Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 (PD-L1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie

22.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

3 stycznia 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

B7-H1 (PD-L1) oraz jego wiązanie z PD-1 stanowią główny indukowany przez nowotwór sygnał immunosupresyjny w mikrośrodowisku guza. W niniejszym materiale opisano technikę barwienia immunohistochemicznego służącą do charakterystyki ekspresji i lokalizacji B7-H1 w gruczolakoraku trzustki.

Streszczenie

B7-H1/PD-L1, członek rodziny B7 białek powierzchniowych komórek o działaniu regulacyjnym w układzie odpornościowym, odgrywa istotną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi immunologicznej zależnej od komórek poprzez oddziaływanie z jego receptorem, PD-1 (programmed death-1) 1,2. Nadmierna ekspresja B7-H1 przez komórki nowotworowe została odnotowana w wielu rodzajach nowotworów u ludzi, w tym w czerniaku, glejakach oraz rakach płuca, piersi, jelita grubego, jajnika i komórek nerek, i wykazano, że upośledza ona przeciwnowotworową odporność limfocytów T3-8.

Niedawno stwierdzono, że ekspresja B7-H1 w tkankach gruczolakoraka trzustki może służyć jako potencjalny marker prognostyczny9,10. Ponadto wykazano, że blokada B7-H1 w mysim modelu raka trzustki wywołuje odpowiedź przeciwnowotworową11. Dane te sugerują, że B7-H1 jest istotnym, potencjalnym celem terapeutycznym. W związku z tym przeciwciała blokujące B7-H1 są testowane w badaniach klinicznych nad wieloma litymi guzami u ludzi, w tym czerniakiem oraz rakami płuc, jelita grubego, nerki, żołądka i trzustki12.

Aby w przyszłości móc zidentyfikować pacjentów, którzy odniosą korzyść z terapii celowanych w B7-H1, kluczowe jest zbadanie korelacji między ekspresją i lokalizacją B7-H1 a odpowiedzią pacjentów na leczenie przeciwciałami blokującymi B7-H1. Analiza ekspresji B7-H1 w tkankach ludzkiego gruczolakoraka trzustki za pomocą immunohistochemii pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób ta ko-inhibicyjna cząsteczka sygnałowa przyczynia się do supresji odporności przeciwnowotworowej w mikrośrodowisku guza. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne anty-B7-H1 (klon 5H1) opracowane przez Chena i współpracowników daje wiarygodne wyniki barwienia w kriosiekcjach wielu rodzajów ludzkich tkanek nowotworowych4,8, jednak barwienie preparatów zatopionych w parafinie stanowiło do niedawna wyzwanie13-18. Opracowaliśmy protokół barwienia B7-H1 dla preparatów tkanek gruczolakoraka trzustki zatopionych w parafinie. Opisany tutaj protokół barwienia B7-H1 zapewnia spójne barwienie błonowe i cytoplazmatyczne B7-H1 przy niewielkim poziomie tła.

Protokół

B7-H1/PD-L1, należący do rodziny B7 białek powierzchniowych komórek regulujących odporność, odgrywa istotną rolę w negatywnej regulacji odpowiedzi immunologicznej komórkowej poprzez oddziaływanie z receptorem programmed death-1 (PD-1) 1,2. Nadekspresja B7-H1 przez komórki nowotworowe została odnotowana w wielu nowotworach u ludzi, w tym w czerniaku, glejaku wielopostaciowym oraz w rakach płuc, piersi, jelita grubego, jajnika i komórek nerkowych, i wykazano, że upośledza ona przeciwnowotworową odporność limfocytów T3-8.

Niedawno wykazano, że ekspresja B7-H1 w tkankach gruczolakoraka trzustki może służyć jako potencjalny marker prognostyczny9,10. Ponadto wykazano, że blokada B7-H1 w mysim modelu raka trzustki wywołuje odpowiedź przeciwnowotworową11. Dane te wskazują na znaczenie B7-H1 jako potencjalnego celu terapeutycznego. W związku z tym przeciwciała blokujące B7-H1 są testowane w badaniach klinicznych w leczeniu wielu guzów litych u ludzi, w tym czerniaka oraz nowotworów płuc, jelita grubego, nerek, żołądka i trzustki12.

Aby w przyszłości móc zidentyfikować pacjentów, którzy odniosą korzyść z terapii celujących w B7-H1, kluczowe jest zbadanie korelacji między ekspresją i lokalizacją B7-H1 a odpowiedzią pacjentów na leczenie przeciwciałami blokującymi B7-H1. Analiza ekspresji B7-H1 w tkankach ludzkiego gruczolakoraka trzustki za pomocą immunohistochemii pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ta ko-inhibicyjna cząsteczka sygnałowa przyczynia się do supresji odporności przeciwnowotworowej w mikrośrodowisku guza. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne anty-B7-H1 (klon 5H1) opracowane przez Chena i współpracowników daje wiarygodne wyniki barwienia w kriosnittach wielu typów ludzkich tkanek nowotworowych4,8, jednak barwienie preparatów zalanych w parafinie stanowiło do niedawna wyzwanie13-18. Opracowaliśmy protokół barwienia B7-H1 dla preparatów z tkankami gruczolakoraka trzustki zalanych w parafinie. Opisany tutaj protokół barwienia B7-H1 zapewnia spójne barwienie błonowe i cytoplazmatyczne B7-H1 przy minimalnym tle.

1. Deparafinizacja

  1. Wypiekać preparaty w temperaturze 55 °C przez 20 min.
  2. W dygestorium zanurzyć preparaty w ksylenie na 10 min.
  3. Zanurzyć preparaty w świeżym ksylenie na 10 min.
  4. Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 5 min.
  5. Zanurzyć preparaty w świeżym 100% etanolu na 5 min.
  6. Zanurzyć preparaty w 95% etanolu na 5 min.
  7. Zanurzyć preparaty w 80% etanolu na 5 min.
  8. Zanurzyć preparaty w wodzie dejonizowanej na 5 min.

2. Odmaskowanie antygenów

  1. Zanurzyć preparaty w buforze Tris-EDTA (pH 9.0) i podgrzać w autoklawie do 125 °C przez 30 sec, a następnie do 90 °C przez 10 sec.
  2. Pozostawić preparaty do ochłonięcia na 60 min.
  3. Zanurzyć preparaty w buforze TBST na 5 min; powtórzyć dwukrotnie.

3. Barwienie

  1. Usunąć nadmiar roztworów wokół tkanki na szkiełkach. Obrysować obszar tkanki okręgiem za pomocą pisaka hydrofobowego.
  2. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysychaniu tkanki na szkiełku przez cały proces barwienia. Nanieść jedną kroplę (około 200 μl lub więcej, aby całkowicie pokryć obszar tkanki) blokera peroksydazy wewnątrz okręgu hydrofobowego na szkiełku i inkubować szkiełka w blokerze peroksydazy przez 5 min.
  3. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min.
  4. Nanieść jedną kroplę buforu blokującego BLOCK ACE na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.
  5. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min.
  6. Nanieść jedną kroplę roztworu awidyny na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.
  7. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min.
  8. Nanieść jedną kroplę roztworu biotyny na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.
  9. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min.
  10. Inkubować szkiełka z przeciwciałem monoklonalnym mysim anty-B7-H1 (klon 5H1) lub kontrolą izotypową mysiego IgG1 κ w rozcieńczeniu 1:1 000 w 200 μl TBST w temperaturze 4 °C przez noc (22 hr+/- 1 hr). Końcowe stężenie przeciwciał w TBST wynosi 2,57 μg/ml.
  11. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  12. Inkubować szkiełka z koniugowanym z biotyną szczurzym przeciwciałem wtórnym anty-mysie IgG1 w stężeniu 1:500 (w 200 μl roztworu 2% surowicy koziej) przez 30 min.
  13. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  14. Nanieść jedną kroplę kompleksu streptawidyna-biotyna (musi zostać przygotowany co najmniej 30 min przed użyciem) na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.
  15. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  16. Nanieść jedną kroplę odczynnika wzmacniającego (rozcieńczonego 2:1 w TBST) na każde szkiełko i inkubować przez 4 min.
  17. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  18. Nanieść jedną kroplę streptawidyny-HRP na każde szkiełko i inkubować przez 15 min.
  19. Przepłukać szkiełka roztworem TBST, a następnie pozostawić w TBST na 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  20. Nanieść jedną kroplę substratu i chromogenu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) na każde szkiełko i rozwijać barwę przez 2 min.
  21. Bezzwłocznie po wywołaniu barwy przemyć szkiełka wodą ddH2O przez 1-2 min.
  22. Inkubować szkiełka z jedną kroplą hematoksyliny przez 90 sec.
  23. Przemyć wodą ddH2O przez 1-2 min.
  24. Przemyć wodą z kranu z dodatkiem mydła przez 1-2 min.
  25. Przemyć wodą ddH2O przez 1-2 min.

4. Odwadnianie i montowanie

  1. Zanurzyć preparaty w 80% etanolu na 3 min.
  2. Zanurzyć preparaty w 95% etanolu na 3 min.
  3. Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 5 min. Powtórzyć czynność.
  4. Zanurzyć preparaty w ksylenie na 5 min. Powtórzyć czynność.
  5. Nanieść jedną kroplę Cytoseal 60 na preparat i nałożyć szkiełko nakrywkowe.

Tabela 1 zawiera listę odczynników wykorzystanych w opisanych powyżej procedurach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe barwienie immunohistochemiczne B7-H1 wykaże heterogenną ekspresję B7-H1 (brązowe sygnały po utlenianiu DAB) w gruczolakoraku trzustki. Niektóre komórki gruczolakoraka trzustki wykazują przeważnie błonową ekspresję B7-H1 (Rysunek 1A), podczas gdy inne wykazują albo przeważnie cytoplazmatyczną ekspresję B7-H1, albo niewielką ekspresję B7-H1 (Rysunki 2 i 3). Normalne nabłonek przewodowy trzustki wykazuje niewielką ekspresję B7-H1 (Rysunek 4). Barwienie z użyciem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 na skrawkach mrożonych było raportowane w poprzednich badaniach dla wielu rodzajów nowotworów3,4. Jednak kliniczne próbki guzów są zazwyczaj dostępne jedynie w formie bloków zatopionych w parafinie. Przeciwciało monoklonalne 5H1 zostało niedawno z sukcesem zastosowane do barwienia tkanek nowotworowych zatopionych w parafinie, w tym raka jasnokomórkowego nerki, raka szyjki macicy, raka pęcherza moczowego oraz czerniaka13-18. Raportowano również barwienie B7-H1 na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

E.B., K.M.B i H.X. wniosą równy wkład. Niniejsze badanie było wspierane przez NCI SPORE in Gastrointestinal Cancers P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, grant szkoleniowy NIH 5T32 CA0090701-28, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center oraz National Pancreas Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System CSADakoK1500Zawiera następujące odczynniki wymienione w protokole: blokery peroksydazy, kompleks streptawidyna-biotyna, odczynnik wzmacniający, streptawidynę-HRP oraz substrat i chromogen DAB
Zestaw blokujący awidyna/biotynaVectorSP-2001
Block ACESerotecBUF029
Biotynowana anty-mysia IgG1BD553441
Kontrola izotypowa mysiej IgG1 KeBioscience14-4714-85
TBS (bufor solny z Tris), 10XCellgro46-012-CM10x TBS zawiera 80 g/L NaCl i 24,2 g/L Tris;
rozcieńczany do 1X wodą ddH2O do płukania;
Tween 20Sigma-AldrichP13791 ml dodany do 1 L 1X TBS w celu przygotowania TBST
Target Retrieval, 20xCelerus Wave014-3000-000Rozcieńczany do 1x wodą ddH2O
Alkohol etylowy 190 ProofPharmco-Aaper111000190
Alkohol etylowy 200 ProofPharmo-Aaper111000200
KsylenVWR95057-827
HematoksylinaRichard-Allan Scientific72804
Cytoseal 60Richard-Allan Scientific8310-4
KapturkiCorning2940-245
Komora wilgotnościowaSigmaH6644
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt.

Bibliografia

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odmaskowanie antygen wrozw j barwy DABbarwienie przeciwcia amiodwodnienie tkankianaliza mikroskopowaamplifikacja sygna u
Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 (PD-L1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.