Obrazowanie funkcjonalne brunatnej tkanki tłuszczowej u myszy z wykorzystaniem micro-PET/CT z 18F-FDG

Xukui Wang; Laurie J. Minze; Zheng-Zheng Shi

doi:10.3791/4060

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie funkcjonalne brunatnej tkanki tłuszczowej u myszy z wykorzystaniem micro-PET/CT z ¹⁸F-FDG

19.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4060

⸱

23 listopada 2012

Xukui Wang¹ , Laurie J. Minze² , Zheng-Zheng Shi¹

¹Department of Translational Imaging, The Methodist Hospital Research Institute, Houston, ²Diabetes Research Center, The Methodist Hospital Research Institute, Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę obrazowania funkcjonalnego brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) u myszy, w której pobór 18F-fluorodeoksygukozy (FDG) przez BAT stymulowany zimnem jest oceniany nieinwazyjnie przy użyciu standaryzowanego protokołu micro-PET/CT. Metoda ta jest wiarygodna i czuła w wykrywaniu różnic w aktywności BAT w modelach mysich.

Streszczenie

Brunatna tkanka tłuszczowa (BAT) różni się od białej tkanki tłuszczowej (WAT) swoistą lokalizacją oraz brązowo-czerwoną barwą, wynikającą z bogatego unaczynienia i wysokiej gęstości mitochondriów. BAT odgrywa kluczową rolę w wydatkowaniu energii i termogenezie bezdrżeniowej u noworodków ssaków, jak i u osobników dorosłych ¹. Termogeneza zapośredniczona przez BAT jest ściśle regulowana przez układ współczulny, głównie poprzez receptor β-adrenergiczny ^{2, 3}. Niedawne badania wykazały, że aktywność BAT u dorosłych ludzi jest ujemnie skorelowana z indeksem masy ciała (BMI) oraz innymi parametrami cukrzycowymi ^4-6. Zaproponowano zatem BAT jako potencjalny cel terapii przeciwotyżeniowych i przeciwcukrzycowych, koncentrujących się na modulacji bilansu energetycznego ^6-8. Choć opracowano kilka metod pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) opartych na ekspozycji na zimno w celu wykrywania BAT u ludzi ^9-13, w zasadzie nie istnieje ustandaryzowany protokół obrazowania i ilościowej oceny BAT w modelach małych zwierząt, takich jak myszy. W niniejszej pracy opisujemy solidną metodę obrazowania PET/CT do funkcjonalnej oceny BAT u myszy. W skrócie, dorosłe myszy C57BL/6J były poddawane działaniu zimna w warunkach na czczo przez 4 godziny, po czym otrzymały jedną dawkę ¹⁸F-fluorodeoksyglukozy (FDG). Myszy pozostawały w zimnie przez dodatkową godzinę po wstrzyknięciu FDG, a następnie były skanowane za pomocą systemu mikro-PET/CT dedykowanego małym zwierzętom. Pozyskane obrazy PET zostały zarejestrowane wspólnie z obrazami CT w celu odniesienia anatomicznego, a następnie przeanalizowano wychwyt FDG w obszarze międzyłopatkowym BAT, aby przedstawić aktywność BAT. Ten ustandaryzowany protokół ekspozycji na zimno i obrazowania został zwalidowany poprzez badanie aktywności BAT podczas interwencji farmakologicznych, na przykład poprzez supresję aktywacji BAT po podaniu propranololu, antagonisty receptora β-adrenergicznego ^{14, 15}, lub wzmocnienie aktywacji BAT przez agonistę β3, BRL37344 ¹⁶. Opisana tutaj metoda może być stosowana do przesiewania leków/związków modulujących aktywność BAT lub do identyfikacji genów/szlaków zaangażowanych w rozwój i regulację BAT w różnych badaniach przedklinicznych i podstawowych.

Protokół

1. Przygotowanie zwierząt i traktowanie zimnem

Zlokalizuj i sprawdź chłodnię o temperaturze 4 °C, która została zatwierdzona do przetrzymywania myszy laboratoryjnych.
Wychłodź klatki dla zwierząt przez noc w chłodni. Klatki należy złożyć bez paszy i ściółki, ale z butelką wody.
W dniu eksperymentu rano umieszczaj myszy pojedynczo w każdej z wcześniej wychłodzonych klatek w odstępach 30 min. Każda mysz w osobnej klatce powinna pozostać w chłodni przez prawie 4 hr przed transportem do laboratorium obrazowania. Upewnij się, że myszy są na czczo, ale mają dostęp do wody.
Po 4 hr od zabiegu chłodzenia transportuj po jednym zwierzęciu co 30 min do laboratorium obrazowania. Można to osiągnąć, wypełniając pojemnik styropianowy lodem i kładąc wcześniej wychłodzoną klatkę na lodzie wewnątrz pudełka. Przykryj luźno pudełko styropianowe.

2. Konfiguracja procesu obrazowania Micro-PET/CT

W niniejszym protokole obrazowanie micro-PET/CT jest realizowane przy użyciu systemu Siemens Inveon Dedicated PET (dPET) oraz systemu Inveon Multimodality (MM) (CT/SPECT) w trybie dokowania. Zwierzę jest wprowadzane przez wejście systemu MM, najpierw skanowane w tomografii komputerowej (CT) w celu uzyskania punktów odniesienia anatomicznych, a następnie przesuwane do centrum dPET w celu statycznego obrazowania F18 PET. Aby umożliwić komputerowi sterującemu automatyczne wykonywanie tych sekwencyjnych zadań, przed właściwą sesją obrazowania w oprogramowaniu Inveon Acquisition Workplace (IAW) programuje się następujący „przepływ pracy” (workflow).

Akwizycja CT: W przypadku pełnoobszarowego skanowania CT ustaw prąd na 500 uA, napięcie na 80kV, czas ekspozycji na 200 msec oraz 240 kroków dla obrotu o 240°. Dla detektora promieni rentgenowskich wybierz rozdzielczość „low system magnification” z osiowym polem obrazowania 78 mm i trybem pojedynczego stołu. Wybierz „real time reconstruction”, stosując metodę „Common Cone-Beam Reconstruction”, aby komputer host komunikował się z dedykowanym komputerem do rekonstrukcji w czasie rzeczywistym (Cobra) w celu zainicjowania zadania.
Akwizycja emisji PET: W opcji „acquire by time” ustaw „fixed scan time” na 600 sec (10 min). Jako „study isotope” wybierz F-18 i ustaw „energy level” w zakresie 350-650 keV.
Histogram emisji PET: Ustaw „dynamic frame” na „black”, aby przetwarzać dane jako jedną klatkę przez cały czas trwania w celu uzyskania skanu statycznego. Jako typ histogramu wybierz „3D” i zaznacz opcję „no scatter correction”.
Rekonstrukcja PET: Jako algorytm rekonstrukcji zastosuj dwuwymiarową metodę Ordered Subset Expectation Maximization (OSEM2D).

3. Wstrzyknięcie FDG

Zamów kliniczny pakiet ¹⁸F-FDG (10 mCi) od regionalnego dostawcy tak, aby dotarł do laboratorium obrazowania ok. 30 min przed planowaną pierwszą iniekcją. Postępuj zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytutu podczas odbierania i monitorowania przesyłki zawierającej materiały radioaktywne (RAM).
Stosując osłonę blatu typu L-block, odmierz odpowiednią ilość FDG i przygotuj rozcieńczenia w sterylnej soli fizjologicznej. Rozcieńczone stężenie aktywności FDG dla każdej iniekcji powinno wynosić 200-300 μCi/100 ul. Pobierz roztwór FDG do strzykawki 1 ml z igłą 26G 1/2 cala i zmierz radioaktywność całej zawartości strzykawki za pomocą kalibratora dawek.
Zwierzę, które zostało właśnie przetransportowane z chłodni (patrz Krok 1.4), poddaj iniekcji 100 μl roztworu FDG drogą doszprytnową (i.p.). Zapisz czas iniekcji. Ponownie zmierz radioaktywność pozostałą w strzykawce za pomocą kalibratora dawek.
Umieść zwierzę z powrotem w zimnej klatce wewnątrz styropianowej lodówki z lodem. Inkubuj zwierzę w niskiej temperaturze (~ 4 °C) przez 1 hr w celu wychwytu FDG.
Oblicz podaną aktywność FDG dla każdej myszy według następującego wzoru:
Podana aktywność (μCi) = aktywność w strzykawce przed iniekcją - aktywność w strzykawce po iniekcji

4. Obrazowanie Micro-PET/CT

Obrazowanie micro-PET/CT rozpoczyna się 1 hr po wstrzyknięciu FDG lub 5 hr po zabiegu krioterapii. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia z 3% izofluranem w tlenie.
Po wprowadzeniu w stan znieczulenia zwierzę przenosi się na podkładkę micro-CT (łoże dla zwierząt), z głową spoczywającą w stożkowej masce twarzowej, która nieprzerwanie podaje izofluran (2%) z przepływem 2 L/min. Pod zwierzęciem umieszcza się elektryczną matę grzewczą (BioVet, m2m Imaging Corp.), aby pomóc w utrzymaniu temperatury ciała.
Wsuń zwierzę do otworu skanera MM, aktywuj ikonę „laser” na pasku narzędzi i za pomocą touchpada przesuń łoże tak, aby klatka piersiowa zwierzęcia znajdowała się na przecięciu poziomych i pionowych linii laserowych. W oknie „Laser Align” wybierz jako „first scan type” skan CT oraz opcję „PET acquisition included in workflow”.
Otwórz okno „Scout View” i wykonaj przeglądową radiografię rentgenowską (scout view). Użyj oprogramowania IAW, aby dostosować pozycję łoża zwierzęcia tak, aby centralne pole widzenia CT znajdowało się w centrum ciała myszy (wątroba). W razie potrzeby powtórz ten krok.
Uruchom „workflow” ustanowiony w kroku 2. Gdy pojawią się opcje, wybierz odpowiedni plik macierzy transformacji 3D PET-CT do wykorzystania w rekonstrukcji CT oraz wybierz niedawno utworzony plik normalizacji dla rekonstrukcji PET bez korekcji atenuacji. IAW rozpocznie następnie sekwencyjne skanowanie CT i PET zgodnie z programem.
Po zakończeniu całego procesu, co może zająć 20-25 min, krótko oceń jakość pozyskanych obrazów CT i PET za pomocą ASIPro VM, oprogramowania do analizy micro-PET zainstalowanego razem z IAW. Zarchiwizuj dane obrazowe na urządzeniu do przechowywania danych lub prześlij je przez sieć na stację roboczą do analizy poobrazowej (patrz krok 5) w celu dalszej analizy.
Wyjmij zwierzę z systemów obrazowania i umieść je w czystej klatce z normalnym dostępem do pokarmu i wody w celu rekonwalescencji w temperaturze pokojowej. Systemy są teraz gotowe dla kolejnego zwierzęcia w kolejce. Należy pamiętać, że opieka i obchodzenie się ze zwierzętami po obrazowaniu powinny być zgodne z regulaminem instytutu dotyczącym „obsługi zwierząt laboratoryjnych wstrzykniętych materiałami promieniotwórczymi (RAM)”. Należy również zwrócić uwagę, że zużyte igły/strzykawki, podkłady chłonne, rękawiczki oraz cała ściółka i odchody powinny być traktowane jako odpady promieniotwórcze i utylizowane zgodnie z odpowiednimi przepisami instytutu dotyczącymi utylizacji odpadów RAM.

5. Analiza po obrazowaniu

Otwórz oprogramowanie Inveon Research Workplace (IRW) (Siemens) i ręcznie zaimportuj zestawy danych CT oraz PET. Współrejestruj obrazy CT i PET w oknie „Registration”, korzystając z narzędzi z funkcją „General analysis”, a następnie w oknie „Review” upewnij się, że obrazy CT i PET są idealnie dopasowane we wszystkich trzech wymiarach.
W oknie „Region of Interest (ROI) Quantification”, opierając się na referencjach z współrejestrowanych obrazów CT, zidentyfikuj BAT w obszarze międzyłopatkowym szyi (najbardziej dominująca indukowana zimnem tkanka BAT u dorosłych myszy) i wyznacz objętość zainteresowania (VOI) dla BAT na zestawie danych PET. Jako „Quantification Type” wybierz „Voxel Intensity” i zapisz średnią radioaktywność wewnątrz VOI w jednostkach Bq/ml. Współczynnik kalibracji przeliczający zliczenia na sekundę na Bq/ml został wcześniej ustalony poprzez skanowanie fantoma o znanej radioaktywności.
Wychwyt FDG w BAT określa się jako procent podanej dawki na gram tkanki (%ID/g) z korekcją na rozpad. Podana dawka jest wynikiem kroku 3.5, jednak przeliczona na jednostkę becquerela (Bq) (1 μCi = 37,000 Bq); przyjmujemy, że 1 ml tkanki odpowiada 1 g.