśnieniowej.
  7. Po zamrożeniu, w środowisku ciekłego azotu, przenieść próbkę do krioprobówki zawierającej utrwalacze. Należy upewnić się, że próbka przez cały czas pozostaje zanurzona w cieczy.
  8. Powtarzać kroki 1.5) – 1.7) aż do zamrożenia wszystkich próbek.
  9. Przenieść wszystkie krioprobówki do urządzenia AFS i wznowić program.

2. Zamiana zamrożenia

  1. Po osiągnięciu temperatury -60 °C, umieść w AFS probówki zawierające 20 ml 95% acetonu.
  2. Po osiągnięciu temperatury -50 °C, zastąp utrwalacze 95% acetonem sześć razy w ciągu 2 hr.
  3. Umieść w komorze probówkę zawierającą 20 ml 0,1% octanu uranylu (Polysciences, #21447-25) w 95% acetonie i schłodź ją wstępnie do -50 °C.
  4. Po zakończeniu etapu płukania, dodaj ~1 ml roztworu octanu uranylu do każdej probówki. W razie potrzeby wznowij program.
  5. Po osiągnięciu temperatury -30 °C, zastąp octan uranylu 95% etanolem sześć razy w ciągu 2 hr.
  6. W międzyczasie przygotuj 97% żywicę z metakrylanu glikolu (GMA, SPI Supplies/Structure Probe, Inc., #02630-AA), mieszając 22,3 ml GMA, 10 ml n-metakrylanu butylu, 1 ml wody milliQ oraz 0,2 g nadtlenku benzoilu (katalizator). Przechowuj ją w szklanych probówkach (EMS, #72632) i przygotuj 30% GMA, mieszając ją z 95% etanolem. Nie przechowuj podłoży GMA w plastikowych probówkach, ponieważ jakość polimeryzacji pogarsza się podczas długotrwałego przechowywania w tworzywach na bazie polietylenu. Schłodź wstępnie roztwór GMA do -30 °C.
    Tradycyjne żywice epoksydowe, takie jak Araldite i Epon, nie mogą być stosowane w tym protokole, ponieważ są one bezwodne i kwasowe, co powoduje gaszenie białek fluorescencyjnych. Żywice akrylowe, takie jak LR White, tolerują niewielką ilość wody i mogą zachować białko fluorescencyjne, jednak ich kwasowe pH ma tendencję do gaszenia fluoroforu 12. GMA toleruje, a wręcz wymaga, niewielkiej ilości wody i jest zasadowe (pH8)12. GMA jest niestety nieco kruche. Co więcej, GMA nie tworzy wiązań krzyżowych z tkankami w taki sposób, jak tradycyjne żywice epoksydowe. Te cechy GMA powodują niespójność jakości cięcia, zwłaszcza przy przekrojach cieńszych niż 80 nm.
    Choć okres przydatności GMA wynosi około roku, w celu zapewnienia jego jakości należy go użyć w ciągu 3 miesięcy od zakupu.

3. Infiltracja i polimeryzacja

Kroki 3.1-3.3 wykonuje się w tych samych probówkach kriogenicznych, które zostały użyte do substytucji mroźniczej. Infiltrację i polimeryzację przeprowadza się w temperaturze -30 °C w AFS, aby zachować białko fluorescencyjne.

  1. Przygotować media infiltracyjne, mieszając roztwór zapasowy GMA z 95% etanolem. Inkubować preparaty w 30% GMA przez 3-5 h.
  2. Inkubować preparaty w 70% GMA przez 4-6 h.
  3. Inkubować preparaty w 97% GMA przez noc.
  4. Następnego dnia przygotować świeży roztwór 97% GMA.
  5. Przenieść próbki do formy do zatapiania (EBSciences, #TC). Przygotować dysk z folii ACLAR (EMS, #50425-10), używając wycinaka do dysków 3/8" (Ted Pella Inc.), i umieścić dysk na dnie kapsuły BEEM.
  6. Wymienić 97% GMA trzy razy w ciągu 6 h w temperaturze -30 °C.
  7. Po trzeciej wymianie dodać do GMA inicjator N,N-dimetylu-p-toluidynę (Sigma-Aldrich, #D9912) w stężeniu 1,5 μl/1 ml GMA i nanieść ten roztwór do formy każdego preparatu. Natychmiast umieścić preparat w formie do zatapiania w AFS.
    Należy pamiętać, że nadtlenek benzoilu jest katalizatorem i jest obecny podczas wszystkich etapów infiltracji, więc mieszanie nie jest konieczne. Nadtlenek benzoilu nie polimeryzuje tworzywa, dopóki nie zostanie wystawiony na działanie chemicznego inicjatora, N,N-dimetylu-p-toluidyny. Inicjator natychmiast aktywuje polimeryzację i spowoduje polimeryzację żywicy nawet w tkankach w ciągu 1 h. Niemniej jednak w głębokich tkankach mogą wystąpić ubytki wskutek niepełnej polimeryzacji. Ponadto GMA nie wiąże dobrze preparatu z blokiem, dlatego należy oddzielić preparat od krioprotektanta, opukując matrycę bakterii.
    Jeśli polimeryzacja jest przeprowadzana poza AFS, forma do zatapiania musi być przykryta dyskiem z folii aclar, aby zablokować dostęp tlenu. GMA nie polimeryzuje całkowicie w obecności tlenu.
  8. Pozostawić tworzywo do utwardzenia przez noc, mimo że polimeryzacja zachodzi w ciągu 1 h.
  9. Przechowywać preparat w próżniowej torbie (Ziploc) wypełnionej azotem w zamrażarce (-20 °C) do czasu dalszej obróbki, aby białka fluorescencyjne nie były wystawione na działanie tlenu.

4. Krojenie na sekcje

  1. Przygotowywanie seryjnych przekrojów próbek zatopionych w GMA można przeprowadzić w sposób podobny do próbek zatopionych w eponie. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zamoczyć powierzchni cięcia, ponieważ GMA jest bardzo hydrofilowe i w przypadku zwilżenia obu stron wstęgi przekrojów zostaną wciągnięte do kąpieli wodnej.
  2. Wstęgi przekrojów (50-80 nm) należy zbierać na szkiełku podstawowym, jeśli do lokalizacji używany jest mikroskop TIRF. W przeciwnym razie należy użyć siatki przeznaczonej do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Prędkość cięcia powinna zostać ustawiona na 1.6 mm/s lub więcej; w przeciwnym razie wstęga może się nie uformować.
  3. Przekroje należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli nie są obrazowane natychmiast. Należy chronić fluorofory przed światłem UV, zakrywając uchwyty do przekrojów folią aluminiową.

5. Obrazowanie PALM

  1. Przygotować mikroskop PALM zgodnie z zaleceniami producenta. Temperaturę kamery EMCCD należy ustawić na -70 °C lub niżej.
  2. Nanieść cząsteczki złota (#790122-010 - 2x concentrated, microspheres-nanospheres.com) w roztworze (około 50 μl) na próbkę przeznaczoną do obrazowania. Pozostawić roztwór na 30 sekund na szkiełku nakrywce pod czarną osłoną.
  3. Usunąć roztwór złota, przesuwając go do krawędzi szkiełka nakrywki i wchłaniając za pomocą chusteczki kimwipe.
  4. Włożyć szkiełko nakrywkę do okrągłego uchwytu na szkiełka. W razie potrzeby nałożyć smar próżniowy na krawędź, aby utrzymać szkiełko na miejscu.
  5. Nanieść olej immersyjny na spód szkiełka nakrywki, bezpośrednio pod próbki.
  6. Włożyć uchwyt z próbką do gniazda na stoliku mikroskopu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć obiektywów.
  7. Dopasować uchwyt tak, aby był stabilny i centrował przekroje nad obiektywem.
  8. Zlokalizować przekroje, używając obiektywu 10x.
  9. Zmienić obiektyw na 100x.
  10. Ustawić ostrość na preparacie.
  11. Wyznaczyć obszar zainteresowania, obserwując natężenie sygnałów fluorescencji. Użyć lasera 488 nm i zwiększyć intensywność w menu Channels do 10%. Skupić się na obszarach o najsilniejszej fluorescencji. Należy pamiętać, że ten krok nie jest konieczny, jeśli obszar zainteresowania można zidentyfikować gołym okiem w polu jasnym.
  12. Przełączyć laser na 561 nm i zwiększyć intensywność do 100%, aby wybielić tło autofluorescencyjne. Wybielać próbkę przez około 2 min.
  13. Jeśli w trakcie wybielania zmieni się ostrość, odczekać 5 min przed ponownym ustawieniem ostrości i akwizycją obrazów. Przerwa ta pozwala na stabilizację temperatury. Jeśli mikroskop PALM jest wyposażony w komorę inkubacyjną, ustawić temperaturę na 20 °C i odczekać około 2 hr do stabilizacji temperatury w komorze.
  14. Po zakończeniu wybielania aktywować laser 405 nm i ustawić go na najniższą intensywność.
  15. Rozpocząć zbieranie obrazów z prędkością 20 klatek na sekundę. Zazwyczaj zbieramy 5,000-6,000 klatek na eksperyment, jednak liczba klatek powinna być dostosowana do celu badania. Na przykład, jeśli konieczne jest zobrazowanie wszystkich białek w obszarze zainteresowania, należy zwiększyć liczbę klatek.
  16. Jeśli sygnały są rzadkie lub słabe, powoli zwiększać intensywność lasera 405 nm.
  17. Podczas procesu akwizycji należy dbać o utrzymanie ostrości próbek, ostrożnie regulując pokrętło w razie potrzeby.
  18. Po zebraniu obrazów należy przeprowadzić analizę PALM. W przypadku tdEos odfiltrowujemy wszystkie sygnały fluorescujące dłużej niż 500 msec, ponieważ sygnały te prawdopodobnie wynikają z autofluorescencji.

6. Obrazowanie SEM

  1. Przed obrazowaniem SEM należy zabarwić przekroje, używając 2,5% octanu uranylu (w wodzie) przez 4 min. Dokładnie wypłukać octan uranylu filtrowaną wodą milliQ.
  2. Po wyschnięciu przekrojów należy naparować na szkiełko podstawowe warstwę węgla za pomocą naparowarki węglowej, aż szkiełko stanie się dość ciemne. Przykleić jeden koniec przewodzącej taśmy węglowej do krawędzi szkiełka, a drugi do metalowego wspornika, aby uziemić elektrony gromadzące się na powierzchni szkiełka.
  3. Zamocować preparat w komorze SEM (FEI Nova Nano).
  4. Włożyć detektor vCD.
  5. Zamknąć komorę i odpompować powietrze, korzystając z ustawienia wysokiej próżni.
  6. Po wytworzeniu próżni otworzyć zawór kolumny, aby wiązka elektronów trafiła na preparat.
  7. Przeprowadzić rutynowe ustawienie wiązki elektronów.
  8. Zlokalizować preparat.
  9. Po ustawieniu ostrości zablokować stół preparatowy i podnieść go na wysokość 5 mm poniżej elementu biegunowego.
  10. Wykonać obraz preparatu przy niskim powiększeniu (~5 000x).
  11. Przybliżyć obraz do obszaru zainteresowania i uzyskać obrazy przy wysokim powiększeniu (50 000x).
  12. Przejść do następnego przekroju i powtarzać kroki 6.10) oraz 6.11), aż wszystkie przekroje zostaną obrazowane.

7. Dopasowanie obrazów PALM i EM

  1. Otwórz program Photoshop oraz pozyskane obrazy SEM.
  2. Utwórz nowe okno o wymiarach 5 000 x 5 000 pikseli i rozdzielczości 300 pikseli/cal.
  3. Skopiuj obraz SEM o niskim powiększeniu do nowego okna (Rycina 1A).
  4. Przeskaluj obraz tak, aby wypełnił całe okno, korzystając z narzędzia transformacji (Command + T w systemie Mac).
  5. Skopiuj obrazy SEM o wyższym powiększeniu i przeskaluj je w razie potrzeby.
  6. Odbij obraz sumaryczny TIRF w poziomie, wybierając obrót obrazu z rozwijanego paska menu obrazu.
  7. Skopiuj i wklej obraz sumaryczny TIRF (z PALM) do nowej warstwy.
  8. Przeskaluj obraz za pomocą narzędzia transformacji, a następnie obróć go w razie potrzeby, aby dopasować fluorescencję cząsteczek złota (białe strzałki na Rycini 1A) do odpowiadających im struktur zobrazowanych w SEM (Rycina 1B).
  9. Skopiuj obraz PALM do nowej warstwy i zastosuj tę samą transformację (Rycina 1C). Z tego obrazu można wyodrębnić obraz o większym powiększeniu (Rycina 2).
  10. W celu prezentacji skopiuj przetransformowany obraz PALM do nowej warstwy. Wybierz sygnały PALM, pomijając tło, korzystając z funkcji „zakres kolorów” w rozwijanym menu „zaznaczanie”. Pamiętaj, aby wybrać piksel tła jako piksel referencyjny i włączyć opcję „odwróć”.
  11. Wytnij wybrane sygnały PALM i wklej je do nowej warstwy.
  12. Zastosuj przezroczystość do warstwy tła i ustaw ją na 10%. Pozwala to na wizualizację sygnałów PALM poprzez uczynienie tła przezroczystym bez utraty ich intensywności (Rycina 2D).

8. Reprezentatywne wyniki

Histony znakowane tdEos mogą być stabilnie eksponowane w nicieniu C. elegans, a transgeniczne zwierzęta przetworzono zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Mikrografie PALM i elektronowe uzyskano z tego samego przekroju (Rysunek 1). Aby wyrównać obrazy, obraz sumaryczny TIRF, stanowiący sumę fluorescencji z całego przebiegu czasowego, nałożono na mikrograf elektronowy. Nanocząsteczki złota są widoczne zarówno na mikrografach fluorescencyjnych, jak i elektronowych i mogą służyć do wyrównania obu obrazów za pomocą funkcji „transformuj” w programie Photoshop (Rysunek 1A i B). Następnie tę samą wartość „transformuj” zastosowano do obrazu PALM (Rysunek 1C). Przy tym powiększeniu nie można rozróżnić szczegółów strukturalnych, dlatego powiększono obszar w pobliżu górnej krawędzi mikrografu (Rysunek 2). Na obrazie o wysokim powiększeniu można było zaobserwować szczegóły subkomórkowe, takie jak jądro komórkowe, jąderko, pory jądrowe i retikulum endoplazmatyczne. Co więcej, znakowane cząsteczki histonów lokalizują się wyłącznie w jądrze, ale nie w jąderku, zgodnie z oczekiwaniami. Korelatywna mikroskopia PALM i elektronowa pozwala zatem na lokalizację białek z najwyższą rozdzielczością.

Pięć problemów może negatywnie wpływać na jakość obrazów. Po pierwsze, uszkodzenia spowodowane kryształkami lodu mogą zniekształcić ultrastrukturę (Rysunek 3A i B). Umieszczenie preparatów w krioprotektancie, takim jak bakterie, co ogranicza rozprzestrzenianie się kryształków lodu, może zredukować te uszkodzenia. Niemniej jednak, należy nadal weryfikować preparaty za pomocą mikroskopii elektronowej i odrzucać te z artefaktami mrożenia. Po drugie, GMA nie tworzy wiązań sieciujących z tkankami tak jak żywice epoksydowe, przez co preparaty często odrywają się od otaczającego plastiku i rozciągają się, kurczą lub nawet wypadają z przekroju (Rysunek 3C i D). Oddzielenie próbki od bakterii lub innego krioprotektanta przed zatopieniem zapewnia lepszą adhezję plastiku do preparatu (Rysunek 3C). Podobnie struktury takie jak kropelki lipidowe w jelicie często oddzielają się od tkanek z powodu braku sieciowania (Rysunek 3E). Po trzecie, niepełna polimeryzacja plastiku powoduje rozciąganie lub fałdowanie tkanek (Rysunek 3F); obecność tlenu w próbce również utrudnia polimeryzację GMA. Po czwarte, słaba jakość cięcia GMA często skutkuje niespójną morfologią (Rysunek 3G i H). Przekroje GMA powinny być wycinane w grubości 70 nm lub więcej, przy prędkości około 1,6 mm/s, aby zminimalizować artefakty cięcia. Po piąte, nieunikniona jest autofluorescencja tła pochodząca z kurzu na szkiełku nakrywkowym lub przekroju. Autofluorescencję kurzu można zminimalizować, stosując wcześniej oczyszczone szkiełka nakrywkowe oraz unikając zanieczyszczeń pyłem z chusteczek Kimwipes i papieru filtracyjnego, zgodnie z opisem w protokole. Program do analizy PALM pozwala usunąć sygnały z preparatu lub plastiku, które fluorescują dłużej niż typowe sygnały z białek fluorescencyjnych (Rysunek 2 A i B). Końcowy obraz będzie zatem wolny od takich artefaktów.

Porównanie obrazowania komórek: mikrografia elektronowa, sum TIRF, PALM; analiza techniki mikroskopowej.
Rycina 1. Dopasowanie mikrografii fluorescencyjnych i elektronowych przy użyciu nanocząstek złota. (A) Mikrografia elektronowa przy niskim powiększeniu z przekroju C. elegans wykazującego ekspresję znakowanej histony tdEos::HIS-11. Białe strzałki wskazują elektrono-gęste nanocząstki złota o rozmiarze 100 nm, naniesione przed obrazowaniem PALM, które służą jako punkty referencyjne. (B) Złote kule fluorescują po naświetleniu światłem o długości fali ~580 nm i tworzą punkty referencyjne na obrazie fluorescencyjnym. Obraz sum TIRF zostaje dopasowany do mikrografii elektronowej na podstawie położenia punktów referencyjnych. Obraz sum TIRF reprezentuje wszystkie fotony wykryte przez kamerę w czasie trwania eksperymentu. Należy zauważyć, że jasne punkty w lewym górnym rogu (biała strzałka) wynikają z skupisk cząstek złota. (C) Następnie obraz PALM zostaje dodany do mikrografii elektronowej, a następnie obrócony i przesunięty na podstawie wartości wyznaczonych z dopasowania obrazu sum TIRF w punkcie (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Lokalizacja histonów-tdEos z wykorzystaniem mikroskopii TIRF i PALM, ukazująca struktury subkomórkowe.
Rysunek 2. Korelacyjna nano-fEM z wykorzystaniem białek fuzyjnych histonów. (A) Sumaryczny obraz TIRF tdEos::HIS-11 uzyskany z cienkiego przekroju (70nm). (B) Odpowiadający mu obraz PALM tdEos::HIS-11. Autofluorescencja (biała strzałka) trwająca powyżej 500 msec została odfiltrowana przez program PALM. (C) Mikrograf elektronowy jądra komórkowego uzyskany z tego samego przekroju. (D) Korelacyjny obraz PALM i mikrograf elektronowy tdEos::HIS-11. Fluorescencja jest ściśle zlokalizowana w obrębie chromatyny w jądrze.

Obrazy z mikroskopii elektronowej tkanki mięśniowej ukazujące efekty uszkodzeń przez kryształki lodu oraz porównanie jakości cięcia.
Rycina 3. Problemy związane z nano fEM. (A) Mikrograf elektronowy mięśnia ciała C. elegans bez uszkodzeń spowodowanych kryształkami lodu. (B) Mikrograf elektronowy mięśnia ciała z uszkodzeniami spowodowanymi kryształkami lodu. Zamiast wyraźnych przekrojów poprzecznych, filamenty aktyny i miozyny są zapadnięte w agregaty wskutek tworzenia się kryształków lodu. (C, D) Mikrografy elektronowe przy niskim powiększeniu, ukazujące dysocjację nicieni z otaczającego medium. Przekrój jest bardziej zniekształcony w preparacie otoczonym krioprotekcyjnymi bakteriami (D) niż w przypadku preparatu otoczonego plastikiem (C). Bakteryjny krioprotektant w gallette powinien zostać usunięty z utrwalonej próbki przed zatopieniem w plastiku. Należy zauważyć, że zwierzę po prawej stronie w (D) zostało przecięte ukośnie, zatem jego kształt nie wynika ze zniekształcenia tkanek. (E) Mikrograf elektronowy jelita, ukazujący ubytki tkanek (czarne strzałki). (F) Mikrograf elektronowy pierścienia nerwowego, ukazujący zagięcia przekrojów spowodowane niepełną polimeryzacją plastiku (czarne strzałki). (G, H) Mikrografy elektronowe neuronów z tego samego preparatu, przecięte w różnych dniach. Zachowanie tkanek jest doskonałe jednego dnia (G), lecz taka morfologia zostaje przesłonięta przez niespójną jakość cięcia (H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

W niniejszym materiale opisujemy sposób utrwalania białek fluorescencyjnych w tworzywie sztucznym, lokalizacji białek fluorescencyjnych w przekrojach oraz obrazowania ultrastruktury przy użyciu mikroskopii elektronowej. Białka zostały zlokalizowane poniżej limitu dyfrakcyjnego za pomocą mikroskopii PALM z rozdzielczością nanometryczną. Aby dostosować ten protokół do konkretnych preparatów, należy wziąć pod uwagę następujące parametry: fluorofor, kwantyfikację oraz dopasowanie.

Wybór białka fluorescencyjnego lub organicznego fluoroforu zależy od zastosowania i systemu modelowego. Przetestowaliśmy różne białka fluorescencyjne, w tym EGFP, YFP, Citrine, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry oraz Dendra12. Zachowanie fluorescencji każdego z fluoroforów było podobne, co sugeruje, że wszystkie białka fluorescencyjne mogą zostać zachowane przy użyciu opisanego метода. Wybraliśmy tdEos, ponieważ dobrze ulegał ekspresji w C. elegans, białka po fuzji z tdEos zachowywały funkcjonalność, a jego charakterystyka fotoaktywacji była optymalna dla mikroskopii PALM. Jednakże sporadycznie obserwowano agregację lub brak ekspresji tdEos12.

W zależności od zastosowania, lepszym wyborem może być inny fluorofor. W wielu przypadkach nie jest konieczne stosowanie fotoaktywnego białka fluorescencyjnego. Prosta korelacyjna mikroskopia fluorescencyjno-elektronowa nie wymaga użycia fotoaktywnego białka fluorescencyjnego. Do obrazowania fluorescencji białek znakowanych w przekrojach powyżej limitu dyfrakcyjnego można wykorzystać GFP lub barwniki organiczne. Na przykład, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można obrazować akson w neuropilu i korelować sygnał fluorescencji z konkretnym aksonem na mikrografie elektronowym, obrazując fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym. Inne techniki superrozdzielcze, takie jak mikroskopia z deplecją emisji stymulowanej (STED)12, mikroskopia z deplecją stanu podstawowego z następującym po niej powrotem pojedynczej cząsteczki (GSDIM)13 oraz mikroskopia z iluminacją strukturalną (SIM)14, nie wymagają stosowania fotoaktywnych białek fluorescencyjnych. Ponadto z łatwością można zastosować techniki obrazowania superrozdzielczego wykorzystujące barwniki organiczne9,15,16 lub wewnętrzne właściwości sond fluorescencyjnych17.

W metodzie PALM liczba cząsteczek może zostać ilościowo określona, ponieważ fluorescencja każdej cząsteczki jest oddzielona przestrzennie i czasowo. Jednakże kwantyfikacja może być myląca z czterech powodów: utleniania, niedoszacowania, przeszacowania oraz nadekspresji. Po pierwsze, część białek fluorescencyjnych może ulec denaturacji lub utlenieniu podczas przetwarzania próbki5,12. Chociaż w naszym protokole dzięki utrwaleniu i zatopieniu zachowano ~90% sygnału fluorescencji, utlenienie białka fluorescencyjnego może wystąpić po przecięciu preparatu i wystawieniu jego powierzchni na działanie tlenu. Po drugie, aktywacja białek fotoaktywowalnych jest stochastyczna, w związku z czym w danym punkcie ograniczonym dyfrakcyjnie może zostać aktywowanych wiele cząsteczek8. Fluorescencja wielu cząsteczek pojawi się jako jeden punkt, co spowoduje niedoszacowanie całkowitej liczby białek. Po trzecie, podobny problem może prowadzić do przeszacowania. W metodzie PALM każde białko fluorescencyjne jest lokalizowane, a następnie „usuwane” poprzez wygaszanie. Jednakże białka fluorescencyjne mogą powrócić ze stanu ciemnego bez trwałego wygaszenia18. Takie cząsteczki zostaną wówczas policzone wielokrotnie. Po czwarte, białka znakowane są ekspresowane jako transgeny i często występują w wielu kopiach, co może prowadzić do nadekspresji. Zatem kwantyfikacja z PALM może służyć do szacowania, ale nie do precyzyjnego określania liczby cząsteczek w danej lokalizacji.

Dopasowanie obrazu PALM do mikrografii elektronowej może być również trudne ze względu na różnice w rozdzielczości mikroskopii świetlnej i elektronowej oraz zniekształcenia wywołane wiązką elektronów. Cząsteczki złota służą jako precyzyjnie zlokalizowane markery fiducjalne w mikrografią elektronowych. Jednak fluorescencja cząsteczek złota nie jest fotoaktywowana i przejawia się jako duża plamka ograniczona dyfrakcyjnie. W związku z tym nałożenie obrazu fluorescencyjnego na mikrografię elektronową jest jedynie szacunkowe. Zniekształcenia mogą również wynikać z oddziaływań elektronów z plastikowym przekrojem. Żywice akrylowe, takie jak GMA, są mniej stabilne pod wpływem wiązki elektronów, co może prowadzić do zmian wymiarów plastiku. W takich okolicznościach dopasowanie fluorescencji do ultrastruktury może wymagać nieliniowej transformacji markerów fiducjalnych.

Oświadczenia

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Carl Zeiss, Inc.

Podziękowania

Dziękujemy Haraldowi Hessowi i Ericowi Betzigowi za udostępnienie mikroskopu PALM do eksperymentów potwierdzających zasadę działania, a Richardowi Fetterowi za udostępnienie protokołów fiksacji, odczynników oraz wsparcie. Dziękujemy Michaelowi Davidsonowi, Geraldine Seydoux, Stefanowi Eimerowi, Rudolfowi Leube, Keithowi Nehrke, Christianowi Frøkjr-Jensenowi, Aude Ada-Nguema i Marcowi Hammarlundowi za konstrukty DNA. Dziękujemy również firmie Carl Zeiss Inc. za umożliwienie dostępu do Zeiss PAL-M, wersji beta mikroskopu Zeiss Elyra P.1 PALM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mrożarka wysokociśnieniowaABRAHPM 010Można również używać EMPact i HPM 100 firmy Leica lub hpf-01 firmy Wohlwend.
Automatyczna jednostka do substytucji zamrażaniaLeica MicrosystemsAFS 2Można również używać AFS 1.
Zeiss PALMfigure-materials-1 Carl Zeiss, Inc.ELYRA P.1Nikon i Vutara sprzedają również komercyjne mikroskopy PALM.
Skaningowy mikroskop elektronowyFEINova nanoMożna używać innych wysokorozdzielczych mikroskopów SEM.
AcetonEMSRT10016
EtanolSigma-Aldrich459844-1L
Tetroksyd osmuEMSRT19134
Permanganian potasuEMSRT20200
Albumina z surowicy bydlęcejSigma-AldrichA3059-50G
Octan uranyluPolysciences, Inc.21447-25pH octanu uranylu z tej firmy jest nieco wyższe.
Glikol metakrylanowy (GMA)SPI Supplies02630-AANiska kwasowość, stopień TEM.
N,N-dimetylo-p-toluidynaSigma-AldrichD9912
Probówki kriogeniczneNalge Nunc international5000-0020
Fiolki szklaneEMS72632
Folia AclarEMS50425-10
Kapsułka BEEMEBSciencesTCPolipropylen
Wykrojniki DISC 3/8"Ted Pella, Inc.54741
Nanocząsteczki złotamicrospheres-nanospheres.com790122-010Zamówić roztwór 2x skoncentrowany

Bibliografia

  1. Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
  2. Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24(2010).
  3. Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
  4. Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
  5. Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  6. Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
  7. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
  8. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  10. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  11. Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
  12. Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
  14. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
  15. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
  16. Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
  17. Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
  18. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Z ote nanocz stki jako markery referencyjneultra cienkie ci cieobrazowanie PALMskaningowa mikroskopia elektronowakorelacyjne obrazowanie fluorescencyjne i elektronowebia ka z tagiem TDEos histon w

Powiązane artykuły