Artykuł metodologiczny

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

24.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4054

⸱

30 grudnia 2012

 ,  ,  , 
1National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, University of Mississippi, 2Department of Pharmacology, University of Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Streszczenie

Lejszmanioza jest jedną z najbardziej zaniedbanych chorób na świecie, dotykającą głównie najuboższych mieszkańców krajów rozwijających się. Szacuje się, że ponad 350 milionów ludzi jest narażonych na zarażenie lejszmaniozą, a każdego roku odnotowuje się około 2 milionów nowych przypadków1.Leishmania donovani jest czynnikiem etiologicznym lejszmaniozy trzewnej (VL), czyli najbardziej śmiertelnej postaci tej choroby. Wybór leków dostępnych w leczeniu lejszmaniozy jest ograniczony 2; obecne metody terapii wykazują ograniczoną skuteczność, a wiele z nich jest toksycznych w dawkach terapeutycznych. Ponadto większość leków stosowanych w pierwszej linii leczenia utraciła już swoją użyteczność z powodu rosnącej wielolekooporności 3. Obecny potencjał nowych leków przeciwlejszmanialnych jest również poważnie wyczerpany. Konieczne są stałe wysiłki w celu wzbogacenia procesu odkrywania nowych leków przeciwlejszmanialnych, a przedsięwzięcie to opiera się na dostępności odpowiednich modeli przesiewowych in vitro.

In vitro testy na promastigotach 4 oraz aksenicznych amastigotach5 są wykorzystywane głównie do przesiewania leków przeciwleiszmanialnych, jednak mogą być nieodpowiednie ze względu na znaczące różnice komórkowe, fizjologiczne, biochemiczne i molekularne w porównaniu z amastigotami wewnątrzkomórkowymi. Testy z wykorzystaniem modeli makrofag-amastigota są uważane za najbliższe warunkom patofizjologicznym leiszmaniozy, a tym samym za najodpowiedniejsze do przesiewania in vitro. Zróżnicowane, niedzielące się ludzkie komórki ostrej białaczki monocytowej (THP1) stanowią atrakcyjną alternatywę dla izolowanych makrofagów pierwotnych i mogą być wykorzystywane do badania aktywności przeciwleiszmanialnej różnych związków przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy test ratowania i transformacji pasożyta z wykorzystaniem zróżnicowanych komórek THP1 zainfekowanych in vitro z Leishmania donovani do przesiewania czystych związków oraz ekstraktów z produktów naturalnych i określania ich skuteczności przeciwko wewnątrzkomórkowym Leishmania amastigoty. Analiza obejmuje następujące etapy: (1) różnicowanie komórek THP1 w niedzielące się makrofagi, (2) zakażanie makrofagów za pomocą L. donovani promastigoty metacykliczne, (3) traktowanie zakażonych komórek badanymi lekami, (4) kontrolowana liza zakażonych makrofagów, (5) uwalnianie/odzysk amastigot oraz (6) transformacja żywych amastigot w promastigoty. Metodę optymalizowano poprzez zastosowanie detergentu do kontrolowanej lizy Leishmaniazainfekowane komórki THP1, aby osiągnąć niemal całkowite odzyskanie żywotnych amastygot wewnątrzkomórkowych przy minimalnym wpływie na ich zdolność do transformacji w promastygoty. Przetestowano różne stosunki makrofagów do promastygot w celu uzyskania maksymalnego stopnia infekcji. Ilościowe określenie infekcji przeprowadzono poprzez transformację żywych, odzyskanych Leishmania amastygoty w promastygoty oraz ocena ich wzrostu za pomocą fluorometrycznego testu alamarBlue w mikropłytkach 96-dołkowych. Test ten jest porównywalny z obecnie stosowanymi metodami opartymi na analizie mikroskopowej, transgenicznych genach reporterowych oraz analizie obrazu cyfrowego. Metoda ta jest wiarygodna i mierzy wyłącznie żywe wewnątrzkomórkowe amastygoty, w przeciwieństwie do testów z genami reporterowymi i analizy obrazu, które mogą nie odróżniać amastygot żywych od martwych. Ponadto test został zwalidowany z wykorzystaniem aktualnego panelu leków przeciwleiszmaniowych i z sukcesem zastosowano go w wielkoskalowym przesiewie czystych związków oraz biblioteki frakcji produktów naturalnych (Tekwani i wsp. (nieopublikowano).

Protokół

1. Utrzymanie i pasażowanie hodowli komórek THP1

  1. Hodować komórki THP1 w medium RPMI-1640 (z 10% FBS i pH 7.4) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
  2. Przeprowadzać pasaż komórek dwa razy w tygodniu, aby zapobiec przekroczeniu liczby komórek 1x106 cells/ml. Jest to istotne dla zachowania ich zdolności do transformacji.

2. Prowadzenie i pasażowanie hodowli promastigotów Leishmania donovani

  1. Utrzymywać promastigoty L. donovani (S1, szczep sudan) w pożywce RPMI-1640 (bez wodorowęglanu sodu i pirogronianu sodu) z dodatkiem 10% FBS w temperaturze 26 °C.
  2. Przeprowadzać pasaż promastigot L. donovani dwa razy w tygodniu, utrzymując maksymalne stężenie komórek w zakresie 20-25x106 promastigotes/ml. Uwaga: Wszystkie pożywki i roztwory należy doprowadzić do temperatury pokojowej przed użyciem.

3. Wysiew i różnicowanie komórek THP1 w mikropłytce 96-dołkowej i szklanym preparacie hodowlanym z 16 komorami.

  1. Przygotować rozcieńczoną hodowlę THP1 o zagęszczeniu 2,5x105 komórek/ml z czterodniowej hodowli komórkowej (zagęszczenie nie powinno przekraczać 106 komórek/ml) w pożywce RPMI-1640 z 10% nieaktywną termicznie FBS. Przygotować 20 ml hodowli dla każdej płytki 96-dołkowej oraz 4 ml hodowli dla każdego szkiełka z 16 komorami.
  2. Do rozcieńczonej zawiesiny hodowli komórkowej dodać phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (w celu różnicowania THP1) (10 μl/20 ml hodowli ze stoku 50 μg/ml w DMSO) (końcowe stężenie PMA w rozcieńczonej hodowli komórek powinno wynosić 25 ng/ml).
  3. Aby porównać Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay oraz Parasite-Rescue-Transformation-Assay, przygotować oba testy jednocześnie w przezroczystej płytce 96-dołkowej z płaskim dnem oraz szklanym mikroskopowym szkiełku z 16 komorami.
  4. Przenieść 200 μl komórek THP1 traktowanych PMA do każdego dołka lub komory.
  5. Inkubować płytki 96-dołkowe oraz szkiełka z 16 komorami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc, aby umożliwić niemal całkowite różnicowanie komórek.

Uwaga: Komórki THP1, które zazwyczaj rosną w zawiesinie, są różnicowane do adherentnych makrofagów.

4. Zakażanie przekształconych komórek THP1 promastigotami Leishmania donovani

  1. W celu zakażenia hodowli zróżnicowanych komórek THP1 promastigotami Leishmania donovani, większość pasożytów powinna znajdować się w infekcyjnym stadium metacyklicznym (długie formy cylindryczne, hodowla w wieku ok. 5-6 dni).
  2. Stosunek komórek THP1 do pasożytów 1:10 jest optymalny dla zakażenia zarówno w teście Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay, jak i w teście Promastigote-Rescue-Transformation-Assay.
  3. Z hodowli w wieku od 5 do 6 dni w medium RPMI-1640 z 2% FBS przygotować rozcieńczoną hodowlę promastigot L. donovani o stężeniu 2.5x106 parasite/ml (dla stosunku komórek THP1 do pasożytów = 1:10).
  4. Z etapu 3.5 (po nocnym różnicowaniu hodowli komórek THP1) wyjąć płytki i szkiełka komorowe, usunąć medium i jednokrotnie przemyć hodowle komórkowe medium RPMI-1640 bez surowicy.
  5. Po ostrożnym przemyciu komórek THP1 traktowanych PMA ciepłym medium RPMI-1640 (~37 °C) bez surowicy, zastąpić medium bezsurowicze 200 μl rozcieńczonej hodowli promastigot L. donovani (2.5x106 parasites/ml) z etapu 4.3. Na każdej płytce i szkiełku komorowym z 16 komorami przygotować studzienki kontrolne z komórkami THP1 bez pasożytów oraz z pasożytami bez komórek THP1.
  6. Po dodaniu pasożytów do hodowli komórek THP1 inkubować płytkę i szkiełka w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 przez 24 hr, aby umożliwić zainfekowanie zróżnicowanych komórek THP1 przez pasożyty.

5. Leczenie zainfekowanych makrofagów badanymi lekami/związkami

  1. W ramach screeningu przetestować Amfoterycynę B, Pentamidynę i Miltefosynę jako standardowe leki przeciwleiszmaniowe. Przygotować roztwory zapasowe leków/związków testowych w wodzie lub DMSO, zgodnie z tabelą odczynników. Każdy związek leku przetestować w 6 stężeniach.
  2. Wykonać rozcieńczenia seryjne (1:5) standardowych leków i związków testowych na nowej płytce 96-dołkowej lub w probówkach 2 ml (w przypadku szkiełek z komorami), stosując medium RPMI-1640 z 2% FBS. Stężenia leków/związków testowych na tej płytce stanowią 2X stężeń końcowych.
  3. Płytki hodowlane i szkiełka z komorami zainfekowane promastigotami L. donovani (z kroku 4.5) przemyć co najmniej 5 razy medium RPMI-1640 bez surowicy. Do każdego dołka/komory dodać 100 μl medium hodowlanego (RPMI-1640 z 2% FBS). Wielokrotne przemywanie jest niezbędne, aby zapewnić całkowite usunięcie niezinternalizowanych promastigot.
  4. Do każdego dołka lub komory dodać 100 μl medium z seryjnie rozcieńczonymi standardowymi lekami przeciwleiszmaniowymi lub związkami testowymi. Równocześnie na każdej płytce/szkiełku z komorami przygotować kontrole z zainfekowanymi komórkami THP1 bez dodatku leków.
  5. Inkubować płytki i szkiełka z komorami w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez 48 hr.

6. Barwienie preparatów na szkiełkach z komorami, obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym oraz analiza obrazu w celu kwantyfikacji infekcji i efektu leczenia lekiem

  1. Po 48-godzinnej inkubacji wypłucz slajd z komorą 3 razy pożywką RPMI-1640 bez surowicy. Odklej plastikowe komory od slajdów i utrwal komórki, zanurzając slajdy w metanolu na 30 sec. Pozostaw slajdy w dygestorium pod przepływem powietrza do wyschnięcia.
  2. Przygotuj roztwór barwiący SYBR Green I (5X), rozcieńczając zapas (10,000X) wodą w stosunku (1:2,000).
  3. Barw slajdy w ciemności za pomocą rozcieńczonego roztworu SYBR Green I przez 15 min w temperaturze pokojowej, wypłucz raz wodą i pozostaw slajdy pod przepływem powietrza do wyschnięcia.
  4. Na zbarwiony slajd nałóż pełne szkiełko nakrywkowe za pomocą medium montującego.
  5. Wykonaj zdjęcia cyfrowe komórek THP1: bez infekcji (blank), z infekcją (kontrola) oraz zainfekowanych komórek traktowanych różnymi lekami standardowymi lub związkami testowymi w różnych rozcieńczeniach (Rycina 3, 5 oraz 6), używając mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse 90i wraz z oprogramowaniem NIS element AR 3.2.
  6. Policz jądra makrofagów (duże) i jądra pasożytów (małe z kinetoplastem) przy użyciu programu ImageJ (Rycina 7), który jest ogólnodostępnym programem do przetwarzania obrazów opartym na języku Java, opracowanym w National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Przedstaw dane jako liczbę amastigot na 100 przekształconych komórek THP1.

7. Test ratowania i transformacji pasożytów: kontrolowana liza makrofagów zainfekowanych amastygotami L. donovani

  1. Płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową z kroku 5.5 przemyć trzykrotnie pożywką hodowlaną RPMI-1640 bez surowicy.
  2. Spośród różnych detergentów testowanych w różnych stężeniach, traktowanie 0,05% SDS przez 30 s jest optymalne dla kontrolowanej lizy (maksymalna liza komórek przy minimalnej utracie żywotności odzyskanych pasożytów).
  3. Po ostatnim przemywaniu usunąć pożywkę bez surowicy z każdego dołka i dodać do każdego dołka 20 μl RPMI-1640 (z 0,05% SDS). Wstrząsać płytką przez 30 s, a następnie dodać do każdego dołka 180 μl pełnej pożywki RPMI-1640 (z 10% FBS).
  4. Inkubować płytki w temperaturze 26 °C przez 48 h w celu transformacji odzyskanych amastygot w promastygoty.

8. Analiza ilościowa przekształconych promastigot (test alamarBlue)

  1. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 26 °C wszystkie odzyskane żywe amastigoty przekształcają się w promastigoty (Rycina 1D). Do każdego dołka płytek 96-dołkowych należy dodać 10 μl odczynnika alamarBlue.
  2. Płytki inkubować w temperaturze 26 °C przez noc.
  3. Po nocnej inkubacji odczytać standardową fluorescencję z płytek za pomocą fluorymetru Fluostar Galaxy (BMG Lab Technologies) przy pobudzeniu 544 nm i emisji 590 nm.
  4. Przygotować krzywe zależności odpowiedzi od dawki (procent wzrostu względem stężenia leku lub związku testowanego) w programie ExcelFit (Ryciny 7-9) i na podstawie tych krzywych obliczyć wartości IC50/IC90 (Tabela 1).

9. Standaryzacja stosunku komórek THP1 do pasożytów

  1. Zoptymalizuj stosunek komórek THP1 do pasożytów, aby określić czułość testu. Uwaga: Zbyt niska lub zbyt wysoka liczba pasożytów/poziom zakażenia mogą negatywnie wpłynąć na czułość i selektywność przesiewu.
  2. Zoptymalizuj stosunek komórek THP1 do pasożytów, postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem wysiewania komórek THP1 i zakażania promastigotami Leishmania (sekcje 3 i 4), z wyjątkiem zastosowania różnych stosunków komórek THP1 do pasożytów, takich jak 1:1,25, 1:2,5, 1:5 i 1:10.
  3. Przygotuj eksperyment zarówno w formacie szkiełka 16-komorowego (do analizy obrazu), jak i płytki 96-dołkowej (do testu ratowania pasożytów), aby porównać wyniki testu ratowania pasożytów oraz analizy obrazu.

10. Standaryzacja różnych detergentów w celu kontrolowanej lizy komórek

  1. Głównym celem tego eksperymentu jest optymalizacja protokołu kontrolowanej lizy komórek THP1 w celu osiągnięcia maksymalnej/całkowitej lizy komórek THP1 bez istotnego wpływu na żywotność odzyskanych pasożytów w stadium amastigota.
  2. Przetestować różne detergenty, takie jak Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 oraz SDS, przy różnych stężeniach i różnych czasach trwania zabiegu (Rysunek 2).
  3. Stosunek komórek THP1 do pasożytów wynosi 1:10, a pozostałe warunki są analogiczne do opisanych w powyższych sekcjach 1-8.
  4. Dalsze przetestowanie zabiegu z użyciem 0,05% SDS dla różnych czasów trwania w celu dalszej optymalizacji kontrolowanej lizy komórek.

Wyniki

Przeprowadzono analizę ilościową dla metody Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay oraz Parasite-Rescue-Transformation-Assay w odstępach 24, 48, 72 i 96 hr po zastosowaniu leku

W metodzie bezpośredniego liczenia stopień zakażenia makrofagami zakażonymi L. donovani (komórki THP1) obliczano według następującego równania:

Wzór na ilościowe określenie amastigot do analizy liczby komórek; stosunek jąder w komórkach THP1.

Liczba amastigotów (wyznaczona poprzez zliczenie jąder amastigotów)/100 przekształconych komórek THP1 (wyznaczona poprzez zliczenie jąder komórek THP1) (Rysunek 7) jest dokładniejszą miarą do analizy wpływu różnych związków wzorcowych lub testowych niż procent zainfekowanych komórek THP1, o którym wspomniano w niektórych wcześniejszych publikacjach, ponieważ liczba ta jest bezpośrednio powiązana z ogólnym efektem związków, przejawiającym się albo poprzez zmniejszenie liczby pasożytów w makrofagach, albo całkowite usunięcie pasożyta z komórek makrofagów. Stopień infekcji obliczono na podstawie cyfrowych obrazów zainfekowanych komórek THP1 traktowanych różnymi lekami wzorcowymi w różnych rozcieńczeniach przez różne odstępy czasu (Rysunek 10 oraz Tabela 1). Odczytem dla testu Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay była liczba infekcji amastigotami/100 przekształconych komórek THP1, natomiast odczytem dla testu Parasite-Rescue-Transformation-Assay były względne jednostki fluorescencji (RFU), które są wprost proporcjonalne do liczby żywych amastigotów Leishmania odzyskanych z zainfekowanych makrofagów i przekształconych w promastigoty. Test alamarBlue jest rutynowo stosowany do przesiewania leków przeciwleiszmanialnych wobec promastigotów Leishmania.

Test został początkowo znormalizowany i zoptymalizowany pod kątem kontrolowanej lizy komórek THP1 zainfekowanych Leishmania. Celem była optymalizacja warunków obróbki detergentem, aby uzyskać niemal całkowitą lizę komórek THP1 przy minimalnym wpływie na żywotność odzyskanych amastigot. Rycina 1 przedstawia mikroskopowy widok pełnego protokołu testu. Nienaruszone komórki THP1 zainfekowane amastigotami Leishmania widoczne są na Rycini 1A. Rycina 1B pokazuje lizę komórek THP1 po obróbce detergentem. Rycina 1C przedstawia odzyskane amastigoty Leishmania, które zostały częściowo przekształcone w promastigoty, a Rycina 1D pokazuje niemal całkowitą transformację amastigot w promastigoty i ich późniejszą proliferację. Wzrost tych przekształconych promastigot można monitorować ilościowo poprzez dodanie alamarBlue i pomiar fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek. Obróbka NP-40 (Rycina 2A) oraz Triton X-100 (Rycina 2B) doprowadziła do lizy zainfekowanych komórek THP1, jednak wpłynęła również na żywotność i transformację odzyskanych amastigot. Obróbka Tween 20 (Rycina 2C) oraz Tween 80 (Rycina 2D) nie spowodowała optymalnej lizy komórek THP1, co skutkowało niepełnym odzyskaniem amastigot, na co wskazywała niska liczba przekształconych promastigot. Obróbka 0,05% SDS przez 30 s (Rycina 2E) przyniosła niemal całkowitą lizę komórek THP1 zainfekowanych Leishmania i nie wpłynęła na żywotność oraz transformację odzyskanych amastigot. Dalsza optymalizacja wykazała, że obróbka komórek 0,05% SDS przez 20-30 s pozwoliła na najwyższy odzysk żywych amastigot Leishmania (Rycina 2F). W kolejnych eksperymentach stosowano obróbkę 0,05% SDS przez 30 s. Procedura obróbki SDS jest taka sama dla pojedynczych lub wielu płytek. W przypadku wielu płytek obróbka SDS była przeprowadzana kolumna po kolumnie za pomocą pipety wielokanałowej. Pożywkę bez surowicy usuwano ze wszystkich 8 studzienek jednej kolumny płytki, następnie do 8 studzienek tej samej kolumny dodawano 20 μl 0,05% SDS i po 30 s rozcieczano za pomocą RPMI-1640 z 10% FBS. Podczas wstępnej normalizacji testu płytki sprawdzano pod mikroskopem w celu wykrycia nieinternalizowanych promastigot. Aby usunąć pasożyty przed krokiem 5 (obróbka zainfekowanych komórek makrofagów związkami standardowymi), konieczne było co najmniej pięć płukań, a przed krokiem 7 (obróbka SDS) konieczne były trzy płukania. W ten sposób komórki płukano 8 razy i przed kontrolną lizą zainfekowanych komórek THP1 nie pozostały żadne widoczne nieinternalizowane promastigoty.

Cyfrowa analiza obrazu i bezpośrednie liczenie

Obrazy cyfrowe komórek THP1 zainfekowanych Leishmania zostały zarejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse 90i po barwieniu SYBR Green I. Zarówno jądra makrofagów, jak i wewnątrzkomórkowe jądra Leishmania z charakterystycznym DNA kinetoplastu były widoczne pod filtrami fluorescencyjnymi (Rysunek 3). Ponadto obrazy zainfekowanych komórek THP1 zarejestrowano również w trybie DIC. Po nałożeniu obu obrazów zarysy komórek THP1 z wewnątrzkomórkowymi amastigotami stały się bardziej wyraźne (Rysunek 4). Do analizy tych obrazów wykorzystano oprogramowanie ImageJ. ImageJ to program do przetwarzania obrazów oparty na języku Java, będący w domenie publicznej, opracowany w National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). ImageJ został zaprojektowany z otwartą architekturą, która zapewnia rozszerzalność poprzez wtyczki Java i nagrywalne makra. Niestandardowe wtyczki do akwizycji, analizy i przetwarzania mogą być tworzone przy użyciu wbudowanego edytora ImageJ i kompilatora Java. W celu przeprowadzenia różnicowego liczenia jąder komórek THP1 i jąder pasożytów w programie ImageJ, otwarto obraz w ImageJ. Narzędzie Cell counter znaleziono w opcji Analyze w wtyczkach oprogramowania. Obraz został zainicjowany, a następnie wybrano typ licznika 1 dla jąder komórek THP1 oraz typ licznika 2 dla jąder pasożytów (Rysunek 3). Liczenie różnicowe przeprowadzono dla co najmniej 200 jąder komórek THP1 oraz znajdujących się w nich wewnątrzkomórkowych amastigot. Porównano metodę testu ratowania pasożytów (parasite-rescue assay) oraz metodę analizy obrazu w celu oceny zakaźności komórek THP1 przy różnych stosunkach makrofagów do promastigot (Rysunek 4). Rysunek 5 przedstawia różnice w zakaźności komórek THP1 przy różnych stosunkach makrofagów do promastigot. Obie metody wykazały porównywalne wyniki, a stosunek makrofagów do promastigot 1:10 zapewnił optymalną i powtarzalną zakaźność.

Po zoptymalizowaniu warunków testu ratowania/transformacji pasożytów oraz cyfrowej analizy obrazu, oceniono użyteczność tych metod w przesiewaniu leków przeciwleiszmanialnych. Komórki THP1 zainfekowane Leishmania poddano działaniu różnych stężeń standardowych leków przeciwleiszmanialnych, a mianowicie amfoterycyny B, pentamidyny i miltefosyny, przez różne przedziały czasowe od 24 do 96 hr. Eksperyment w ramach testu ratowania/transformacji pasożytów przeprowadzono w trzech powtórzeniach, natomiast eksperyment z wykorzystaniem metody bezpośredniego liczenia komórek przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Rycina 6 przedstawia obrazy mikroskopowe niezinfekowanych komórek kontrolnych, zinfekowanych komórek kontrolnych nieleczonych oraz zainfekowanych Leishmania i leczonych komórek THP1. Krzywe zależności efektu od dawki przygotowano na podstawie testu ratowania i transformacji pasożytów (stężenie leku względem przekształconych pasożytów) oraz testu analizy obrazu (liczba amastygotów/100 komórek THP1) (Ryciny 7-9). Wartości IC50 leków obliczono za pomocą programu ExcelFit i przedstawiono w Tabeli 1. Metoda analizy cyfrowego obrazu z bezpośrednim liczeniem oraz test ratowania/transformacji pasożytów wykazały porównywalne wyniki. Analiza cyfrowego obrazu z bezpośrednim liczeniem była mniej optymalna w wczesnych punktach czasowych leczenia lekami (24 i 48 hr), podczas gdy test ratowania/transformacji pasożytów wykazał wyniki bardziej spójne z wartościami raportowanymi we wszystkich punktach czasowych w okresie od 24 do 96 hr po zastosowaniu leków. Ta różnica w wynikach między analizą cyfrowego obrazu z bezpośrednim liczeniem a testem ratowania/transformacji pasożytów może wynikać z obecności nieżywotnych amastygotów podczas wczesnych etapów leczenia lekiem w przypadku analizy cyfrowego obrazu z bezpośrednim liczeniem.

Etapy procesu komórkowego; obrazy mikroskopowe A-D: przed lizą, po lizie, transformacja, proliferacja.
Rycina 1. Mikroskopowy obraz odzyskiwania amastigot Leishmania donovani i ich transformacji w promastigoty. A - Adherentne komórki THP1 zainfekowane amastigotami Leishmania; B - Adherentne, zainfekowane komórki THP1 po kontrolowanej lizie C - Transformowane promastigoty Leishmania donovani powstałe z amastigot odzyskanych z zainfekowanych makrofagów THP1 D - Wzrost i proliferacja transformowanych promastigot Leishmania donovani.

Wpływ działania detergentów na RFU; wykresy słupkowe dla NP40, Triton X100, Tween 80, SDS w komórkach THP1.
Rycina 2. Optymalizacja kontrolowanej lizy zakażonych komórek THP1 w celu maksymalnego odzyskania żywych amastigot Leishmania donovani i ich transformacji w promastigoty. Analiza lizy komórek THP1 i odzyskiwania amastigot z zakażonych Leishmania komórek THP1 przy użyciu różnych detergentów. Przetestowano dwa stężenia detergentu (0,05% i 0,1%) oraz dwa okresy czasu ekspozycji (30 s i 60 s). RFU = względne jednostki fluorescencji. Każdy słupek reprezentuje średnią z pomiarów powtórzonych. [A] Obróbka NP-40 spowodowała lizę komórek THP1, a także wpłynęła na żywotność odzyskanych pasożytów w stadium amastigoty. [B] Obróbka Triton X-100 spowodowała lizę komórek THP1, a także wpłynęła na żywotność odzyskanych pasożytów w stadium amastigoty [C] Tween 80 spowodował częściową lizę komórek THP1 w celu odzyskania amastigot.[D] Tween 80 spowodował częściową lizę komórek THP1 w celu odzyskania amastigot. [E] Obróbka SDS spowodowała niemal całkowitą lizę komórek THP1 i nie wpłynęła na żywotność odzyskanych amastigot przy 0,05%/30 s. [F] Obróbka 0,05% SDS przez 20-30 s spowodowała niemal całkowitą lizę komórek THP1 i pozwoliła na odzyskanie żywotnych amastigot pasożyta do ich transformacji w promastigoty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Mikroskopia fluorescencyjna rozkładu kDNA i pN w komórkach; podkreślenie komponentów jądrowych.
Rysunek 3. Cyfrowy obraz fluorescencyjny zróżnicowanej komórki THP1 zainfekowanej in vitro amastygotami Leishmania donovani. Charakterystyczne kDNA jest widoczne przy każdym jądrze pasożyta. Jądro makrofaga (mN) (1) oraz jądra pasożytów (pN) (2) mogą być różnicowo znakowane i przeliczane za pomocą oprogramowania analitycznego ImageJ w celu ilościowej oceny infekcji. Kwantyfikację określono jako liczbę amastygot/100 komórek THP1.

Wykresy słupkowe przedstawiające wpływ stosunku makrofagów do promastigot na RFU oraz liczbę amastigot na 100 makrofagów.
Rycina 4. Porównanie analizy obrazu cyfrowego z bezpośrednim liczeniem (dolny panel) oraz testu transformacji z odzyskiwaniem pasożytów (górny panel). Stosunek makrofagów do promastigot wynoszący 1:10 zapewnił optymalną infekcję. Obie metody wykazały porównywalne wyniki. Test odzyskiwania pasożytów wykazał pewne wartości tła. Każdy słupek przedstawia średnią z wartości powtórzonych.

Panele A-E testu infekcji komórek THP1, wyniki mikroskopii fluorescencyjnej, przedstawiono stosunki pasożytów do komórek.
Rycina 5. Komórki THP1 zainfekowane promastigotami Leishmania przy różnych stosunkach THP1:promastigota. Wyniki ilościowe w postaci liczby amastigot/100 komórek THP1 przedstawiono na Rycini 4.

Test żywotności komórek THP1, wpływ leków w czasie, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, porównanie 24-96 h.
Rycina 6. Obrazy cyfrowe (fluorescencyjne + DIC) komórek THP1 zainfekowanych amastigotami Leishmania donovani po leczeniu standardowymi lekami przeciwleiszmanialnymi przez różne okresy czasu. Wyniki ilościowo określono jako liczbę amastigot/100 komórek THP1 i wykorzystano do obliczenia procentowego wzrostu w porównaniu z kontrolami nieleczonymi oraz do wyznaczenia wartości IC50.

Wykresy testu stężenia amfoterycyny B względem % wzrostu; odpowiedź na dawkę, obliczanie IC50.
Rysunek 7. Porównanie testu bezpośredniego liczenia za pomocą cyfrowej analizy obrazu (Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay) i testu transformacji ratunkowej pasożytów (Parasite-Rescue-Transformation-Assay) w przesiewaniu leków przeciwleiszmanialnych (amfoterycyna B). Zainfekowane makrofagi traktowano różnymi stężeniami standardowego leku przeciwleiszmanialnego przez różne okresy czasu. Wartości IC50 (μg/ml) obliczono z krzywej odpowiedzi na dawkę za pomocą programu Excelfit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wykres zależności odpowiedzi od dawki pentamidyny; testy liczenia obrazów/ratowania pasożytów; % wzrostu względem stężenia
Rycina 8. Porównanie testu bezpośredniego liczenia z analizą obrazu cyfrowego oraz testu transformacji ratującej pasożyty w badaniach przesiewowych leków przeciwleiszmaniowych (pentamidyna). Zainfekowane makrofagi traktowano różnymi stężeniami standardowego leku przeciwleiszmaniowego przez różne okresy czasu. Wartości IC50 (μg/ml) obliczono z krzywych zależności odpowiedzi od dawki za pomocą programu Excelfit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Wykresy efektów miltefozyny; stężenie vs. % wzrostu; testy ratowania pasożytów; dane naukowe.
Rycina 9. Porównanie testu bezpośredniego zliczania za pomocą cyfrowej analizy obrazu (Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay) oraz testu transformacji z ratowaniem pasożytów (Parasite-Rescue-Transformation-Assay) w przesiewaniu leków przeciwleiszmanialnych (miltefozyna). Zainfekowane makrofagi poddano działaniu różnych stężeń standardowego leku przeciwleiszmanialnego przez różne okresy czasu. Wartości IC50 (μg/ml) obliczono z krzywych zależności efektu od dawki za pomocą programu Excelfit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Testowany lek24 hra48 hra72 hra96 hra
IACAbPRTAcIACAbPRTAcIACAbPRTAcIACAbPRTAc
Amphotericin B0.24± 0.030.17± 0.01*0.12± 0.040.20± 0.070.06± 0.010.06± 0.010.11± 0.030.10± 0.03
Pentamidine>102.55± 1.16*2.88± 0.581.43± 0.911.24± 0.351.52± 0.160.71± 0.630.98± 0.33
Miltefosine0.38± 0.020.19± 0.08*0.24± 0.060.30± 0.080.36±0.020.16± 0.060.21± 0.150.17± 0.10

Tabela 1. Porównanie testu analizy obrazu cyfrowego i bezpośredniego liczenia (Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay) oraz testu transformacji z odzyskiem pasożytów (Parasite-Rescue-Transformation-Assay) w przesiewaniu leków przeciwleiszmaniowych. Zainfekowane makrofagi traktowano różnymi stężeniami standardowego leku przeciwleiszmaniowego przez różne okresy czasu. Wartości IC50 (μg/ml) obliczono z krzywych zależności dawka-odpowiedź za pomocą programu Excelfit (Ryciny 7-9). aGodziny po podaniu leku; bIACA = Image Analysis and Direct Counting Assay; cPRTA = Parasite-Rescue and Transformation Assay. Podane wartości to IC50 (stężenie leku powodujące 50% zahamowanie wzrostu pasożytów) w μg/ml, przedstawione jako średnia ± S.D. z co najmniej trzech eksperymentów. * Istotność statystyczna (<0.05) w porównaniu z wartościami IC50 uzyskanymi w IACA.

Dyskusja

Dostępnych jest kilka metod przesiewowych w poszukiwaniu leków przeciwleiszmaniowych opartych na modelach makrofag-amastigota. Analizy można przeprowadzać z wykorzystaniem makrofagów pobranych od zwierząt gospodarzy, a mianowicie komórek wysięku otrzewnowego (PEC), monocytów krwi obwodowej (PBMC) 6 lub makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMM), bądź w liniach komórek monocytycznych, takich jak mysie (J774 i RAW264.7)7 oraz ludzkie (THP1, U937, HL-60)8 komórki monocytyczne. W przypadku analiz wykorzystujących dzielące się komórki gospodarza należy upewnić się, że uwzględniono zakłócający wpływ aktywności leku na liczbę zarówno pasożytów, jak i komórek gospodarza. Zróżnicowane makrofagi pierwotne pobierane z różnych źródeł, takich jak myszy i szczury, z natury nie dzielą się, jednak preparaty tych komórek mogą nie posiadać homogennych populacji komórkowych. Linie komórkowe pochodzące z komórek monocytycznych są z natury homogeniczne i stanowią lepszy model dla przesiewu opartego na układzie makrofag-amastigota. spośród różnych linii komórek monocytycznych, zróżnicowane komórki THP1 (ludzka linia komórkowa ostrej białaczki monocytycznej) mogą tworzyć niedzielącą się warstwę jednowarstwową, stanowiąc atrakcyjną alternatywę dla pierwotnych makrofagów izolowanych.

Przesiewanie oparte na układzie makrofag-amastygota może być przeprowadzone na kilka sposobów. Klasyczna ocena mikroskopowa oparta na bezpośrednim liczeniu komórek i pasożytów9 jest pracochłonna. Brak automatyzacji ogranicza użyteczność tego testu. Liczenie komórek jest czasochłonne i może prowadzić do niedokładnego wyznaczania wartości IC50, ponieważ określenie żywotności pasożytów za pomocą procedury barwienia jest trudne. W analizach cytometrycznych można zastosować wiele barwników fluorescencyjnych i przeciwciał monoklonalnych10, 11, jednak testy te są również ograniczone ze względu na mniejszą czułość oraz ograniczenie czasu ekspozycji na lek do zaledwie jednego dnia. Dostępnych jest kilka testów z genami reporterowymi do ilościowego oznaczania wzrostu wewnątrzkomórkowych amastygot12,13,14. Automatyczne przesiewanie może być możliwe dzięki zastosowaniu genów reporterowych, ale testy te również mają pewne wady. Po pierwsze, większość z nich wymaga selekcji lekiem w celu utrzymania episomalnej ekspresji genów reporterowych, co może nie być idealne w eksperymencie przesiewowym z lekami. Sposób wprowadzenia genu reporterowego może również wpływać na właściwości fizjologiczne pasożyta i mieć wpływ na wyniki przesiewania. Jeśli gen reporterowy jest częścią plazmidu episomalnego, względny sygnał reportera może zależeć od liczby kopii przetransfekowanego plazmidu (która różni się między komórkami), a nie od działania leku 14. Niektóre pasożyty reporterowe, będące formami transformowanymi, nie wymagają presji selekcyjnej do utrzymania genu reporterowego; mogą jednak wystąpić konsekwencje biologiczne wynikające z zaburzenia architektury genomu lub samej obecności obcych białek reporterowych 15. W niektórych testach opartych na genach reporterowych występują problemy z czułością i aktywnością tła 16. Co najważniejsze, wiele testów ekspresji genów reporterowych, zwłaszcza tych z genem reporterowym GFP15, może nie odróżniać żywych od martwych wewnątrzkomórkowych amastygot. Testy oparte na genie reporterowym lucyferazy mogą rozróżniać żywe i martwe wewnątrzkomórkowe amastygoty, ale substrat i bufor do lizy komórek stosowane w tych analizach są kosztowne w przypadku przesiewania na dużą skalę17. Aby wyeliminować te mankamenty i ograniczenia poprzednich testów przesiewowych opartych na układzie makrofag-amastygota, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy ninzy test ratowania i transformacji pasożytów. Test ten wykorzystuje komórki THP1, które charakteryzują się dobrą homogennością i niedzielą się, jako komórki gospodarza.

Opisany tutaj test Parasite-Rescue-Transformation-Assay jest porównywalny z testem opartym na cyfrowej analizie obrazu i bezpośrednim zliczaniu (Digital-Image-Analysis-Direct-Counting) wewnątrzkomórkowych amastigot. Mikroskopia fluorescencyjna i DIC, a także cyfrowa analiza obrazów za pomocą programu ImageJ w celu różnicowego zliczania jąder makrofagów i jąder pasożytów, pozwoliły na dalsze udoskonalenie metody zliczania mikroskopowego. Rejestrowanie obrazów przy użyciu filtrów światła fluorescencyjnego oraz filtrów kontrastu interferencyjnego (DIC) poprawiło jakość cyfrowych obrazów, co umożliwiło dokładniejsze zliczanie pasożytów wewnątrzkomórkowych. Obrazy fluorescencyjne i DIC można nakładać na siebie, aby uzyskać cyfrowe obrazy z wyraźnymi konturami komórek makrofagów oraz fluorescencyjnymi jądrami wewnątrzkomórkowymi. Jądra makrofagów i jądra pasożytów można różnicowo rozpoznawać za pomocą programu ImageJ. W związku z tym zarówno Digital-Image-Analysis-Direct-Counting-Assay, jak i Parasite-Rescue-Transformation-Assay mają potencjał do automatyzacji i zastosowania w przesiewach na dużą skalę. Krytycznymi etapami w teście Parasite-Rescue-Transformation-Assay są: (a) wielokrotne przemywanie kultur komórek THP1 po ekspozycji na promastigoty Leishmania, aby zapewnić niemal całkowite usunięcie niezinternalizowanych promastigot oraz (b) kontrolowana liza zakażonych komórek THP1 za pomocą SDS. Oba etapy mogą być również kontrolowane automatycznie i nie powinny wpływać negatywnie na wydajność testu. Drugi etap przemywania, po wystawieniu zakażonych Leishmania komórek THP1 na działanie badanych leków/związków, usuwa pozostałe niezinternalizowane pasożyty, jeśli takie występują. Test Parasite-Rescue-Transformation-Assay oferuje znaczące zalety w porównaniu z istniejącymi testami mikroskopowymi, genami reporterowymi i analizą obrazu. Test ten jest prosty, odporny i powtarzalny, może być zautomatyzowany do przesiewów na dużą skalę, a zatem powinien mieć istotne zastosowanie w badaniu dużych bibliotek związków w celu odkrycia nowych leków przeciwleiszmaniowych. Ponadto test ten może być stosowany do oceny zakaźności klinicznych, a także laboratoryjnych izolatów Leishmania in vitro.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Umowa naukowa NCNPR-USDA-ARS nr 58-6408-2-0009; grant CDMRP nr W81XWH-09-2-0093 przyznany przez U.S. Army Medical Research and Materiel Command.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetyan 12-mirystynian 13-octan forbolu (PMA)Sigma-Aldrich USAP1585Wymagany do różnicowania komórek THP1.
Pożywka RPMI-1640Invitrogen23400021
System szkiełek komorowych Lab-TeK (16 komór)Thermo Scientific Nunc178599
Przezroczyste płytki 96-dołkowe z płaskim dnemBD Falcon353075Płytki do przeprowadzenia analizy w płytce 96-dołkowej
Amfoterycyna BSigma-Aldrich USAA4888Standardowy lek przeciwleiszmaniowy rozpuszczony w DMSO (2 mg/ml)
Sól izotionianu pentamidynySigma-Aldrich USAP 0547Standardowy lek przeciwleiszmaniowy rozpuszczony w DMSO (2 mg/ml)
MiltefozynaEMD Biosciences USA475841Standardowy lek przeciwleiszmaniowy rozpuszczony w bezzserwatkowej pożywce RPMI-1640 (przygotować świeżą) (2 mg/ml)
Stiboglukonian soduEMD Biosciences USA567565Standardowy lek przeciwleiszmaniowy przygotowany w pożywce RPMI-1640 z 4% FBS. (1 mg/ml)
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich USAL 5750
Mikroskop fluorescencyjnyNIKONECLIPSE 90i
Fluorescencyjny czytnik mikropłytekBMGPolar Star Galaxy
Medium montażoweSigma-Aldrich USAM 1289
alamarBlueAbD SerotecBUF012 B
SYBR Green ISigma-Aldrich USAS 9430
Węglan soduFisher Sci.523500
Pirowinian soduSigma-Aldrich USAP2256
2-merkapto–etanolSigma-Aldrich USAM6250
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11050H
Tween 20Sigma-Aldrich USAP9416
Tween 80Sigma-Aldrich USAP6474
Triton X-100Sigma-Aldrich USAT8787
NP-40Calbiochem492016

Bibliografia

  1. WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
  2. Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
  3. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  4. Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
  5. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
  6. Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
  7. Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
  8. Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
  9. Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
  10. Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
  11. Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
  12. Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
  13. Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
  14. Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
  15. Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
  16. Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
  17. Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test ratowania pasożytówmakrofagi THP1wewnątrzkomórkowe amastygotykontrolowana lizatest AlamarBlueprzesiewanie lekówtransformacja amastygotanaliza obrazów mikroskopowychprzesiewanie produktów naturalnych
Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.