Opisana tutaj technika polega na wstrzyknięciu lipopolisacharydu do gruczołu mlekowego laktującej myszy poprzez sutek w celu symulacji zapalenia wymienia, stanu najczęściej wywołanego przez infekcję bakteryjną. Wstrzyknięcie lipopolisacharydu prowadzi do zwiększenia sygnalizacji czynnika jądrowego kappa B (NF-κB), co jest wizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy reporterowej z lucyferazą NF-κB.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzprzewodowe wstrzyknięcie LPS jako mysi model zapalenia wymion: wizualizacja sygnalizacji za pomocą transgenicznego reportera NF-κB
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce ludzkich chorób są niezbędne do rygorystycznego badania etapów progresji choroby i związanych z nią mechanizmów, a w dalszej kolejności jako modele przedkliniczne do testowania interwencji. W niniejszych metodach opisujemy technikę, w której lipopolisacharyd (LPS) jest wstrzykiwany do gruczołu mlekowego laktującej myszy poprzez sutek, co skutecznie modeluje zapalenie gruczołu mlekowego (mastitis). Ta symulowana infekcja prowadzi do zwiększenia sygnalizacji czynnika jądrowego kappa B (NF-κB), co zostało zwizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy reporterowej lucyferazy NF-κB1.
Naszym ostatecznym celem podczas opracowywania tych metod było zbadanie stanu zapalnego towarzyszącego zapaleniu wymienia w gruczole mlekowej, który często objawia się zaczerwienieniem, obrzękiem i naciekiem komórek odpornościowych2,3. Byliśmy zatem w pełni świadomi, że nacięcie lub jakikolwiek rodzaj uszkodzenia skóry, sutka lub gruczołu w celu wprowadzenia LPS nie mogą zostać zastosowane w naszych metodach, ponieważ takie podejście prawdopodobnie zaburzyłoby odczyt stanu zapalnego. Chcieliśmy również opracować prostą metodę, która nie wymagałaby specjalnie wykonanych pipet ręcznych ani użycia mikromanipulatorów do unieruchomienia tych specjalistycznych narzędzi. Zdecydowaliśmy się zatem na użycie dostępnej w handlu strzykawki insulinowej i wstrzyknięcie preparatu do przewodu mlecznego w nienaruszonej sutce. Metoda ta okazała się skuteczna i pozwoliła nam badać stan zapalny związany z wstrzyknięciem LPS bez dodatkowych efektów wynikających z samego procesu iniekcji. Ponadto w tej metodzie wykorzystano transgeniczne myszy z reporterem lucyferazy NF-κB oraz technologię obrazowania bioluminescencyjnego, aby wizualnie i ilościowo wykazać zwiększoną sygnalizację NF-κB w gruczole po wstrzyknięciu LPS4.
Metody te są interesujące dla badaczy z wielu dyscyplin, którzy pragną modelować choroby w laktacyjnym gruczole mlekowym, ponieważ opisana tutaj technika może w ostateczności zostać wykorzystana do wstrzykiwania szeregu substancji i nie ogranicza się wyłącznie do LPS.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt.
1. Przygotowanie myszy transgenicznych
- Do tej procedury wykorzystuje się samice myszy pozytywne pod kątem transgenu reporterowego NGL (NF-κB-GFP-Luciferase) (opisanego wcześniej1). Gdy samice osiągną wiek co najmniej 6 tygodni, należy je skrzyżować z samcem szczepu FVB typu dzikiego. Można zastosować hodowlę haremową (do 4 samic w klatce z 1 samcem). (Uwaga: w niniejszym badaniu wykorzystano myszy szczepu FVB. Można równ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy wykorzystujemy transgeniczną mysz z reporterem NF-κB oraz zoptymalizowaną technikę iniekcji do modelowania zapalenia gruczołów mlecznych, czyli stanu zapalnego tkanki piersi najczęściej wywoływanego przez infekcję bakteryjną. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest sama iniekcja wewnątrzprowadzkowa.
W praktyce zazwyczaj łatwo ocenić, czy wstrzyknięcie wewnątrzykanałowe przebiegło pomyślnie. Podawanie substancji (LPS lub PBS) powinno odbywać się płynnie, a podczas op.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH CA113734 przyznanego F Yull oraz przez Departament Spraw Weteranów (TS Blackwell).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lipopolisacharyd z Escherichia coli (LPS) | Sigma | L 2880 | serotyp 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Strzykawka insulinowa G31 | Becton Dickinson | 328438 | Krótka igła |
| Pinceta | World Precision Instruments | 15908 | |
| Zakres sekcji | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. dla Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| system obrazowania IVIS 200 | Caliper (dawniej Xenogen) | N/A | |
| Strzykawka do wstrzykiwania lucyferyny | Becton Dickinson | 309597 | 1 ml; 26G 5/8 |
| D-lucyferyna świetlika, sól sodowa monohydrat (Podłoże lucyferynowe) | Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Rozcieńczyć do stężenia 10 mg/ml |
Bibliografia
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
