Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową u myszy cukrzycowych lub zdrowych. Ustaliliśmy, że łatwiej jest skoncentrować wysepki lub komórki w postaci pelletu w końcowej rurce do aplikacji (PE50), używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Technika ta zapewnia szybkość i łatwość wykonania, ograniczając jednocześnie nadmierny stres dla komórek lub myszy.
Załadunek: Osadzone, ręcznie wyselekcjonowane wysepki lub zgranulowane komórki są ostrożnie odsysane z dna probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL za pomocą pipety p200 i prostej końcówki o cienkich ściankach. Odcinek rurki PE50 jest mocowany do końcówki pipety za pomocą małego silikonowego adaptera. Pozostawia się komórki do osadzenia się w końcówce, a następnie przenosi je do rurki PE50 poprzez powolne operowanie pipetą. Gdy komórki znajdują się blisko końca rurki PE50, wykonuje się zagięcie, a na nim umieszcza silikonowy adapter. Rurkę PE50 przenosi się do stożkowej probówki 15 mL zawierającej uciętą pipetę 5 mL, a rurkę PE50 przykleja taśmą do boku pipety 5 mL, aby zapobiec jej zwijaniu się podczas wirowania. Próbkę wiruje się do osiągnięcia prędkości 1 000 rpm, a następnie zatrzymuje.
Transplantacja: Myszy biorców poddaje się znieczuleniu, goleniu i oczyszczeniu. Na lewym boku myszy wykonuje się niewielkie nacięcie, aby odsłonić nerkę. Nerkę, tkankę tłuszczową i tkanki sąsiednie utrzymuje się w stanie wilgotnym za pomocą tamponu z solą fizjologiczną. Dystalny koniec rurki PE50 łączy się z mikrosτρzykawką Hamiltona z napędem śrubowym, zawierającą końcówkę pipety, przy użyciu silikonowego adaptera. Po prawej stronie nerki wykonuje się niewielkie, nie zbyt duże i nie zbyt głębokie nacięcie. Ścięty koniec rurki PE50, znajdujący się najbliżej komórek, ostrożnie umieszcza się pod torebką nerki, delikatnie przesuwając rurkę w celu zrobienia miejsca i jednocześnie zwilżając obszar solą fizjologiczną; sucha torebka może łatwo ulec rozerwaniu. Poprzez powolne obracanie śruby mikrosτρzykawki pod torebkę wprowadza się mały pęcherzyk powietrza. Następnie, za pęcherzykiem powietrza, powoli podaje się wysepki. Po wprowadzeniu wysepek dba się o zachowanie homeostazy nerki, a nacięcie kauteryzuje się w niskiej temperaturze. Nerkę umieszcza się z powrotem w jamie brzusznej, a otrzewną i skórę zszywa się i zapina zszywkami. Myszy natychmiast traktuje się podskórnie Fluniksynem i Buprenorfiną, a następnie umieszcza w klatce na podgrzewaczce.
Protokół
Przygotowanie wysepek do transplantacji (Tx)
- Pod mikroskopem odwróconym, ręcznie wyselekcjonować wyspki z hodowli na płytce 100mm, używając pipety P200 i prostej końcówki do pipety.
- Odliczać wyspki w grupach po 100 i przenosić do poszczególnych probówek do mikrowirówki (~500 wyspek/probówka/mysz).
- Pozostawić wyspki do czasu ich osiadania na dnie probówek do mikrowirówki.
- Pobrać jeden osad z wyspek za pomocą pipety P200 (ustawionej na 130ul), używając prostej cienkościennej końcówki do pipety.
- Nałożyć silikonowy adapter do probówek na końcówkę strzykawki. Wsunąć odcinek rurki PE50 do adaptera silikonowego.
- Zawiesić pipetę z boku dygestorium i przykleić taśmą rurkę PE50 do ścianki dygestorium powyżej poziomu wyspek w końcówce. Pozwoli to wyspkom osadzić się wyłącznie w końcówce pipety.
- Przenieść wyspki do rurki PE50, powoli obracając pokrętło pipety i przesuwając wyspki do rurki PE50, dbając o to, aby nie wypchnąć wyspek z końca rurki.
- Zagiąć skośny koniec rurki PE50. Utrzymując zagięcie, odłączyć adapter silikonowy z rurką od pipety i zabezpieczyć zagięcie za pomocą adaptera silikonowego.
- Umieścić wyspki w rurce PE50 (stroną z zagiętym adapterem silikonowym skierowaną w dół) w stożkowej probówce 15 mL z uciętą pipetą 5 mL i przymocować taśmą rurkę PE50 do boku pipety 5 mL, aby zapobiec zwijaniu się rurki PE50 podczas wirowania.
- Wirować probówki stożkowe 15 mL z rurkami PE50 z prędkością 1000 rpm, a następnie wyłączyć wirówkę. (Nigdy nie przygotowywać więcej niż 10 preparatów z wyspek jednocześnie).
- Umieścić probówkę na lodzie.
Przygotowanie myszy do przeszczepu
- Znieczulić myszy izofluranem lub ketaminą/ksylozenem (patrz protokół przygotowania).
- Po zadziałaniu środka znieczulającego wygolić lewy bok myszy.
- Przetrzeć skórę myszy, ruchami od środka na zewnątrz, gazikiem z jodopowidonem, a następnie przemyć gazikiem nasączonym ETOH.
- Zlokalizować lewą nerkę (bezpośrednio po prawej stronie śledziony). Wykonać niewielkie nacięcie skóry, odsłaniając otrzewną.
- Wykonanie niewielkiego nacięcia w otrzewnej w celu odsłonięcia nerki. Utrzymanie małego nacięcia ułatwi uniesienie i ekspozycję nerki.
- Wywierając lekki nacisk po obu stronach nacięcia, delikatnie wypchnąć nerkę na zewnątrz ciała myszy.
- Utrzymywać nerkę w stanie wilgotnym, aplikując sól fizjologiczną za pomocą patyczka z watką.
- Używając igły do strzykawki o rozmiarze 23 lub 25 G, wykonać niewielkie nacięcie w prawym boku nerki, tworząc ubytek w torebce nerki; nacięcie nie powinno być zbyt głębokie ani zbyt duże.
Przeszczepianie wysepek
Uwaga: Podczas przygotowywania myszy do Tx, druga osoba powinna przygotować strzykawkę Hamiltona z napędem śrubowym do przeszczepu wysepek.
- Powoli zdejmij silikonową rurkę adaptacyjną z rurki PE50, utrzymując zagięcie w rurce.
- Włóż przeciwległy koniec rurki PE50 do silikonowej rurki adaptacyjnej, a następnie nałóż silikonową rurkę adaptacyjną na końcówkę pipety przymocowaną do szklanej strzykawki Hamiltona z napędem śrubowym. Powoli puść zagięcie w rurce PE50, upewniając się, że wyspy nie wyciekają.
- Powoli przesuń wyspy do końcówki rurki PE50 za pomocą mechanizmu śrubowego, pozostawiając niewielki pęcherzyk powietrza przed wyspami w rurce PE50.
- Przez nacięcie wykonane w nerce ostrożnie wsuń rurkę PE50 pod torebkę, tworząc niewielką kieszonkę. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić miąższu nerki ani nie przebić torebki.
- Pomocne jest utrzymywanie wilgotności obszaru i torebki za pomocą patyczka bawełnianego nasączonego roztworem soli fizjologicznej z gentamycyną; sucha torebka łatwo ulega rozerwaniu.
- Delikatnie przesuwaj rurkę we wszystkich kierunkach, tworząc „kieszonkę”, w której spoczną przeszczepione wyspy. Pamiętaj o ponownym naniesieniu soli fizjologicznej, aby utrzymać wilgotność obszaru.
- Pod kierownictwem osoby, która otworzyła mysz i umieściła rurkę PE50 pod torebką nerki, druga osoba (która przygotowała mysz i strzykawkę Hamiltona do transplantacji) będzie powoli wprowadzać wyspy pod torebkę, do wnętrza „kieszonki”, za niewielkim pęcherzykiem powietrza dostarczanym przez rurkę PE50, aż wszystkie wyspy zostaną przeszczepione.
- Powoli usuń rurkę PE50, osusz obszar suchym patyczkiem i ostrożnie wypal nacięcie przy użyciu niskiej temperatury.
- Używając suchego patyczka bawełnianego, upewnij się, że krwawienie ustało. Po ustąpieniu krwawienia ponownie zwilż nerkę sterylną solą fizjologiczną i delikatnie umieść nerkę z powrotem w otrzewnej przed zamknięciem powłok myszy za pomocą szwów i zszywek skórnych.
Zamykanie/Rewitalizacja myszy
- Zamknąć otrzewną szwem ciągłym, używając jedwabnych nici 5-0 z igłą C-6 19mm.
- Za pomocą pęsety zbliżyć oba brzegi nacięcia skóry.
- Zzić skórę, używając 2 lub 3 zszywek.
- Oczyścić skórę myszy z krwi, używając patyczka z watką i soli fizjologicznej.
- Natychmiast podać myszy podskórnie iniekcję z Flunixin i Buprenorphine.
- Umieścić mysz w klatce, która znajduje się na macie grzewczej lub pod lampą grzewczą, aż do momentu pełnej aktywności zwierzęcia.
- Usunąć zszywki skórne po 2 tygodniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół przedstawia praktyczną i wydajną opcję czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową u myszy z cukrzycą lub myszy zdrowych. Technika zagęszczania i pelletowania wysepek lub komórek w końcowej rurce dostarczającej (PE50), używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową, oferuje prostą i skuteczną metodę przeszczepiania komórek, ograniczając jednocześnie zbędny stres dla komórek oraz myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Centrum Cukrzycy UCSF. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rękawiczki chirurgiczne | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Gąbki do mycia chirurgicznego | Moore Medical | 42940AK | |
| Pincety | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 z ząbkami, 2 proste |
| Nożyczki preparacyjne n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Maszynka Oster (ostrze nr 40) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| Sterylne gaziki 4x4 | Moore Medical | 08252AK | |
| Gaziki z jodopowidonie | Moore Medical | 08486AK | |
| Gaziki alkoholowe | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Podkładka grzewcza | Moore Medical | 42508AK | |
| Igły 23G lub 25G | długość 1" | ||
| Roztwór Cidex | Moore Medical | 07535AK | do czyszczenia/dezynfekcji narzędzi |
| Przewody polietylenowe PE50 | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Roztwór Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Przewody silikonowe | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Sterylizator do narzędzi | Moore Medical | 39074AK | |
| Proste końcówki do pipet | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterylne |
| Strzykawka szklana z napędem śrubowym | Hamilton Co | 1001 | |
| Narzędzie do kauteryzacji | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Igłotrzymacz | Moore Medical | 41-067 | |
| Jedwab 5-0 | LOOK Surgical | 754B | do szwów (6-C) |
| Patyczek z bawełnianym końcem | Moore Medical | ||
| Zszywarka autoclip 9mm | BD Biosciences | 7630 | |
| Zszywki 9mm | BD Biosciences | 7631 | |
| Ekstraktor zszywek 9mm | BD Biosciences | 7637 |
Bibliografia
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
