Wewnątrzprzewodowe wstrzyknięcie LPS jako mysi model zapalenia wymion: wizualizacja sygnalizacji za pomocą transgenicznego reportera NF-κB

Podsumowanie

Opisana tutaj technika polega na wstrzyknięciu lipopolisacharydu do gruczołu mlekowego laktującej myszy poprzez sutek w celu symulacji zapalenia wymienia, stanu najczęściej wywołanego przez infekcję bakteryjną. Wstrzyknięcie lipopolisacharydu prowadzi do zwiększenia sygnalizacji czynnika jądrowego kappa B (NF-κB), co jest wizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy reporterowej z lucyferazą NF-κB.

Streszczenie

Modele zwierzęce ludzkich chorób są niezbędne do rygorystycznego badania etapów progresji choroby i związanych z nią mechanizmów, a w dalszej kolejności jako modele przedkliniczne do testowania interwencji. W niniejszych metodach opisujemy technikę, w której lipopolisacharyd (LPS) jest wstrzykiwany do gruczołu mlekowego laktującej myszy poprzez sutek, co skutecznie modeluje zapalenie gruczołu mlekowego (mastitis). Ta symulowana infekcja prowadzi do zwiększenia sygnalizacji czynnika jądrowego kappa B (NF-κB), co zostało zwizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy reporterowej lucyferazy NF-κB¹.

Naszym ostatecznym celem podczas opracowywania tych metod było zbadanie stanu zapalnego towarzyszącego zapaleniu wymienia w gruczole mlekowej, który często objawia się zaczerwienieniem, obrzękiem i naciekiem komórek odpornościowych^2,3. Byliśmy zatem w pełni świadomi, że nacięcie lub jakikolwiek rodzaj uszkodzenia skóry, sutka lub gruczołu w celu wprowadzenia LPS nie mogą zostać zastosowane w naszych metodach, ponieważ takie podejście prawdopodobnie zaburzyłoby odczyt stanu zapalnego. Chcieliśmy również opracować prostą metodę, która nie wymagałaby specjalnie wykonanych pipet ręcznych ani użycia mikromanipulatorów do unieruchomienia tych specjalistycznych narzędzi. Zdecydowaliśmy się zatem na użycie dostępnej w handlu strzykawki insulinowej i wstrzyknięcie preparatu do przewodu mlecznego w nienaruszonej sutce. Metoda ta okazała się skuteczna i pozwoliła nam badać stan zapalny związany z wstrzyknięciem LPS bez dodatkowych efektów wynikających z samego procesu iniekcji. Ponadto w tej metodzie wykorzystano transgeniczne myszy z reporterem lucyferazy NF-κB oraz technologię obrazowania bioluminescencyjnego, aby wizualnie i ilościowo wykazać zwiększoną sygnalizację NF-κB w gruczole po wstrzyknięciu LPS⁴.

Metody te są interesujące dla badaczy z wielu dyscyplin, którzy pragną modelować choroby w laktacyjnym gruczole mlekowym, ponieważ opisana tutaj technika może w ostateczności zostać wykorzystana do wstrzykiwania szeregu substancji i nie ogranicza się wyłącznie do LPS.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Przygotowanie myszy transgenicznych

1. Do tej procedury wykorzystuje się samice myszy pozytywne pod kątem transgenu reporterowego NGL (NF-κB-GFP-Luciferase) (opisanego wcześniej¹). Gdy samice osiągną wiek co najmniej 6 tygodni, należy je skrzyżować z samcem szczepu FVB typu dzikiego. Można zastosować hodowlę haremową (do 4 samic w klatce z 1 samcem). (Uwaga: w niniejszym badaniu wykorzystano myszy szczepu FVB. Można również użyć myszy o ciemniejszym umaszczeniu, takich jak C57Bl6, jednak myszy te muszą zostać ogolone przed obrazowaniem).
2. Zaczynając od 15. dnia po kopulacji, należy regularnie sprawdzać samice pod kątem oznak ciąży (wyraźne powiększenie obwodu brzucha). Każda samica musi zostać odseparowana po zapłodnieniu, a samiec usunięty z klatki hodowlanej, gdy ostatnia samica zajdzie w ciążę).
3. Należy obserwować odseparowane samice i odnotować datę narodzin miotu. Do zapewnienia odpowiedniej laktacji wymagany jest miot liczący co najmniej 6 szczeniąt. Osiem dni po narodzinach miotu należy przystąpić do protokołu (schemat ram czasowych przedstawiono na Ryc. 1).

2. Przygotowanie do iniekcji

1. Rozpuść LPS E. coli w PBS do końcowego stężenia 0,1 μg/μl. Do gruczołu mlekowego zostanie wstrzyknięte 50 μl tego roztworu, czyli łącznie 5 μg. Przygotuj drugą probówkę zawierającą sam PBS do użycia podczas wstrzykiwania kontrolnego.
2. Przygotuj stereomikroskop sekcyjny oraz sprzęt do znieczulenia izofluranem. Do stolika stereomikroskopu, na którym zostanie umieszczona mysz, należy przymocować aparat z maską nosową. Należy również zapewnić odpowiednie źródło światła, pochodzące z samego mikroskopu lub z dodatkowych reflektorów.
3. Po zakończeniu przygotowań uruchom aparat do podawania izofluranu oraz przepływ powietrza.

3. Wstrzykiwanie LPS do przewodów

1. Napełnić strzykawkę z krótką igłą 50 μl roztworu LPS. Odstawić ją na bok.
2. Zanestetyzować mysz przeznaczoną do iniekcji, umieszczając najpierw samicę w pudełku wypełnionym izofluranem, a następnie, gdy oddech zwolni, przenieść ją na podest i umieścić nos w stożku nosowym. Potwierdzić pełną anestezję myszy za pomocą ucisku palca u nogi. Monitorować oddech myszy przez cały czas trwania procedury i odpowiednio regulować poziom izofluranu. Klatkę z miotem młodych, z której zabrano samicę, należy ostrożnie odstawić na bok, aż do momentu, gdy matka będzie mogła do nich wrócić po zakończeniu procedury.
3. Użyć małej kropli 70% etanolu, aby wygładzić futro i ułatwić wizualizację suteczki należącej do prawego pachwinowego gruczołu mlekowego nr 4 na dolnym brzuchu myszy.
4. Ustawić ostrość stereomikroskopu, aby uzyskać optymalny widok suteczki. Ostrożnie, za pomocą precyzyjnej pęsety, dodatkowo odsunąć suteczkę od skóry, unikając jej nakłucia lub w jakikolwiek sposób uszkodzenia. Podczas manipulowania tkanką pęseta nigdy nie powinna być mocno zaciśnięta; należy jej używać z lekkim chwytem, który wywiera minimalny nacisk na suteczkę.
5. Używając pęsety w lewej ręce, delikatnie przytrzymać suteczkę w miejscu. Powoli wprowadzić przygotowaną strzykawkę w pole widzenia prawą ręką. Strzykawkę należy trzymać w taki sposób, aby nie było konieczne jej repozycjonowanie w celu wstrzyknięcia zawartości.
6. Gdy strzykawka będzie widoczna, precyzyjnie wycelować w mały otwór przewodowy w centrum suteczki i wprowadzić igłę.
7. Bez zmiany ułożenia dłoni wstrzyknąć zawartość strzykawki i wyciągnąć igłę z suteczki.
8. Napełnić drugą strzykawkę 50 μl PBS do iniekcji kontrolnej. Przestawić mysz na podeście, aby uzyskać najlepszy widok suteczki lewego pachwinowego gruczołu mlekowego nr 4 po drugiej stronie dolnego brzucha myszy. Powtórzyć kroki 3.4 do 3.7, używając strzykawki z PBS.
9. Po zakończeniu obu iniekcji przerwać anestezję i przenieść mysz do klatki rekonwalescencyjnej. Monitorować samicę, aby upewnić się, że odzyska sprawność ruchową w ciągu 5 min. Pozostawić mysz w klatce rekonwalescencyjnej na 1 hr. Po 1 hr rekonwalescencji umieścić samicę z powrotem w klatce z miotem młodych. Myszy powinny być okresowo monitorowane przez 6 hr po iniekcji przed przejściem do obrazowania. W naszym doświadczeniu nie odnotowano żadnych niepożądanych skutków ani u samicy, ani u młodych w okresie między iniekcją a obrazowaniem. Jeśli jednak zaobserwuje się oznaki stresu u samicy (np. zwinięta postawa, gryzienie lub chronienie miejsca iniekcji, ogólna letargia) lub u młodych (brak ruchu, sinawy kolor skóry), eksperyment należy przerwać.

4. Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wizualizacji aktywności NF-κB

1. Po przetransportowaniu myszy do pracowni obrazowania rozpocznij procedurę obrazowania, uruchamiając oprogramowanie i inicjalizując urządzenie. Włącz aparat do podawania izofluranu oraz przepływ powietrza, upewniając się, że znieczulenie dopływa zarówno do pojemnika, jak i do komory obrazowania.
2. Umieść mysz w przezroczystym pojemniku do znieczulania pod wpływem izofluranu. Po spowolnieniu oddechu potwierdź pełne znieczulenie myszy za pomocą ucisku palca u nogi. Następnie wstrzyknij 100 μl substratu lucyferyny do myszy drogą zaoczno-orbitową⁵ przy użyciu sterylnej strzykawki.
3. Natychmiast przenieś mysz do komory obrazowania i umieść jej nos pod znajdującym się tam stożku do podawania izofluranu. Mysz powinna znajdować się w pozycji grzbietowej. Przymocuj każdą łapę do platformy za pomocą taśmy.
4. Wprowadź odpowiednie ustawienia do oprogramowania IVIS, aby wykonać zarówno fotografię w świetle białym, jak i obraz aktywności bioluminescencyjnej. Czas ekspozycji powinien wynosić 10 sec. Wykonaj obrazowanie.
5. Po uzyskaniu obrazów pozwól myszy dojść do siebie, a następnie umieść ją z powrotem w klatce z młodymi i monitoruj jej stan w regularnych odstępach czasu.
6. Obrazy fotograficzne i luminescencyjne są automatycznie nakładane na siebie i wyświetlane na ekranie, jak pokazano na Rysunku 2. Przeanalizuj uzyskane obrazy, wyznaczając obszary zainteresowania (region of interest, "ROI") w formie kół o tej samej wielkości nad każdą stroną dolnego brzucha myszy (jedno nad gruczołem wstrzykniętym PBS i jedno nad gruczołem wstrzykniętym LPS). Ustaw odczyt na fotony. Powinna wyświetlić się liczba wskazująca luminescencję wykrytą w każdym ROI (patrz Rysunek 2B). Wykorzystaj tę wartość w analizie statystycznej.
7. Aby uzyskać optymalny obraz, dodatkowo dostosuj próg wyświetlanego sygnału. Nie zmieni to całkowitego odczytu luminescencji, ale pozwoli usunąć sygnał tła i zwizualizować różnice między gruczołem kontrolnym a gruczołem traktowanym LPS. Zmniejsz ilość wyświetlanej luminescencji, aż gruczoł wstrzyknięty PBS zostanie oczyszczony z sygnału tła. Powinno to sprawić, że zwiększony sygnał w gruczole traktowanym LPS nadal będzie widoczny na obrazie, jak pokazano na Rysunku 2.
8. Dodatkowe analizy, w tym oznaczenia białek i RNA, można przeprowadzić z tkanki gruczołu mlekowego pobranej od samicy po śmierci⁶.

5. Reprezentatywne wyniki

Aby uzyskać interpretowalne wyniki z tych metod, LPS (lub PBS) musi zostać wprowadzony wyłącznie do przewodów mlecznych, bez naruszania sąsiednich tkanek. Iniekcja do tkanki podskórnej wokół sutka spowoduje stan zapalny wynikający z urazu, a nie z symulowanej infekcji. Wprowadzenie barwnika błękitu trypanu rozcieńczonego w PBS jest pomocne podczas nauki tej techniki. Rycina 3A przedstawia gruczoł, do którego pomyślnie wprowadzono 100 μl błękitu trypanu w PBS. Jak widać, tylko drzewo przewodowe powinno być wypełnione wstrzykniętym roztworem i nie powinno być widocznego bolusa w miejscu iniekcji. „Bolus” w tym kontekście to nagromadzenie wstrzykniętego płynu przy sutku lub w tkance otaczającej sutek bez jego przeniknięcia do drzewa przewodowego. Jest to przedstawione na Rycynie 3B. Należy zauważyć, że iniekcje treningowe pokazane na Rycynie 3 zostały wykonane u samicy w 21. dniu laktacji. W szczycie laktacji (dni 8–10, w którym stadium zgodnie z obecnym protokołem wstrzykuje się LPS), mleko jest obfite, co utrudnia wizualizację przewodów i ocenę, czy iniekcja została wykonana prawidłowo. Dlatego późniejsze etapy laktacji są bardziej odpowiednie do przeprowadzania iniekcji treningowych.

Pomyślny wtrysk LPS do przewodów mlecznych skutkuje zwiększoną aktywnością NF-κB w obrębie gruczołu. Powinno to być widoczne w obrazowaniu IVIS u myszy reporterowej; gruczoł po wtrysku LPS powinien wykazywać znacznie wyższą aktywność lucyferazy (mierzoną liczbą fotonów) niż gruczoł po wtrysku PBS, co przedstawiono na Rysunku 2 (średnio sygnał z gruczołu z LPS wynosi 200% sygnału kontrolnego z PBS). Statystycznie istotny wzrost luminescencji w gruczołach traktowanych LPS w porównaniu z przeciwległą kontrolą osiągnięto po przeprowadzeniu badań w grupie 4 myszy ⁴. W innym badaniu wykorzystano również wewnątrzprzewodowy wtrysk do gruczołu piersiowego bakterii E. coli lub LPS u transgenicznych myszy reporterowych NF-κB. Podobnie jak w naszej pracy, autorzy ci zaobserwowali istotny wzrost aktywności reportera 6 h po wtrysku E. coli².

Należy zauważyć, że ze względu na konstytutywną aktywność NF-κB w mózgu oraz innych narządach jamy brzusznej, głowy i brzuchy naszych myszy reporterowych konsekwentnie wykazują sygnał podczas obrazowania, nawet w stanie podstawowym przed jakąkolwiek manipulacją. W związku z tym sygnał ten należy zignorować w odniesieniu do niniejszego eksperymentu. Wyraźny sygnał powinien pozostać w gruczole mlekowym po wstrzyknięciu LPS, po dostosowaniu odczytu obrazu w celu zminimalizowania luminescencji tła w gruczole z PBS. Rysunek 2 przedstawia obrazy z zredukowanym tłem.

Nieudana iniekcja w gruczoł najprawdopodobniej doprowadzi do uszkodzenia sutka. Spowoduje to punktowy stan zapalny na poziomie skóry, który będzie widoczny w obrazowaniu. Tego rodzaju sygnał uszkodzenia będzie bardzo silny i ograniczony do obszaru sutka, w którym doszło do urazu, a nie rozprzestrzeniać się będzie przez cały gruczoł, jak ma to miejsce po udanej iniekcji LPS do przewodów.

Rysunek 1. Schemat procedury.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki obrazowania bioluminescencyjnego IVIS. (A) Uzyskany obraz z zredukowanym tłem, wykazujący zwiększoną aktywność lucyferazy w gruczole po wstrzyknięciu LPS. (B) Obraz z punktu A z dodanymi kwantyfikacjami obszarów zainteresowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 3. Iniekcja próbna: gruczoł mlekowy po podaniu barwnika drogą wewnątrzkanałową. Aby przetestować dokładność podania przez suteczek, myszy w 21. dniu laktacji wstrzyknięto 100 μl barwnika trypan blue rozcieńczonego w PBS. Po uśmierceniu zwierzęcia gruczoł odsłonięto w celu wizualizacji. (A) udana iniekcja oraz (B) skupisko barwnika przy suteczku.

Dyskusja

W niniejszej pracy wykorzystujemy transgeniczną mysz z reporterem NF-κB oraz zoptymalizowaną technikę iniekcji do modelowania zapalenia gruczołów mlecznych, czyli stanu zapalnego tkanki piersi najczęściej wywoływanego przez infekcję bakteryjną. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest sama iniekcja wewnątrzprowadzkowa.

W praktyce zazwyczaj łatwo ocenić, czy wstrzyknięcie wewnątrzykanałowe przebiegło pomyślnie. Podawanie substancji (LPS lub PBS) powinno odbywać się płynnie, a podczas op...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lipopolisacharyd z Escherichia coli (LPS)	Sigma	L 2880	serotyp 055:B5
PBS	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Strzykawka insulinowa G31	Becton Dickinson	328438	Krótka igła
Pinceta	World Precision Instruments	15908
Zakres sekcji	Leica	M3Z
Terrell Isoflurane, USP	MINRAD INC. dla Rx Elite	NDC 66794-011-25
system obrazowania IVIS 200	Caliper (dawniej Xenogen)	N/A
Strzykawka do wstrzykiwania lucyferyny	Becton Dickinson	309597	1 ml; 26G 5/8
D-lucyferyna świetlika, sól sodowa monohydrat (Podłoże lucyferynowe)	Biosynth Chemistry and Biology	L-8240	Rozcieńczyć do stężenia 10 mg/ml