W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ważną drogą do zrozumienia mechanizmów funkcjonowania białek jest poznanie struktury białka docelowego, idealnie w rozdzielczości atomowej. Obecnie istnieje tylko jedna metoda pozyskiwania takich informacji w odniesieniu do białek błonowych integralnych (Rycina 1) oraz tworzonych przez nie kompleksów, a jest nią makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Do przeprowadzenia MX niezbędne są kryształy o jakości dyfrakcyjnej, które w przypadku białek błonowych nie tworzą się łatwo. Metoda krystalizacji białek błonowych wykorzystująca mezofazy lipidowe, a konkretnie fazy kubiczne i gąbczaste1-5, zyskała ostatnio znaczną uwagę dzięki sukcesom osiągniętym w dziedzinie receptorów sprzężonych z białkiem G6-21 (www.mpdb.tcd.ie). Jednakże metoda ta, zwana odtąd metodą in meso lub metodą lipidowej fazy kubicznej, wiąże się z własnymi wyzwaniami technicznymi. Wynikają one częściowo z ogólnie lepkej i gęstej natury mezofazy lipidowej, w której rosną kryształy, często będące mikrokryształami. W konsekwencji manipulowanie kryształami staje się trudne, zwłaszcza podczas ich zbioru22,23. Problemy pojawiają się również na etapie poprzedzającym zbiór, który wymaga otwarcia szklanych płytek typu sandwich, w których rosną kryształy (Rycina 2)24,25, aby odsłonić bolus mezofazy oraz zawarte w nim kryształy w celu ich zbioru, schłodzenia kriogenicznego i ostatecznego zebrania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich.
Warianty mezofazy sześcianowej i gąbczastej (Rycina 3), z których należy pozyskiwać kryształy, charakteryzują się skrajnie różną reologią4,26. Faza sześcianowa jest lepka i gęsta, przypominając konsystencją gęstą pastę do zębów. Z kolei faza gąbczasta jest bardziej płynna i wykazuje wyraźną tendencję do przepływu. W związku z tym konieczne jest zastosowanie różnych podejść do otwierania studni krystalizacyjnych zawierających kryształy rosnące w fazie sześcianowej i gąbczastej, podobnie jak wymagane są odmienne metody pozyskiwania kryształów z obu tych typów mezofaz. Protokoły służące do realizacji tych zadań zostały dopracowane i wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran (MS&FB) i są szczegółowo opisane w niniejszym artykule JoVE (Rycina 4). Przedstawiono przykłady sytuacji, w których kryształy zostały pomyślnie pozyskane i schłodzone kriogenicznie. Podajemy również przykłady przypadków, w których wystąpiły problemy prowadzące do nieodwracalnej utraty kryształów, oraz opisujemy, jak można uniknąć tych błędów. W artykule tym Widz otrzyma instrukcje krok po kroku dotyczące otwierania szklanych studni krystalizacyjnych typu kanapkowego, pozyskiwania oraz chłodzenia kriogenicznego kryształów białek błonowych rosnących w fazach sześcianowej i gąbczastej.
Protokół
1. Przygotowanie laboratorium przed zbiorem
- W ramach przygotowań do zbioru wypełnij suchy naczynie Dewar z pianki ciekłym azotem i ustaw je obok mikroskopu, przy którym będzie odbywał się zbiór.
- Zanurz kasetę do przechowywania otwartym końcem do góry w ciekłym azocie w naczyniu Dewar z pianki i poczekaj do jej całkowitego schłodzenia.
- Zamocuj mikromont o rozmiarze dopasowanym do kryształu przeznaczonego do zbioru na magnetycznym pręcie (Rysunek 5). Ważne jest, aby mieć pod ręką kilka zapasowych prętów magnetycznych z założonymi mikromontami na wypadek konieczności zebrania kilku kryształów z jednego bolusa. Zapasowe pręty powinny być dostępne przez cały czas.
- Obok mikroskopu do zbioru umieść mikropipetę, końcówki oraz roztwór precypitantu użyty do wzrostu kryształów. Może być on potrzebny do pokrycia mezofazy i zapobiegania wysychaniu po otwarciu dołka.
- Przygotuj na blacie w pobliżu notes i długopis i/lub otwórz komputer. Będą one służyć do zapisywania obserwacji dotyczących jakości, wyglądu, lokalizacji, numeru kasety do przechowywania itp. kryształów w miarę ich zbierania, chłodzenia kriogenicznego i umieszczania w magazynie.
- Jeśli dostępny jest asystent pomagający w zbiorze, osoba ta musi jasno rozumieć stosowany protokół, kolejność poszczególnych kroków oraz swoją rolę w całym procesie.
Po przygotowaniu wszystkich materiałów i sprzętu naszym następnym zadaniem jest:
2. Identyfikacja płytek i studzienek zawierających kryształy
- Najprostszym i najbardziej bezpośrednim sposobem znalezienia kryształów nadających się do zbioru jest ręczna inspekcja dołków przy użyciu mikroskopu w świetle normalnym oraz w skrzyżowanych polaryzatorach. Regulacja natężenia światła oświetlającego w mikroskopie może pomóc w zlokalizowaniu kryształów.
- Alternatywnie do poszukiwania kryształów można wykorzystać system obrazowania, w którym płytki są przesiewane automatycznie w świetle normalnym i w skrzyżowanych polaryzatorach.
- Dokonać wizualnej oceny zapisanych obrazów cyfrowych na monitorze komputera.
- Wyraźnie zaznaczyć dołki zawierające kryształy przeznaczone do zbioru oraz zapisać w notatniku lub w komputerze uwagi dotyczące wielkości, jakości i położenia kryształów w mezofazie.
- Wyjąć z urządzenia obrazującego płytkę zawierającą kryształy przeznaczone do zbioru.
3. Otwieranie studni z mezofazą kubiczną. Metoda 1
Płytki, w których kryształy rosną metodą in meso, są szklanymi płytkami kanapkowymi (Rysunek 2). Aby uzyskać dostęp do mezofazy i znajdujących się w niej kryształów, konieczne jest otwarcie studzienki. Odbywa się to poprzez przecięcie narzędziem do cięcia szkła górnego szkiełka zakrywającego, które uszczelnia studzienkę, a następnie jego usunięcie.
Istnieje kilka podejść do wycinania i usuwania szkiełka podstawowego z otworu krystalizacyjnego. Wybór metody zależy od rodzaju mezofazy, w której rośnie kryształ. Może to być bardzo lepka i ciągliwa faza sześcienna (Ryc. 3A) lub jej bardziej płynny wariant, faza gąbczasta (Ryc. 3B). W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak otwierać otwory i pozyskiwać kryształy z obu tych materiałów gospodarzy.
- Umieść szklaną płytkę krystalizacyjną typu „sandwich” na stoliku mikroskopu świetlnego.
- Za pomocą narzędzia do cięcia szkła lekko nacinaj szkiełko nakrywkę, tworząc dwa koncentryczne okręgi znajdujące się nad dystansem i tuż poza obrysem studzienki. W przypadku nowego narzędzia nacinanie wymaga minimalnego nacisku. Wymień narzędzie na nowe, gdy wymagany nacisk wzrośnie choćby nieznacznie; dzieje się to zazwyczaj po otwarciu 10 studzienek.
- Rozkrusz szkło w przestrzeni między dwoma naciętymi okręgami w celu uwolnienia wewnętrznego szkiełka nakrywki. Powoduje to powstanie wielu odłamków i pyłu szklanego. Usuń je za pomocą zwilżonego ręcznika papierowego.
- Usuń uwolnione szkiełko nakrywkę, chwytając je pęsetą z cienkimi końcówkami i odchylając od studzienki, aż całkowicie z niej zsunie. W ten sposób faza kubiczna pozostaje przytwierdzona do płytki podstawy studzienki.
- Zwiększ powiększenie, aby uzyskać wyraźniejszy obraz kubicznej mezofazy, która jest teraz gotowa do zbioru kryształów.
4. Otwieranie studni z mezofazą kubiczną. Metoda 2
- Za pomocą narzędzia do cięcia szkła nacinamy proste, równoległe linie w szkiełku nakrywkowym po jednej stronie studzienki, tak aby linie te przechodziły przez samą studzienkę. Umożliwia to łatwiejszy dostęp pęsetą do szkiełka nakrywkowego i jego usunięcie.
W tej konkretnej demonstracji szkiełko zakrywa pęka podczas oddzielania go od lepkiej powierzchni dystansera. W tym procesie szkiełko przesuwa się, a precypitant oddziela się od fazy kubicznej. Podczas podnoszenia szkiełka część precypitantu zostaje wraz z nim usunięta. Pozostaje odsłonięta grudka mezofazy bez otaczającego ją precypitantu. Należy niezwłocznie dodać za pomocą mikropipety 1 μl świeżego precypitantu na wierzch grudki, aby zapobiec wysychaniu mezofazy i zmianie fazy, która mogłaby uszkodzić kryształy. Grudka jest teraz gotowa do wykorzystania w procesie zbioru kryształów.
5. Otwieranie studni z fazą gąbczastą. Niepowodzenie
Faza gąbczasta jest trudniejsza w obróbce ze względu na jej zdolność do płynięcia. Jeśli w wyniku tego przepływu faza gąbczasta zetknie się z obwodem studzienki, zjawisko kapilarności spowoduje wyprowadzenie mezofazy na zewnątrz, co doprowadzi do utraty kryształów. Przykład takiego zdarzenia pokazano w tym fragmencie wideo.
- Przybliż obraz fazy gąbczastej i przełączaj się między światłem naturalnym a spolaryzowanym w świetle skrzyżowanym, aby zlokalizować kryształy w fazie gąbczastej.
- W ramach przygotowań do otwarcia studzienki, nacinaj i utnij szkiełko nakrywkę zgodnie z opisem w sekcji 3. W trakcie tego procesu szkiełko nakrywkowe pęka. Podczas próby otwarcia studzienki precypitant przemieszcza się w kierunku pęknięcia i ostatecznie styka się z dystansem. Wraz z precypitantem przemieszcza się część fazy gąbczastej oraz zawarte w niej kryształy, które ulegają utraceniu.
W tej konkretnej sekwencji polaryzatory w mikroskopie nie są całkowicie skrzyżowane, dzięki czemu kryształy są widoczne jako jasne obiekty, podczas gdy studzienka i jej zawartość pozostają widoczne.
6. Prawidłowe otwarcie studzienki z fazą gąbczastą
- Przybliżyć obraz fazy gąbczastej i zidentyfikować kryształ zarówno w świetle normalnym, jak i w świetle spolaryzowanym z krzyżnymi polaryzatorami.
- Naciąć, odciąć i usunąć fragment szkiełka nakrywkowego zakrywającego dołek, zgodnie z opisem w Sekcji 4.1. Do śledzenia kryształu należy używać niepełnie skrzyżowanych polaryzatorów.
- Wprowadzić kawałek suchego papieru chłonnego przez otwór w szkiełku nakrywkowym do wnętrza dołka, aż dotknie on roztworu precypitanta. Ostrożnie odsączyć roztwór, aż niemal całkowicie zniknie, a następnie usunąć papier. Spowoduje to cofnięcie się pozostałego precypitanta i fazy gąbczastej wraz z kryształem pod szkiełko nakrywkowe.
- Naciąć, odciąć i usunąć pęsetą resztę szkiełka nakrywkowego, zgodnie z opisem w Sekcji 4.1. W tym przypadku faza gąbczasta ulega rozdzieleniu; część pozostaje w dołku, a część przylega do szkiełka nakrywkowego. Kryształ znajduje się w grudce na szkiełku. Ze względu na bardzo małą ilość obecnego precypitanta, faza gąbczasta zaczyna przechodzić przejście fazowe, prawdopodobnie na skutek wysychania. Jest to widoczne jako pierścień dwójłomności przemieszczający się w stronę centrum grudki. Natychmiast dodać precypitant do grudki, aby zatrzymać to przejście. Grudka jest teraz gotowa do użycia w procesie pozyskiwania kryształów.
7. Zbiór i schładzanie kryształów z fazy sześciennej w temperaturach kriogenicznych
- Przełączaj się między normalnym a skrzyżowanym światłem spolaryzowanym, aby zlokalizować kryształy w kropelce fazy kubicznej w otwartym dołku. W tej sekwencji wideo w kropelce fazy kubicznej przy skrzyżowanym świetle spolaryzowanym można zauważyć do czterech kryształów dwójłomnych.
- Użyj zamontowanej pętli kriogenicznej (Rycina 5), aby przeszukać świeżo odsłoniętą mezofazę w poszukiwaniu kryształów, wyłowić je, a następnie natychmiast po pobraniu zanurzyć je wraz z pętlą w ciekłym azocie w naczyniu Dewara. Idealnie, pobranie i gwałtowne schładzanie powinny odbyć się w jednym, ciągłym i szybkim ruchu. Wraz z kryształem powinno zostać pobrane jak najmniej przylegającej mezofazy. W naszym doświadczeniu w przypadku kryształów hodowanych in meso nie jest wymagany krioprotektant.
- Ponieważ nie jest możliwe sprawdzenie obecności kryształu w pętli kriogenicznej bezpośrednio po pobraniu, obejrzyj kropelkę mezofazy użytą do pobrania, aby zweryfikować, czy kryształ już w niej nie występuje, co sugeruje pomyślne pobranie.
8. Zbiór i kriochłodzenie kryształów z fazy gąbczastej
- Przełączaj się między zwykłym a skrzyżowanym światłem spolaryzowanym, aby zlokalizować kryształy w kuleczce fazy gąbczastej w otwartym dołku. W tej sekwencji wideo w kuleczce pod skrzyżowanym światłem spolaryzowanym widocznych jest wiele kryształów dwójłomnych.
- Użyj zamocowanej pętelki kriogenicznej (Rysunek 5), aby wyłowić kryształy z fazy gąbczastej i natychmiast po ich pobraniu zanurzyć je, wraz z pętelką, w ciekłym azocie w naczyniu Dewara. Podobnie jak przy pobieraniu z fazy kubicznej, proces schładzania kriogenicznego powinien odbyć się idealnie w momencie wyłowienia kryształu, tak aby czas między samym pobraniem a zanurzeniem w ciekłym azocie był jak najkrótszy. Należy pobrać kryształ wraz z jak najmniejszą ilością przylegającej fazy gąbczastej. Jak wspomniano, w przypadku kryształów hodowanych in meso nie jest wymagany krioprotektant.
9. Przechowywanie kryształów w naczyniach Dewara
- Po zanurzeniu zamontowanej pętli w ciekłym azocie, umieść ją w jednym z gniazd uchwytu w dysku magazynowym w piankowym naczyniu Dewara. Wszystkie manipulacje wykonuje się tak, aby pętla, górna część magnetycznego pręta oraz dysk pozostawały zanurzone w ciekłym azocie.
- Zapisz w notesie i/lub w komputerze lokalizację oraz szczegóły dotyczące pobranego i schłodzonego kriogenicznie kryształu.
- Gdy dysk w piankowym naczyniu Dewara zostanie zapełniony lub gdy zakończone zostanie pobieranie kryształów na dany dzień, przenieś dysk do wielopoziomowego uchwytu w naczyniu Dewara do przechowywania lub transportu wypełnionym ciekłym azotem. Kryształy mogą być transportowane w naczyniach Dewara do ośrodka synchrotronowego w celu przeprowadzenia pomiarów dyfrakcyjnych.
10. Reprezentatywne wyniki
Celem zaprezentowanych tutaj ćwiczeń z zakresu pobierania i chłodzenia kriogenicznego jest przeniesienie kryształu z otaczającej go mezofazy do pętli kriogenicznych, witryfikacja kryształu w pętli oraz umieszczenie go w ciekłym azocie w naczyniu typu Dewar. Sytuacją idealną jest przeprowadzenie pobierania i chłodzenia kriogenicznego w taki sposób, aby w procesie tym zachowana została jakość dyfrakcyjna kryształu. Wraz z kryształem należy pobrać jak najmniej mezofazy. Ma to na celu ułatwienie lokalizacji kryształu i jego centrowania w wiązce promieni rentgenowskich, przyspieszenie chłodzenia kriogenicznego w celu witryfikacji oraz zminimalizowanie zakłócającego rozproszenia tła pochodzącego z mezofazy podczas zbierania danych dyfrakcyjnych. Przykłady próbek chłodzonych kriogenicznie, na których kryształ jest widoczny lub niewidoczny, przedstawiono na Rysunku 6. W przypadkach, gdy kryształ nie jest widoczny gołym okiem, zazwyczaj konieczne jest zastosowanie skanowania dyfrakcyjnego (rastering), aby zlokalizować kryształ i wycentrować go w wiązce w celu zbierania danych27.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie błony biologicznej ukazujący dwuwarstwę lipidową, w której i na której znajdują się różne białka.
Rycina 2. W pełni wypełniona i zamknięta szklana płytka krystalizacyjna typu sandwich z 96 dołkami. Każdy dołek zawiera 50 nl fazy kubicznej i 1 μl roztworu precypitantu. Dla przejrzystości faza kubiczna została zabarwiona czerwienią Sudanu, a roztwór precypitantu zawiera błękit metylenowy. Z referencji 5.
Rycina 3. Kryształy białek błonowych rosnące w lipidowej mezofazie. A. Faza sześcienna z kryształem bakteriorodopsyny z H. halobium. B. Faza gąbczasta zawierająca kryształ receptora/transportera witaminy B12, BtuB, z E. coli. Z odniesienia 25. Fazy sześcienna i gąbczasta mają odmienny wygląd, co jest oczywiste po porównaniu paneli A i B. Faza sześcienna w A jest niezwykle lepka i zachowuje swój pierwotny kształt. Nie przepływa. Jest to szczególnie widoczne na krawędziach kropelki mezofazy, które mają chropowaty wygląd. W przeciwieństwie do niej, faza gąbczasta jest znacznie mniej lepka i wykazuje zdolność do przepływu. W związku z tym faza gąbczasta nie zachowuje swojego pierwotnego kształtu, a jej krawędzie są charakterystycznie gładkie. Precypitanty zawierające Jeffamine, PEG 400, 2-metylo-2,4-pentandiol, propoksylan pentaerytrytolu, butandiol i heksandiol mogą prowadzić do przejścia z fazy sześciennej w fazę gąbczastą4,26.
Rysunek 4. Schemat blokowy podsumowuje kroki zaangażowane w produkcję, pozyskiwanie i chłodzenie kriogeniczne kryształów białek błonowych hodowanych in meso (A). W niniejszym artykule JoVE omówiono jedynie kroki otoczone czerwoną przerywaną linią, opisane szczegółowo w części (B). Panel A pochodzi z publikacji 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rycina 5. Pusta pętla kriogeniczna zamocowana na pinie, który jest utrzymywany w miejscu przez magnetyczny uchwyt. Przedstawiono powiększone widoki pinu (A) oraz mikromocowania (B) tego istotnego narzędzia służącego do pobierania próbek i ich schładzania kriogenicznego. Pusta pętla na końcu mikromocowania na obrazie B ma średnicę 30 μm. Choć nie testowaliśmy szeroko innych typów pętli, stwierdzono, że pokazane pętle MiTeGen sprawdzają się dobrze zarówno w fazach sześciennych, jak i gąbczastych.
Rycina 6. Zebrane i schłodzone kriogenicznie kryształy białek błonowych w pętlach kriogenicznych, widziane za pomocą mikroskopu w linii na wiązce synchrotronowej. A, B. Przykłady zebranych kryształów (cytochrom oksydaza caa334 (A), kinaza diacyloglicerylowa, DgkA (B)), w których kryształy (niebieska strzałka) są widoczne przez schłodzoną kriogenicznie mezofazę na pętli kriogenicznej. C. Przykład, w którym zebrany kryształ nie jest widoczny w schłodzonej kriogenicznie mezofazie na pętli kriogenicznej. Końcówkę pętli oznaczono czerwoną strzałką. Przylegającą, schłodzoną kriogenicznie mezofazę oznaczono niebieską strzałką.
Dyskusja
W niniejszym artykule wideo zademonstrowaliśmy, w jaki sposób kryształy wyhodowane w mezofazie lipidowej są zbierane i chłodzone kriogenicznie w celu przygotowania ich do gromadzenia danych dyfrakcyjnych, a w konsekwencji do wyznaczenia struktury. Mezofaza gospodarza może być lepka i kleista faza kubiczna lub bardziej płynna faza gąbczasta4. Sposób otwierania szklanych płytek typu „sandwich” oraz metoda zbierania kryształów zależą w dużej mierze od rodzaju mezofazy. Dlatego ważne jest, aby z wyprzedzeniem wiedzieć, z którą z tych dwóch faz mamy do czynienia. W tym względzie istotne są tożsamość zastosowanego lipidu gospodarza oraz czynnika wytrącającego, a do ich rozróżnienia można wykorzystać wygląd fizyczny grudki mezofazy w studzience krystalizacyjnej (Rycina 3). W niniejszym artykule zilustrowano proces zbierania kryształów z obu typów mezofaz.
Wyodrębnianie małych kryształów z mezofazy lipidowej w szklanych płytkach kanapkowych jest żmudnym procesem, który wymaga czasu, umiejętności, doświadczenia, cierpliwości i pewnej ręki. Ważne jest, aby zarezerwować odpowiednią ilość czasu na wyodrębnianie oraz przygotować laboratorium w taki sposób, aby wszystkie materiały i sprzęt były z wyprzedzeniem pod ręką. Pomoc drugiej osoby przy wyodrębnianiu nie jest niezbędna, ale jest zalecana. Taka osoba może pomagać w podawaniu wcześniej oznakowanych płytek osobie dokonującej wyodrębniania, a także w umieszczaniu schłodzonych pętli montażowych z wyodrębnionymi kryształami w kasecie do przechowywania. Asystent może również pełnić ważną rolę wspierającą w dokumentowaniu obserwacji dotyczących kryształów sporządzonych podczas wyodrębniania, które mogą okazać się kluczowe podczas zbierania danych dyfrakcyjnych. W przypadku braku asystenta, do celów dokumentacji można z korzyścią wykorzystać urządzenie do nagrywania audio aktywowane głosem.
Postępowanie zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule pomoże użytkownikowi rozpocząć pracę z procesem pozyskiwania kryształów. Należy jednak mieć świadomość, że proces ten nie jest prosty i wymaga praktyki przed przystąpieniem do pozyskiwania cennych kryształów białek błonowych. Zaleca się zatem, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić doświadczenia na płytkach testowych z kryształami białek, które nie są szczególnie wartościowe. Pozwoli to początkującemu nabyć cenne doświadczenie w cięciu szkła, usuwaniu odłamków szklanych, podnoszeniu szkiełka nakrywkowego znad mezofazy, wykorzystywaniu funkcji polaryzacji w mikroskopie do lokalizacji kryształów i śledzenia ich podczas pozyskiwania, a na koniec w obchodzeniu się z różnymi rodzajami mezofaz i pozyskiwaniu z nich kryształów. Tekstura mezofazy, a co za tym idzie łatwość, z jaką można pozyskać kryształy, zmienia się w czasie trwania krystalizacji. Ważne jest zatem, aby ćwiczyć pozyskiwanie na mniej cennych kryształach, lecz takich, które wyrosły w tych samych warunkach co kryształy bardziej wartościowe. Możliwe jest otrzymanie kryształów lysozymu i taumatyny metodą in meso lub metodą lipidowej fazy kubicznej28, co należy rozważyć w celu zapoznania się z materiałami i metodą. Warto również najpierw popracować z mezofazą wolną od białek, aby poznać jej specyfikę.
Procedury zaprezentowane w niniejszym materiale zostały przeprowadzone w temperaturze około 20 °C. Możliwe jest otrzymywanie kryształów metodą in meso w niższych temperaturach. Przykładowo, jako lipid gospodarz w metastabilnym stanie fazowym można zastosować monooleinę w temperaturze 4 °C 1,2,29,30. Alternatywą jest wykorzystanie racjonalnie zaprojektowanego 7.9 MAG do krystalizacji w niskiej temperaturze31. W przypadku niektórych docelowych białek błonowych rutynowo przeprowadzamy krystalogenezę w niskich temperaturach. W takim przypadku wzrost i zbiór kryształów odbywa się w chłodni w temperaturze 4 °C. Praca w takich warunkach wiąże się z określonymi wyzwaniami, z których nie mniej istotnym jest konieczność noszenia ciepłej i wygodnej odzieży.
Kolejnym krokiem w ogólnym procesie wyznaczania struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej jest zebranie danych dyfrakcyjnych z kryształów, które zostały pobrane i gwałtownie schłodzone w sposób przedstawiony w niniejszym artykule. Kryształy hodowane in meso są zazwyczaj małe. Niemniej jednak, możliwe było użyteczne gromadzenie danych dyfrakcyjnych z kryształów o maksymalnym wymiarze 20 μm9. W tym celu wykorzystuje się mikro-wiązki promieniowania rentgenowskiego synchrotronowego, co jest przedmiotem osobnego artykułu JoVE w tej serii32,33.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wiele osób przyczyniło się do powstania tej pracy, z czego większość to byli i obecni członkowie grupy Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group. Wszystkim, a w szczególności Jingquan Tan i Joseph Lyons, składamy najserdeczniejsze podziękowania i wyrazy uznania. Praca ta była częściowo finansowana z grantów Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 oraz U54GM094599) oraz FP7 COST i Marie Curie Actions (CM0902 oraz PIEF-GA-2009-235612).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pinceta zakrzywiona | Sigma | F4142 | Narzędzie |
| Jednorazowe końcówki do pipet | Gilson | Różne | Jednorazowe |
| Pojemnik Dewar z pianki | Spearlab | FD-500 | Narzędzie |
| Pojemniki na odpady szklane i metalowe | Daniels Healthcare | DD479OL | Narzędzie |
| Pętle do zbierania kryształów | MiTeGen | Różne | Narzędzie |
| Mikroskop do zbierania kryształów | Nikon | SMZ1500 | Narzędzie |
| Notatnik laboratoryjny | Różne | NA | Narzędzie |
| Magnetyczny pręt do załadunku próbek z przyciskiem | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Narzędzie |
| Oryginalny Puck (do użytku wyłącznie z robotami typu ALS) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Narzędzie |
| Urządzenia pipetujące | Gilson | Różne | Narzędzie |
| Roztwory precypitantów | Różne | Różne | Odczynnik |
| Zgięte kleszcze kriogeniczne do Pucków | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Narzędzie |
| Pręt transportowy z półkami do Pucków (oryginalny typ ALS) z hakiem i blokadą | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Narzędzie |
| Woda oczyszczona | Millipore | Odczynnik | |
| Okulary ochronne | Różne | NA | Narzędzie |
| Podstawy pinów do próbek – magnetyczne (niemiedziane) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Narzędzie |
| Pojemnik Dewar do transportu | Taylor-wharton | CX100 | Narzędzie |
| Chusteczki | NA | NA | Jednorazowe |
| Węglikowo-wolframowy przecinak do szkła (rylec TCT) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Narzędzie |
Bibliografia
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes. Biochemistry. , Forthcoming (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. Science. 330, 1091-1095 (2010).
- Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 485, 400-404 (2012).
- Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547-551 (2012).
- Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335, 851-855 (2012).
- Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist. Science. 322, 1211-1217 (2008).
- Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature. 482, 552-556 (2012).
- Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485, 321-326 (2012).
- Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469, 175-180 (2011).
- Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science. 318, 1266-1273 (2007).
- Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex. Nature. 469, 236-240 (2011).
- Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature. 475, 65-70 (2011).
- Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature. 485, 395-399 (2012).
- Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic. Nature. 485, 327-332 (2012).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).
- Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization. Structure. 16, 1003-1009 (2008).
- Cherezov, V. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron. 6, 587-597 (2009).
- Caffrey, M. A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).
- Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system. J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. Rational design of lipid for membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).
- Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. , e1712(2010).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase. J. Vis. Exp. , e4000(2012).
- Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase. Nature. 10, (2012).
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
