Artykuł metodologiczny

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4003

⸱

29 listopada 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dorris Neuroscience Center & Department of Cell Biology, The Scripps Research Institute , 2Mouse Genetics Core Facility, The Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Streszczenie

Produkcja indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) z komórek somatycznych umożliwia tworzenie cennych narzędzi do badań podstawowych, a także może dostarczyć źródła komórek dopasowanych do pacjenta w terapiach regeneracyjnych. Komórki iPSCs mogą być generowane przy użyciu wielu protokołów i pochodzić z różnych źródeł komórkowych. Po wygenerowaniu iPSCs są testowane za pomocą szeregu analiz, w tym immunobarwienia na markery pluripotencji, generowanie trzech warstw zarodkowych w ciałach embrionalnych i teratomałach, porównywanie ekspresji genów z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESCs) oraz tworzenie myszy chimerycznych z wkładem linii zarodkowej lub bez niego2. Co istotne, linie iPSC, które przechodzą te testy, nadal różnią się zdolnością do wytwarzania różnych typów zróżnicowanych komórek2. Utrudnia to ustalenie, które protokoły wyprowadzania iPSC, źródła komórek dawców lub metody selekcji są najbardziej użyteczne w różnych zastosowaniach.

Najbardziej rygorystycznym testem sprawdzającym, czy linia komórek macierzystych posiada wystarczający potencjał rozwojowy do wytworzenia wszystkich tkanek niezbędnych do przeżycia organizmu (tzw. pełną pluripotencję), jest komplementacja embrionów tetraploidalnych (TEC)3-5. Technicznie TEC polega na elektrofuzyjnym połączeniu embrionów dwukomórkowych w celu uzyskania tetraploidalnych (4n) embrionów jednokomórkowych, które można hodować in vitro do stadium blastocysty6. Następnie diploidalne (2n) pluripotencjalne komórki macierzyste (np. ESC lub iPSC) wstrzykuje się do jamki zarodkowej blastocysty tetraploidalnej, a następnie przenosi do samicy biorcy w celu inkubacji (patrz Rysunek 1). Składnik tetraploidalny komplementowanego embrionu przyczynia się niemal wyłącznie do powstania tkanek pozazarodkowych (łożyska, pęcherzyka żółtkowego), podczas gdy komórki diploidalne tworzą właściwy zarodek, w wyniku czego powstaje płód pochodzący w całości z wstrzykniętej linii komórek macierzystych.

Niedawno donieśliśmy o wyprowadzeniu linii iPSC, które powtarzalnie generują dorosłe myszy poprzez TEC1. Linie iPSC te dają początek żywym młodszym z wydajnością 5-13%, co jest porównywalne z ESC3,4,7 i wyższe niż wartości raportowane dla większości innych linii iPSC8-12. Raporty te pokazują, że bezpośrednie przeprogramowanie może prowadzić do powstania w pełni pluripotencjalnych iPSC, które dorównują ESC pod względem potencjału rozwojowego i wydajności generowania młodych w testach TEC. Obecnie nie jest jasne, co odróżnia w pełni pluripotencjalne iPSC od linii o mniejszej potencjalności13-15. Nie jest również jasne, które metody przeprogramowania pozwolą na otrzymanie tych linii z najwyższą wydajnością. W niniejszej pracy opisujemy jedną z metod pozwalającą na otrzymanie w pełni pluripotencjalnych iPSC oraz myszy „all-iPSC”, co może być pomocne dla badaczy pragnących porównać pluripotencjalność linii iPSC lub ustalić równoważność różnych metod przeprogramowania.

Protokół

Metoda ta została zastosowana w badaniach opisanych w pracy Boland et al. Nature 461, 91-96 (2009).1

1. Przygotowanie lentiwirusa

Niniejszy protokół wykorzystuje indukowalne doksycykliną lentiwirusowe wektory transmisyjne kodujące Oct4, Sox2, Klf4 oraz c-Myc pod kontrolą elementu odpowiedzi tetO. Transgeny są aktywowane przez odwrotny białkowy aktywator transkrypcji tetracykliny, rtTAM2.216, który indukuje ekspresję czynników reprogramowania w obecności doksycykliny. System ten umożliwia ściśle kontrolowaną, wysoką ekspresję czynników reprogramowania. Zastosowane tutaj wektory lentiwirusowe są samoinaktywujące, w związku z czym nie mogą replikować się po integracji z genomem. Należy jednak zachować ostrożność podczas pracy z lentiwirusami; prace te powinny być prowadzone w laboratoriach zgodnych ze standardami BSL2 (USA) i S2 (Europa).

  1. Rozmrozić komórki HEK293T i przeprowadzić co najmniej jeden pasaż przed transfekcją. Komórki należy hodować w gęstości poniżej konfluencji w medium HEK w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności. Rutynowo pasażować komórki co 2 dni, stosując stosunek podziału 1:6-1:10.
  2. Zasiać ~8 x 106 komórek HEK293T/T150 w 25 ml medium HEK. Użyć jednej flaski T150 dla każdej preparacji lentiwirusa.
  3. Następnego dnia przeprowadzić transfekcję komórek HEK293T metodą wytrącania fosforanem wapnia. (Uwaga: w naszych doświadczeniach wytrącanie fosforanem wapnia rutynowo daje 80-90% wydajności transfekcji; można jednak stosować również kationowe odczynniki do transfekcji lipidowej, takie jak Lipofectamine 2,000). Przygotować dwie probówki stożkowe o pojemności 15 ml dla każdego wirusa do przygotowania. Oznaczyć probówki jako „A” i „B”. Probówka A: po 10 μg każdego z: lentiwirusowego wektora wahadłowego kodującego czynniki reprogramowania (lub rtTAM2.2), wektorów pakujących oraz plazmidu kodującego wirusowe białko otoczki, VSVg. Do probówki A dodać 186 μl 2 M CaCl2 i dopełnić objętość do 1,5 ml sterylną wodą H2O. Probówka B: 1,5 ml 2x HBS (podgrzane do temperatury pokojowej).
  4. Pipetować mieszaninę w probówce A, aż powstanie jednorodny roztwór. Dodawać roztwór A do roztworu B kropla po kropli i pozostawić w temperaturze pokojowej na 2-3 min.
  5. Odssać medium wzrostowe z komórek HEK293T i zastąpić je 22 ml podgrzanego medium HEK bez penicyliny i streptomycyny.
  6. Przenieść za pomocą pipety połączone roztwory AB (osad fosforanu wapnia) bezpośrednio do komórek HEK293T i równomiernie rozprowadzić poprzez delikatne kołysanie.
  7. 24 h po transfekcji komórek HEK-293T lentiwirusem usunąć medium wzrostowe i zastąpić je 25 ml świeżego, podgrzanego medium HEK. Przenieść transfekowane komórki HEK z powrotem do inkubatora.
  8. 48 h po transfekcji komórek HEK-293T lentiwirusem zebrać media wzrostowe zawierające cząstki lentiwirusowe z transfekowanych komórek HEK. Usunąć zanieczyszczenia cząsteczkowe z zebranego roztworu wirusowego poprzez wirowanie przy 3,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  9. Skoncentrować wirusa poprzez ultrawirowanie przez poduszkę 20% sacharozy (2 ml sacharozy/25 ml supernatantu wirusowego) przez 2 h przy 112,000 x g w temperaturze 4 °C. Resuspender pellet wirusowy w 0,4 ml medium MEF w temperaturze 4 °C przez 15-30 min przy delikatnym kołysaniu. Przechowywać cząstki wirusowe w jednorazowych alikwotach (t.j. 50 μl) w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) do reprogramowania

Uwaga: Przedstawiony tutaj protokół dotyczy otrzymywania iPSC z embrionalnych fibroblastów mysich w wieku E 13.5 do zastosowania w testach TEC. Choć inne grupy wygenerowały myszy all-iPSC z komórek dawców dorosłych, nie testowaliśmy tej metody na innych typach komórek i nie możemy mieć pewności, że typ komórek dawcy nie jest czynnikiem wpływającym na wynik.

  1. Przygotować zapłodnienia myszy w czasie. W 13,5 dniu embrionalnym (E13.5) uśmiercić ciążną samicę i wypreparować embriony z rogów macicy. Umieścić i przechowywać embriony w 1x PBS (schłodzonym do 4 °C) na lodzie.
  2. Usunąć tkanki pozazarodkowe (i.e. chorion, amnion i łożysko). Odciąć głowę embrionu oraz ogon (opcjonalnie – jeśli jest wymagany do genotypowania) i kończyny. Wyjąć organy wewnętrzne, używając pęsety lub szpatułki w kształcie łyżki, a pozostałą część tułowia rozdrobnić ostrzem skalpela lub ostrymi nożyczkami.
  3. Przemyć rozdrobniony tułów w 5 ml schłodzonego 1x PBS. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  4. Odssać naddatek. Resuspender osad w 5 ml 0,25% Trypsyny-EDTA i inkubować w 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu przez 20-30 min.
  5. Dodać 5 ml pożywki MEF (podgrzanej do 37 °C), wymieszać i wirować przy 200 x g przez 5 min.
  6. Odssać naddatek i resuspender osad w podgrzanej pożywce MEF.
  7. Wysiać dysocjowane MEF do 2-3 studni płytki 6-dołkowej uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną. Jest to uznawane za pasaż 1.
  8. Pasażować MEF w rozcieńczeniu 1:4-1:5 co 48 hr. MEF w pasażu 3 są gotowe do transdukcji lentiwirusowej.

3. Wytwarzanie linii iPSC

  1. Dzień przed transdukcją lentiwirusową: wysiać ~3 x 105 pierwotnych MEF do jednego dołka płytki 6-dołkowej uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną.
  2. Dzień 1: pierwotne MEF powinny osiągnąć 80-90% konfluencji przed transdukcją lentiwirusową. Dodać cząstki lentiwirusowe bezpośrednio do pożywki MEF i inkubować z MEF przez noc w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.
  3. Następnego dnia (dzień 2) odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć 3 ml 1x PBS w celu usunięcia cząstek wirusowych.
  4. Dodać do komórek 0,5 ml podgrzanego do temperatury roboczej 0,25% Trypsyny-EDTA i inkubować w 37 °C przez 3-5 min, wykonując sporadycznie ruchy kołyszące.
  5. Triturować do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek.
  6. Przenieść MEF do probówki stożkowej 15 ml zawierającej 5 ml pożywki MEF. Odwirować przy 200 x g przez 5 min. Odessać supernatat i delikatnie resuspendować komórki w pożywce MEF.
  7. Równomiernie podzielić zawiesinę komórkową pomiędzy dwa dołki płytki 6-dołkowej uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną.
  8. Kołysać płytką w przód i w tył, na boki, a następnie raz w ruchu okrężnym, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w dołku. Inkubować przez noc w 37 °C, przy 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.
  9. Dzień 3: powtórzyć kroki 4-9, z wyjątkiem tego, że komórki z jednego dołka należy równomiernie podzielić na 3 dołki płytki 6-dołkowej uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną. Pozwoli to uzyskać 6 dołków z transdukowanymi pierwotnymi fibroblastami.
  10. Dzień 4: dodać doksycyklinę (dox) w stężeniu 10 μg/ml do 5 z 6 dołków. Jeden dołek powinien pozostać nieleczony jako kontrola.
  11. Dodać VPA w stężeniu 1,9 mM do 3 z 5 dołków traktowanych dox. VPA obniża tempo proliferacji MEF. Gęste kultury MEF tolerują przedłużoną ekspozycję na VPA, podczas gdy kultury subkonfluencyjne wykazują tendencję do starzenia się w ciągu 2-5 dni. Dlatego MEF powinny być w 100% konfluencyjne w momencie dodawania VPA. Uwaga: w naszych eksperymentach z reprogramowaniem stosujemy VPA, ponieważ jest on znanym modyfikatorem epigenetycznym i wykazano, że zwiększa wydajność generowania iPSC17, choć efekty i mechanizmy działania VPA w odniesieniu do generowania w pełni pluripotencjalnych linii iPSC nie są znane.
  12. Dzień 5: odessać pożywkę, przemyć i poddać komórki trypsynizacji jak wcześniej. Przesiać komórki traktowane dox/VPA do naczynia hodowlanego o powierzchni 15 cm2 uprzednio pokrytego 0,1% żelatyną, a komórki z pozostałych wariantów do naczyń o powierzchni 10 cm2 pokrytych żelatyną, w pożywce dla komórek ES uzupełnionej o świeżą dox i VPA.
  13. Uzupełniać pożywkę codziennie, stosując pożywkę ESC z dodatkiem świeżej dox i VPA. Kolonie przypominające ESC powinny zacząć pojawiać się po ok. 7 dniach w traktowaniu dox/VPA oraz po ok. 10 dniach w traktowaniu samą dox. W przypadku braku traktowania dox nie powinny pojawić się żadne kolonie.
  14. Gdy kolonie będą miały jasną, refrakcyjną, wyraźnie zarysowaną granicę i będą zawierać 30-50 komórek, ręcznie wyizolować kolonie za pomocą końcówki do nakładania żelu i przenieść do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U zawierającej 20 μl 0,25% trypsyny-EDTA. Poddać trypsynizacji do pojedynczych komórek i przenieść na warstwę feederową do płytki 96-dołkowej z płaskim dnem w 150 μl pożywki ESC zawierającej dox/VPA lub samą dox.
  15. Kontynuować klonalną ekspansję wyizolowanych linii iPSC na warstwach feederowych w pożywce ESC. Usunąć dox i VPA w 19. dniu po ich dodaniu (23. dzień po transdukcji). Odrzucić linie iPSC, które nie utrzymują zdolności do samoodnawiania lub tempa proliferacji zbliżonego do kontrolnych ESC.

Przed przystąpieniem do TEC pomocne może być scharakteryzowanie linii iPSC w odniesieniu do ESC. Nasze linie scharakteryzowaliśmy poprzez 1) ekspresję endogennych markerów pluripotencji (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) za pomocą immunocytochemii, 2) analizę kariotypu poprzez liczenie chromosomów oraz 3) formowanie ciałek zarodkowych. Można również przeprowadzić specyficzny dla lentiwirusów test RT-qPCR, aby potwierdzić, że prowiralne transgeny nie są ekspresjonowane w iPSC. Zidentyfikowaliśmy jednak w pełni pluripotencjalne iPSC, opierając się wyłącznie na morfologii, immunobarwieniu i kariotypowaniu. W naszych eksperymentach wybór linii iPSC na podstawie morfologii i cech wzrostu przypominających ESC skutkował tym, że większość linii wykazywała ekspresję markerów pluripotencji, podczas gdy zazwyczaj identyfikowaliśmy kilka linii z potencjalnie nieprawidłowymi kariotypami.

4. Przygotowanie iPSC do wstrzyknięcia do blastocysty

Wykazano, że numer pasażu linii PSC wpływa na jej pluripotencję18, choć może to zależeć od konkretnej linii19. Do wytworzenia dorosłych myszy all-iPSC wykorzystaliśmy iPSC z pasaży 8-14.

  1. Rozmrozić iPSC i wysiać na warstwie feederów w pożywce ESC. Przesiać komórki przynajmniej raz na feederach przed użyciem do iniekcji.
  2. Jedna studnia płytki 6-dołkowej zawierająca 70-80% konfluencji iPSC zapewni liczbę komórek do iniekcji z nawiązką. Odessać pożywkę wzrostową i przemyć komórki ~3 ml 1x PBS (bez Ca2+/Mg2+).
  3. Dodać do komórek 0,5 ml uprzednio ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w 37 °C przez 10 min, sporadycznie kołysząc płytką.
  4. Triturować w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Obserwować komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. iPSC muszą znajdować się w zawiesinie pojedynczych komórek, ponieważ kolonie/agregaty komórkowe zapchają pipetę do iniekcji.
  5. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek dodać do studni 1,0 ml pożywki ESC i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w 37 °C. Inkubować przez ~15 min lub do momentu, aż większość feederów zacznie przylegać.
  6. Ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą iPSC, dbając o to, aby nie oderwać słabo przylegających feederów.
  7. Przenieść iPSC do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki ESC. Centryfugować przy 200 x g przez 5 min. Odessać supernatant i usunąć resztę pożywki ESC za pomocą mikropipety. Opukać probówkę, aby oderwać osad, i delikatnie resuspender komórki w 0,2-0,5 ml schłodzonej pożywki FHM. Przechowywać komórki na lodzie do momentu i w trakcie iniekcji do tetraploidalnych blastocyst.

5. Generowanie blastocyst tetraploidalnych

Procedury wykonane w tej sekcji zostały szczegółowo opisane w innych opracowaniach5,6,20. Poniżej przedstawiamy naszą technikę, zoptymalizowaną pod kątem manipulatora elektrochemicznego BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001.

  1. Przygotuj myszy będące dawcami embrionów poprzez stymulację samic w wieku 23–28 dni (C57BL/6J-Tyrc-2J /BALB/cByJ F1) za pomocą PMS i HCG. Podaj 5 IU PMS o godzinie 14:00, a 5 IU HCG po 47 h. Po wstrzyknięciu HCG skojarz samice z samcami rozpłodniczymi C57BL/6J-Tyrc-2J /BALB/cByJ F1. Następnego dnia sprawdź obecność czopów pochwowych.
  2. Uśmierć samice z obecnym czopem i pobierz jajowody. Pozyskaj embriony w stadium 1 komórki, umieszczając jajowody w medium FHM z hialuronidazą i delikatnie rozrywając ampuły. Pozostaw masy cumulus w roztworze FHM/hialuronidaza na 5–7 min.
  3. Zbierz embriony w stadium 1 komórki za pomocą pipety ustnej i przemyj je przez krople medium FHM przed przeniesieniem do hodowli w KSOM-AA. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 pod warstwą oleju mineralnego przez noc, a w dniu elektrofuzji wybierz embriony w stadium 2 komórek; pozostałe embriony należy odrzucić.
  4. Umieść mikroslajd BTX w szalce Petriego o średnicy 10 cm. Wlej odpowiednią ilość medium do elektrofuzji w temperaturze pokojowej, aby zanurzyć slajd w roztworze, ale nie tak dużo, by całkowicie zanurzyć bieguny elektrod.
  5. Włącz urządzenia ECM 2001 oraz BTX Enhancer 400. Podłącz kable ECM do elektrod mikroslajdu i przymocuj kable do boku szalki Petriego, aby zapobiec niezamierzonemu przesunięciu slajdu.
  6. Wykonaj jeden impuls ręczny, aby uzyskać odczyt na urządzeniu BTX enhancer i zanotuj napięcie przykładanych prądów AC/DC. Prąd AC będzie kontrolował prędkość, z jaką embriony ustawią się między elektrodami, prąd DC spowoduje fuzję blastomerów, a czas impulsu określi długość impulsu DC. Dobrym punktem wyjścia są parametry: AC 3V, DC 100V i czas 0,05 msec. Optymalne napięcie DC mieści się w zakresie 90–150 V.
  7. Za pomocą pipety ustnej pobierz około 30–40 dwukomórkowych embrionów z hodowli KSOM-AA i przemyj je przez kilka kropli medium do elektrofuzji. Nabierz świeże medium do elektrofuzji z szalki z mikroslajdem do pipety ustnej i pobierz z niej przemyte embriony. Umieść je w 1 mm szczelinie między elektrodami na mikroslajdzie. Upewnij się, że są one ustawione na środku szczeliny i nie stykają się ze sobą.
  8. Przykładaj prąd AC, naciskając przycisk impulsu ręcznego. Embriony będą obracać się w polu AC, aż płaszczyzna kontaktu blastomerów stanie się równoległa do elektrod. Jeśli embriony nie ustawią się w ciągu kilku sekund, zwiększ ustawienie AC.
  9. Po ustawieniu się embrionów ponownie naciśnij przycisk impulsu ręcznego, aby przyłożyć impuls DC.
  10. Używając pipety z medium do elektrofuzji, zbierz embriony z mikroslajdu. Przemyj embriony przez kilka kropli KSOM-AA i umieść je w hodowli KSOM-AA w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Fuzja blastomerów powinna zakończyć się w czasie krótszym niż 30 min w hodowli.
  11. Powtórz kroki 7–11 dla pozostałych dwukomórkowych embrionów. Po kolejnych grupach fuzji monitoruj i wybieraj embriony z zlanymi blastomerami. Pomyślnie zfuzowane embriony będą sprawiać wrażenie, że znajdują się w stadium 1 komórki. Odrzuć embriony lizowane oraz dwukomórkowe po 30 min w hodowli. Jeśli stopień fuzji jest niższy niż 80%, zwiększ napięcie i/lub czas w przyrostach 5V i 0,01 msec. Jeśli poziom lizy przekracza 20%, odpowiednio zmniejsz napięcie DC i/lub czas. Optymalne ustawienia w naszych eksperymentach wynosiły: AC 4V, DC 146V i 0,07 msec. Ustawienia te konsekwentnie pozwalały uzyskać stopień fuzji na poziomie 90% lub wyższym przy niewielkiej lub zerowej lyzie.
  12. Kontynuuj hodowlę zfuzowanych embrionów w mikrokroplach KSOM-AA pod warstwą oleju mineralnego w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Można oczekiwać, że 85–95% zfuzowanych embrionów utworzy tetraploidalne (4n) blastocysty po 48 h inkubacji.

6. Mikroiniekcja iPSC do blastocyst tetraploidalnych

Do wstrzykiwania do blastocyst wykorzystujemy odwrócony mikroskop Nikon TE-2000U wyposażony w optykę DIC oraz mikromanipulatory Narishige. Do każdej tetraploidalnej blastocysty wstrzykuje się 10-12 iPSC zgodnie ze standardowym protokołem wstrzykiwania ESC do blastocyst myszy, który został zaprezentowany w poprzedniej publikacji JoVE5,20,21

  1. Nanieś kroplę 20 μl FHM na środek wklęsłego szkiełka podstawowego i przykryj ją 150 μl oleju mineralnego.
  2. Zanurz pipetę przytrzymującą oraz igłę do mikroiniekcji w kropli FHM. Odczekaj 2-3 min, aż obie igły częściowo wypełnią się FHM.
  3. Przepłucz 20-30 tetraploidalnych blastocyst przez kolejne krople FHM i przenieś je do kropli FHM na szkiełku mikroskopowym.
  4. Zaciągnij ustami mieszaninę iPSC do kropli. Jeśli komórki są zbyt skoncentrowane lub zagregowane, konieczne może być wcześniejsze rozcieńczenie mieszaniny komórek w kropli FHM.
  5. Pobierz 100-200 komórek za pomocą igły iniekcyjnej.
  6. Utrzymaj blastocystę tak, aby masa komórkowa znajdowała się na pozycji godziny 9. Wstrzyknij komórki do blastocele, przebijając strefę błyskotkę i trofoblast na pozycji godziny 3. Wstrzyknij 16-18 komórek do każdej blastocysty.
  7. Przenieś blastocysty uzupełnione o iPSC z powrotem do hodowli w KSOM-AA.

7. Transfer uzupełnionych tetraploidalnych blastocyst do rogów macicy myszy biorczych

Uzupełnione tetraploidalne blastocysty są chirurgicznie przeniesione do rogów macicy samic myszy biorcy zgodnie z wytycznymi instytutu badawczego, stosując standardową technikę20, którą krótko podsumujemy. Wybierz samice myszy CD-1 w fazie proestrus i przygotuj je do kojenia z samcami poddanymi wazektomii. Następnego ranka sprawdź obecność czopów pochwowych. Samice są gotowe do transferu embrionów do macicy dwa dni po wykryciu czopa (2.5 dpc).

Na jeden dzień przed kopulacją samic biorców z wazektomizowanymi samcami, przygotuj dodatkowe samice CD-1 z niewazektomizowanymi samcami, które posłużą jako matki zastępcze dla myszy all-iPSC pozyskanych metodą cięcia cesarskiego.

8. Cięcie cesarskie i adaptacja młodych szczurów pochodzących z iPSC

Transfer embrionów TC zazwyczaj skutkuje licznymi resorpcjami po implantacji, nawet jeśli linia iPSC lub ESC wykazuje wysoki potencjał rozwojowy. W konsekwencji można spodziewać się nie więcej niż 4 żyjących szczeniąt (zazwyczaj 1-2) na jedną biorczynię. Tak małe mioty są zazwyczaj zaniedbywane przez matki. Aby zwiększyć poziom opieki neonatologicznej i przeżywalność, wykonujemy cięcia cesarskie oraz fostering zgodnie ze standardowymi protokołami20. W celu przeprowadzenia cięcia cesarskiego należy uśpić myszy biorczyń 16 dni po transferze embrionów w godzinach 19:00-20:00 (biorczynia 18,5 dpc) i wyciąć szczenięta z rogów macicy. Żyjące szczenięta należy przekazać pod opiekę matkom CD-1, które urodziły mioty tego samego dnia.

Wyniki

W kroku 3, „Wyprowadzenie iPSC z MEF”, należy zaobserwować heterogeniczność morfologiczną i tworzenie niedojrzałych kolonii iPSC rozpoczynające się 4-5 dni po dodaniu doksycykliny/VPA, a dojrzałe kolonie między 7. a 10. dniem (Rycina 2). Produkcja jednokomórkowych embrionów tetraploidalnych w kroku 5 jest bardzo wydajna (Rycina 3). Rutynowo obserwujemy, że do 95% traktowanych embrionów dwukomórkowych ulega pomyślnemu zapłodnieniu/fuzji, dając w efekcie tetraploidalne embriony jednokomórkowe. Protokół wstrzykiwania iPSC do tetraploidalnych blastocyst (krok 6, Rycina 4) jest podobny do protokołu wstrzykiwania ESC do diploidalnych blastocyst w celu generowania myszy chimerycznych i może być wykonany przez doświadczonego specjalistę od mikroiniekcji. Liczba urodzonych żywych szczeniąt zależy od linii komórkowej (Tabela 1).

Wydajność przeprogramowania MEF 0,01-0,03%
Wydajność otrzymywania myszy iPSC przy użyciu TEC
NazwaOpisWstrzyknięte blastocystyŻywy noworodekDorosłe osobniki żywe
iMZ-21iPSC86753 (6.1%)19 (2.2%)
iMZ-9iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste)1957 (3.6%)4 (2.1%)
iMZ-11iPSC3381(0.3%)0 (0%)

Tabela 1. Reprezentatywne wyniki.

Schemat komplementacji blastocysty tetraploidalnej; tworzenie myszy iPSC z diploidowych zarodków E13.
Rycina 1. Schemat projektu doświadczalnego. Góra po lewej: Produkcja blastocyst tetraploidalnych. Zapłodnione zarodki dwukomórkowe od myszy albinosów poddawane są elektrofuzji w celu wygenerowania tetraploidalnych zarodków jednokomórkowych, które są hodowane in vitro do stadium blastocysty. Dół po lewej: Reprogramowanie. Embrionalne fibroblasty mysie są transdukowane cząstkami lentiwirusowymi kodującymi Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc oraz białko rtTAM2.2 (odwracalny aktywator transkrypcji tetracykliny). Dodanie doksycykliny prowadzi do ekspresji transgenu i rozpoczęcia reprogramowania do iPSC. Po prawej: Produkcja myszy iPSC. iPSC pochodzące od myszy pigmentowanych są wstrzykiwane do blastoceli blastocyst tetraploidalnych, a następnie chirurgicznie implantowane do pseudociążnych myszy biorców. Noworodki myszy iPSC są wyjmowane drogą cesarskiego cięcia i przekazywane pod opiekę kocic zastępczych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Proces przeprogramowania komórek; obrazy mikroskopowe; transformacja MEF w iPSC przy powiększeniu 10x, 20x.
Rysunek 2. Zmiany morfologiczne związane z przeprogramowaniem. Od lewej do prawej: Przykłady progresji morfologicznej od fibroblastów do kolonii iPSC w trakcie eksperymentu z przeprogramowaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Etapy rozwoju embrionu: 2-komórkowy (2n), fuzja blastomerów, 1-komórkowy (4n); obrazy mikroskopowe.
Rycina 3. Produkcja embrionów tetraploidalnych. Diploidalne embriony dwukomórkowe są poddawane impulsowi elektrycznemu, co prowadzi do fuzji blastomerów i powstania jednokomórkowych embrionów tetraploidalnych.

Wstrzyknięcie iPSC do blastocysty, skutkujące narodzinami myszy iPSC oraz myszą iPSC w wieku 3 tygodni; wyniki badania komórkowego.
Rycina 4. Produkcja myszy iPSC. Po lewej: iPSC są wstrzykiwane do jamki zarodkowej blastocysty tetraploidalnej. Środek: Noworożki myszy iPSC wyróżniają się pigmentacją oczu. Po prawej: Mysz iPSC w trzech tygodniach po urodzeniu.

Dyskusja

Generowanie myszy z linii iPSC przy użyciu testów TEC stanowi rygorystyczny test funkcjonalny pluripotencji linii iPSC. Test ten może być przydatny do oceny względnej skuteczności różnych metod reprogramowania lub do identyfikacji linii iPSC, które mogą być najbardziej użyteczne w generowaniu określonych typów komórek in vitro. Myszy wygenerowane z iPSC mogą być wykorzystane do rygorystycznego badania długoterminowej stabilności i tumorigeniczności tkanek pochodnych z iPSC. Niniejszy protokół będzie przydatny dla badaczy pragnących wygenerować w pełni pluripotencyjne linie iPSC lub myszy iPSC, a także do porównania względnej użyteczności różnych metod reprogramowania.

Mechanizmy kontrolujące generowanie i identyfikację w pełni pluripotencjalnych iPSC pozostają słabo poznane i istnieje możliwość, że niektóre linie iPSC wytworzone tą metodą nie przejdą testu TEC. Wiele czynników może różnić się pomiędzy eksperymentami, w tym tło genetyczne, miano lentiwirusa, wzorce insercji lentiwirusowej, parametry cyklu komórkowego populacji dawcy, różnice międzylaboratoryjne w poszczególnych etapach procedury TEC oraz zmienna skłonność iPSC do nabywania aberracji genetycznych lub epigenetycznych. Aby jak najlepiej zapewnić sukces, dbamy o ustalenie odpowiedniego poziomu ekspresji genów lentiwirusowych w eksperymentach z pochodzenia iPSC, testując rozcieńczenia wirusa na kontrolnych MEF, aby upewnić się, że każdy wirus jest wystarczająco skoncentrowany, by wywołać wykrywalną ekspresję genu w co najmniej 80%, a idealnie w 100% komórek MEF. Pozwala nam to zidentyfikować linie z wieloma kopiami różnych lentiwirusów, ograniczając jednocześnie toksyczność dla MEF i wytwarzając kolonie bez nadmiernego zagęszczenia studzienek. Należy zauważyć, że wiele innych protokołów wykazało zdolność do wytwarzania iPSC o pełnym potencjale rozwojowym, przy użyciu wielu metod i źródeł komórek dawców, co sugeruje istnienie wielu dróg do pełnej pluripotencjalności1,8-13,15. Obecnie jednak nie zidentyfikowano żadnego definitywnego biomarkera w pełni pluripotencjalnych iPSC, dlatego test TEC pozostaje złotym standardem sprawdzania, czy linia iPSC może wygenerować wszystkie linie komórkowe w organizmie.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wsparcie dla KKB, MJB, JLH oraz KLN zostało zapewnione przez California Institute for Regenerative Medicine, Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, Esther B. O'Keeffe Family Foundation oraz Shapiro Family Foundation. KKB jest stypendystą naukowym Donald E. and Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (wysoka zawartość glukozy)Invitrogen11965-092
FBS kwalifikowany dla komórek ESInvitrogen104392-024
FBS (płytki surowica bydlęca)Invitrogen16140-071
GlutamaxInvitrogen35050-061
β-Merkapto–etanolSigmaSigma M7522
0,1% żelatynyMilliporeES006-B
Niezbędne aminokwasy MEMInvitrogen11140
Pożywka 199Invitrogen11150-059
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122
ESGRO (mysi LIF)MilliporeESG1106
Kwas walproinowySigmaP4543
DMSOFisherBP231-100
0,25% trypsyny-EDTAInvitrogen25200
PBS z Ca2+2+/Mg2+Invitrogen14040-133
PBS z Ca2+2+/Mg2+ bezpłatnyInvitrogen14190-144
Gonadotropina z surowicy klaczy w ciąży, do superowulacji, liofilizat, 2000 IUInstytut Badawczy Harbor-UCLAPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.
gonadotropina kosmotropowa, ludzkaSigmaC1063
pożywka FHM z hialuronidaząMilliporeMR-056-F
pożywka KSOM-1/2 AAMilliporeMR-106-D
FHMMilliporeMR-024-D
Woda do transferu embrionów, embrion przetestowanySigmaW1503
Olej mineralny, testowany na embrionachSigmaM5310
CaCl22SigmaC7902
MgSO₄4SigmaM2773
D-mannitolSigmaM4125
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA), testowane na embrionachSigmaA3311
embrionalne fibroblasty mysie, nienaświetlaneMilliporePMEF-CFL

Pożywki i bufory użyte w tym protokole

Pożywka wzrostowa dla komórek HEK293T. 90% DMEM, 10% FBS, 100 J/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Z pożywki HEK stosowanej w dniu transfekcji należy usunąć penicylinę i streptomycynę. Pożywkę HEK można przechowywać w temperaturze 4 °w temperaturze C do 1 miesiąca.

2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·7H2O, 12 mM dekstrozy. pH wynosi 7,1 +/- 0,1. pH jest krytyczne! Przefiltrować przez filtr sterylny i przechowywać w temperaturze 4°C. °C.

Pożywka do hodowli embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) (stosowana również z komórkami karmicielnymi). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 J/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4°C. °C przez maksymalnie 1 miesiąc.

Pożywka wzrostowa dla ESC. 85% DMEM, 15% FBS kwalifikowany do hodowli komórek ES, 1x Glutamax, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 0,1 mM β-merkapto–etanol, 1000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Pożywka do ESC może być przechowywana w temperaturze 4 °w temperaturze C przez maksymalnie trzy tygodnie.

Podłoże do elektrofuzji. 0,3 M mannitolu, 0,1 mM MgSO44, 50 mM CaCl22oraz 3% BSA w wodzie testowej do embrionów. Przechowywać w temperaturze 4°C °w temperaturze C do 3 miesięcy.

Bibliografia

  1. Boland, M. J., et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature. 461, 91-94 (2009).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
  4. Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).
  5. Eggan, K., Jaenisch, R. Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation. , Springer. (2006).
  6. McLaughlin, K. J. Production of tetraploid embryos by electrofusion. Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).
  7. Humpherys, D., et al. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science. 293, 95-97 (2001).
  8. Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).
  9. Zhao, X. Y., et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature. 461, 86-90 (2009).
  10. Kang, L., et al. Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation. Cell Res. 21, 546-549 (2011).
  11. Zhao, X. -Y., et al. Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).
  12. Han, J., et al. Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells. Nature. 463, 1096-1100 (2010).
  13. Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).
  14. Stadtfeld, M., et al. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Nature. 465, 175-181 (2010).
  15. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  16. Go, W. Y., Ho, S. N. Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems. The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).
  17. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nature. 26, 795-797 (2008).
  18. Li, X. -y, et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).
  19. George, S. H. L., et al. Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
  21. Kirak, O., et al. Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT. J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komplementacja zarodka tetraploidalnegoembrionalne fibroblasty mysiereprogramowanie lentiwirusowemarkery pluripotencjitworzenie cia ek zarodkowychtworzenie potworniak wgenerowanie myszy chimerycznychfrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowa
Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.