Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

Podsumowanie

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Streszczenie

Stan zapalny przewodu pokarmowego jest częstą przyczyną wielu chorób ludzi. Modele badawcze na zwierzętach są kluczowe w badaniu złożonych mechanizmów komórkowych i molekularnych patologii jelit. Choć w wielu chorobach zapalnych organem zainteresowania jest często błona śluzowa (tunica mucosa), ostatnie prace wykazały, że błona mięśniowa zewnętrzna (muscularis externa, ME) jest również organem o wysokiej kompetencji immunologicznej, w którym znajduje się gęsta sieć rezydujących immunocytów.^1,2 Badania te przeprowadzono w znormalizowanym modelu manipulacji jelitowej (IM), która prowadzi do stanu zapalnego ściany jelit, ograniczonego głównie do ME. Klinicznie zapalenie to prowadzi do przedłużonej dysmotoryki jelit, znanej jako popيoperacyjny porażenie jelit (POI), które jest częstym i nieuniknionym powikłaniem po operacjach jamy brzusznej.³ Stan zapalny charakteryzuje się uwalnianiem mediatorów prozapalnych, takich jak IL-6⁴ lub IL-1β, oraz hamujących neuroprzekaźników, takich jak tlenek azotu (NO).⁵ Następnie do ME przenika ogromna liczba immunocytów, z dominacją neutrofili wielojądrzastych (PMN) oraz monocytów, co w konsekwencji utrzymuje POI.² Trwający wiele dni paraliż jelit prowadzi do zwiększonego ryzyka aspiracji, translokacji bakteryjnej i powikłań infekcyjnych, włącznie z sepsą i niewydolnością wielonarządową, generując wysokie obciążenie ekonomiczne.⁶

W niniejszym manuskrypcie prezentujemy zestandaryzowany model IM oraz ocenę in vivo pasażu żołądkowo-jelitowego (GIT) i pasażu jelita grubego. Ponadto demonstrujemy metodę oddzielania ME od tunica mucosa, a następnie analizę immunologiczną, która jest kluczowa dla rozróżnienia odpowiedzi zapalnych w tych dwóch wysoce immunoaktywnych przedziałach ściany jelita. Wszystkie analizy można łatwo przenieść na dowolne inne modele badawcze dotyczące funkcji przewodu pokarmowego.

Protokół

1. Zwierzęta

Samce myszy C57Bl6/J o średniej masie ciała 25 g otrzymano z firmy Harlan Winkelmann (Borchen, Niemcy). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z prawem federalnym dotyczącym ochrony zwierząt. Przestrzegano zasad opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, zapewniając im komercyjnie dostępną karmę dla gryzoni oraz wodę z kranu ad libitum. Zwierzęta powinny przebywać w zwierzęciu w Twoim ośrodku przez co najmniej 7 dni po przyjeździe przed rozpoczęciem eksperymentów. Należy pamiętać, że wszystkie eksperymenty można łatwo dostosować do szczurów lub innych gatunków, a po niewielkich modyfikacjach również do modeli dużych zwierząt.

2. Procedura operacyjna

1. Znieczulenie wprowadza się i utrzymuje za pomocą izofluranu (Abbott, Wiesbaden, Niemcy) w tlenie. Po wystąpieniu znieczulenia zwierzęta umieszcza się w pozycji grzbietnej i unieruchamia kończyny za pomocą taśmy klejącej (Leukosilk, Beiersdorf, Hamburg, Niemcy).
2. Po zgoleniu i chirurgicznej dezynfekcji ściany brzusznej wykonuje się laparotomię pośrodkową na długości 2 centymetrów. Do jam brzusznej dostaje się poprzez nacięcie wzdłuż linea alba. Umieszcza się dwa sterylne rozwieraki, aby utrzymać brzuch w pozycji otwartej. Jelito cienkie ostrożnie wysuwa się na lewo i kładzie na wilgotnej gazie bawełnianej.
3. Całą zawartość światła jelita cienkiego usuwa się za pomocą dwóch wilgotnych i sterylnych aplikatorów bawełnianych (MaiMed, Neunkirchen, Niemcy), jednocześnie tocząc aplikator od odźwiernika do kątnicy. UWAGA: Należy unikać krwawień ze ściany jelita cienkiego lub uszkodzeń naczyń jelitowych. Jelito wprowadza się z powrotem do jamy otrzewnej bez skręcania, aby zapobiec niedokrwieniu lub niedrożności mechanicznej, a nacięcie brzucha zamyka się za pomocą dwuwarstwowego szwu ciągłego z niewchłanialnej nici poliamidowej 5/0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).

3. Opieka pooperacyjna

1. Po zakończeniu procedury umieść zwierzę pod lampą grzewczą i obserwuj je do czasu wybudzenia z narkozy. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapewnij dostęp do wody oraz pokarmu. Ze względu na właściwości opioidów wpływające na perystaltykę, w wodzie pitnej stosujemy okołozabiegowe leki przeciwbólowe z grupy NLPZ (na przykład metamizol).

4. Badania funkcjonalne 24 h po IM

1. Tranzyt żołądkowo-jelitowy (GIT)
   1. Zlewożądź myszy lekko izofluranem w tlenie 22,5 h po IM. Ostrożnie wyprość głowę myszy i wyciągnij język za pomocą pęsety tępym końcem. Napełnij strzykawkę 1 ml co najmniej 100 μl dekstranu znakowanego fluoresceiną (FITC-dextran, 70,000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy), podłącz ją do cewnika tętniczego (Vygon, Ecouen, Francja) i ostrożnie wprowadź cewnik do żołądka jako zgłębnik żołądkowy.
   2. Szybko wstrzyknij 100 μl FITC-dextran i wyciągnij cewnik. Pozwól zwierzęciu się obudzić i odczekaj 90 min. W tym czasie myszy mają dostęp do pokarmu i wody.
   3. Przygotuj piętnaście probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i ponumeruj je kolejno.
   4. Uśmierć myszy 90 min po zgłębnikowaniu i usuń cały trakt żołądkowo-jelitowy od żołądka do odbytnicy. Umieść jelito na podkładce polistyrenowej, unikając jego rozciągania. UWAGA: Kluczowe jest delikatne usuwanie jelita, aby uniknąć przemieszczenia płynnego FITC-dextrane do sąsiedniego segmentu. Na początku pomocne może być użycie klipsów na początku i na końcu każdego segmentu.
   5. Zmierz całkowitą długość jelita cienkiego i całkowitą długość okrężnicy. Podziel jelito cienkie na 10 segmentów o równej długości, przypinając je do podkładki polistyrenowej za pomocą kaniul. Podziel okrężnicę na 3 segmenty. W ten sposób przygotowano 15 segmentów (żołądek nr 1), dziesięć równych segmentów jelita cienkiego (nr 2-11), kątnicę (nr 12) oraz trzy równy segmenty okrężnicy (nr 13-15).
   6. Przetnij jelito w zaznaczonych miejscach, chwyć je pęsetą i wypłucz raz 1,0 ml KHB do wcześniej przygotowanych probówek o pojemności 2,0 ml zawierających KHB, a następnie energicznie mieszaj w wirówce typu vortex przez 20 s. Żołądek i kątnicę umieść bezpośrednio w przygotowanych probówkach i przetnij. Napełnij te probówki 1,0 ml KHB, wypłukując w ten sposób pozostałości treści światła jelita z nożyczek do probówek.
   7. Wiruj próbki przy 12,000 rcf przez 5 min w temperaturze pokojowej w wirówce stołowej. Podczas wirowania przygotuj kolejne 15 ponumerowanych probówek o pojemności 1,5 ml.
   8. Przenieś klarowne nadytrawki do nowych probówek 1,5 ml i przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu analizy (następny krok). Próbki mogą być przechowywane przez kilka dni w 4 °C bez znaczącej utraty sygnału FITC. W przypadku dłuższego przechowywania dodaj 0,09% azydku sodu lub przechowuj w temperaturze < -18 °C.
   9. Nanieś pipetą podwójne serie próbek po 100 μl nadytrawek na czarną płytkę 96-dołkową (Greiner Bio One, Frickenhausen, Niemcy). Nanieś dwie próbki KHB po 100 μl jako próbę ślepą.
   10. Odczytaj płytkę w czytniku fluorescencji (Safire, Tecan, Crailsheim, Niemcy) i zmierz fluorescencję przy długości fali 494 nm (absorpcja) / 521 nm (emisja). Odejmij wartości próby ślepej od próbek.
   11. Oblicz geometryczne centrum (GC) rozkładu FITC-dextran, które w rzeczywistości jest środkiem ciężkości rozkładu markera, korzystając z następującego wzoru: GC = ∑ (% całkowitego sygnału fluorescencji na segment * numer segmentu) / 100
   
   Uwaga: Poprzez pomnożenie procentu fluorescencji każdego segmentu przez jego numer, ocenia się średnią ważoną rozkładu markera w jelicie. Punkt ten jest zależny zarówno od rozkładu, jak i od dystansu przebytego przez marker, ale nie zakłada żadnego konkretnego rozkładu podstawowego.⁷ Obliczona wartość GC jest często przedstawiana w połączeniu z wykresem obrazującym rozkład FITC dextran w obrębie traktu żołądkowo-jelitowego (Rysunek 1A).
   
2. Tranzyt okrężniczy
   1. Myszy należy lekko znieczulić izofluranem 2 % w tlenie. OSTROŻNIE: Należy upewnić się, że zwierzę obudzi się w ciągu 40 s.
   2. Ostrożnie sprawdź drożność okrężnicy, wprowadzając sondę przetoki (metalowy pręt o średnicy 2 mm) przez odbyt do okrężnicy.
   3. Za pomocą sondy przetoki wprowadź szklaną kulkę o średnicy 2 mm na odległość 3 cm do okrężnicy i natychmiast wyjmij sondę. Umieść mysz w przezroczystej klatce i rozpocznij pomiar czasu od momentu wyjęcia sondy przetoki z okrężnicy. Obserwuj mysz i zatrzymaj czas bezpośrednio po wydaleniu szklanej kulki.

5. Analiza histochemiczna wyizolowanych preparatów ME

1. Odcinki środkowej części jelita czczego są wycinane z jelita i zanurzane w zimnym KHB w naczyniu wypełnionym Sylgardem.
2. Krezkę przypina się do naczynia za pomocą igieł entomologicznych 0,2 mm (Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy).
3. Należy rozciąć odcinek wzdłuż krawędzi krezkowej i rozciągnąć go do około 120% jego długości i szerokości. Mocowanie należy zakończyć za pomocą igieł entomologicznych po przeciwnej stronie krezki. Naczynie z sylgardem należy ostrożnie wypłukać świeżym, lodowatym KHB, usuwając w ten sposób całą zawartość światła jelita.
   ME można teraz mechanicznie oddzielić od tunica mucosa, zaczynając od krezki. Podczas przygotowania należy kilka razy wymienić świeży, schłodzony KHB.
4. Oddzieloną tunica mucosa można zamrozić szokowo w ciekłym azocie do dalszych analiz lub usunąć.
5. Izolowany preparat ME (whole mount) należy utrwalić w 100% etanolu przez 10 min w temperaturze pokojowej.
   Preparat należy przemyć trzy razy schłodzonym KHB. Uwaga: po przetestowaniu kompatybilności z dalszą analizą można zastosować inne utrwalacze (np. 4% formaldehyd, kwas octowy, aceton).
6. Preparaty ME (whole mount) są gotowe do dalszego barwienia histochemicznego lub immunohistochemicznego:

1. Histochemia: barwienie na mieloperoksydazę (MPO)
   Infiltrację PMN można ocenić, stosując następujący protokół barwienia na MPO.
   1. Rozpuścić 10 mg odczynnika Hankera-Yatesa (Polyscience Europe, Eppelheim, Niemcy) w 10 ml KHB i dodać 100 μl 3% H₂O₂. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie używać ponownie.
   2. Inkubować preparaty całe przez 10 min w temperaturze pokojowej.
   3. Obficie płukać preparaty zimnym KHB, a następnie inkubować przez 10 min.
   4. Zamontować preparaty w wodnym medium montażowym (Aquatek, Merck, Darmstadt, Niemcy). Po wysuszeniu przez 2 h analizować preparaty pod mikroskopem świetlnym.
   5. Policzyć liczbę komórek w 5 losowo wybranych polach i obliczyć wartość jako liczba komórek MPO-dodatnich / mm².
2. Barwienie immunohistochemiczne:
   Analogicznie do histochemicznego barwienia na MPO, można przeprowadzić barwienia immunohistochemiczne preparatów całych. Co do zasady, ustalone protokoły barwienia immunohistochemicznego kultur komórkowych lub skrawków tkanek można łatwo zaadaptować do barwienia preparatów całych. Zaleca się jednak optymalizację procedury dla konkretnych przeciwciał.
   1. Pokroić preparaty na kawałki o wymiarach 5 x 5 mm i przeprowadzić barwienie w okrągłych probówkach wirówkowych o pojemności 2,0 ml w ~150 μl - 200 μl roztworu przeciwciał.
   2. Procedurę fixacji i blokowania (np. 3% BSA w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej) można przeprowadzić w naczyniu typu „sylgard dish”.
   3. Etapy płukania w PBS lub innych buforach można przeprowadzić w płytkach 12-dołkowych.
   4. Przenosić preparaty ostrożnie za pomocą ostrej pincety między probówkami do barwienia a płytkami do płukania.
   5. Po końcowej procedurze płukania zamontować preparaty w medium montażowym zapobiegającym blaknięciu z zastosowaniem szkiełek nakrywkowych i analizować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

6. Hodowla organowa ME

1. Cały jelito cienkie zostaje wycięte 24 h po IM i umieszczone w zimnym KHB zawierającym 200 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny (KHB + P/S).
2. Przeciąć jelito na odcinki o długości 3 cm i przypiąć każdy segment do szklanego naczynia z Sylgardem.
3. Usunąć krezkę za pomocą precyzyjnych nożyczek i nasunąć jelito na drut dziewiarski.
4. Ostrożnie naciąć ME ostrym pęsetą i oddzielić od błony podśluzowej za pomocą wilgotnego aplikatora bawełnianego. Tunica mucosa pozostaje na drucie dziewiarskim i może zostać zamrożona w sposób gwałtowny do dalszych badań. ME zbiera się do zimnego KHB + P/S.
5. Przeciąć wyizolowane paski ME na małe kawałki o długości 2 - 4 mm i inkubować w lodowatym KHB + P/S przez pół godziny, a następnie kilkakrotnie wypłukać próbkę.
6. Przenieść około 50-60 mg ME (co najmniej połowę ME z jednego jelita cienkiego) do sterylnej płytki 24-dołkowej zawierającej 500 μl modyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM).
7. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ przez dodatkowe 24 h.
8. Sprawdzić hodowle komórkowe pod mikroskopem pod kątem kontaminacji bakteryjnej lub grzybiczej.
9. Zebrać nadsącz, wirować przez 5 min przy 1 000 rcf i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. W międzyczasie osuszyć tkankę mięśniową na czystej chusteczce przez 30 s i zważyć.
10. Nadsącze można wykorzystać do późniejszej analizy wydzielonych cytokin (IL-6) metodą ELISA lub innych metabolitów (i.e. azotynów) w nadsączu zgodnie z instrukcjami producenta.
11. Znormalizować zmierzone stężenia w przeliczeniu na masę tkanki ME.

7. Reprezentatywne wyniki

1. Badania funkcjonalne
   Najważniejszym parametrem służącym do oceny nasilenia POI jest badanie GIT in vivo. Rycina 1A przedstawia typowy rozkład dekstranu FITC wzdłuż przewodu pokarmowego u nieleczonych kontroli oraz u myszy po manipulacjach jelitowych 24 h po operacji. Zwierzęta z grupy „operacji pozorowanej” wykazały prawidłowy stan GIT z obliczonym centrum geometrycznym (GC) w kątnicy, podczas gdy IM doprowadziły do znacznego opóźnienia przesuwania treści w GIT w proksymalnej części jelita czczego (Rycina 1B)
   Motorykę okrężnicy badano osobno poprzez pomiar czasu wydalenia szklanej kuleczki o średnicy 2 mm. Myszy po operacji pozorowanej wykazały czas wydalenia wynoszący 48–200 s, natomiast IM doprowadziły do wydłużenia czasu wydalenia do 470–775 s (Rycina 1C).
2. Badania morfologiczne
   Aby opisać zakres stanu zapalnego w obrębie ME, przeanalizowano kilka fenotypów leukocytów przy użyciu histochemii lub immunohistochemii. Na rycinach 2A+B zaobserwowano niską obecność PMN u zwierząt po „operacji pozorowanej” (39±7 komórek/mm²). IM jelita cienkiego doprowadziły do silnej infiltracji PMN (660±86 komórek/mm²) w porównaniu z myszami po operacji pozorowanej
3. Kultura organowa ME
   Wiele mediatorów zapalnych uwalnianych z komórek jest trudnych do wykrycia w lizatach tkankowych. Kultury organowe umożliwiają detekcję uwalnianych mediatorów w supernatancie hodowlanym. Reprezentatywnym mediatorem w POI jest NO, który jest głównym inhibitoryjnym neurotransmiterem w przewodzie pokarmowym.⁵
   NO nie udało się wykryć w supernatantach kultur organowych ME nieoperowanych zwierząt kontrolnych (5±6 μM/ 24 hr /mg tkanki). U myszy po operacji pozorowanej (laparotomii) zaobserwowano podstawowe poziomy NO wynoszące 53±36 μM/ 24 hr /mg tkanki. Kultury ME myszy po manipulacjach jelitowych (pobrane 24 h po operacji) produkują znacznie więcej NO (2254±853 μM/ 24 hr /mg tkanki) w ciągu 24 h kultury organowej ME (Rycina 3).

Rycina 1. Wpływ IM na GIT (A+B) i pasaż jelita grubego (C). GIT mierzono jako procent nieabsorbowalnego dekstranu znakowanego fluoresceiną w 15 odcinkach przewodu pokarmowego – żołądku (Sto), jelicie cienkim (SI 1-9), kątnicy (Cec) i jelicie grubym (Co) – 90 min po podaniu doustnym. Pasaż jelita grubego mierzono jako czas od wyciągnięcia sondy z przetoki do wydalenia szklanego koralika o średnicy 2 mm. (A) Rozkład w przewodzie pokarmowym izotiocyjanianu fluoresceiny-dekstranu po operacji pozorowanej (sham) lub IM. U zwierząt w grupie sham większość znacznika znajduje się w kątnicy lub proksymalnej części jelita grubego w porównaniu z lokalizacją w proksymalnej części jelita czczego u zwierząt poddanych manipulacji. Linie przerywane wskazują obliczony GC. (B) Obliczenie GC wykazało wydłużony czas pasażu w przewodzie pokarmowym po IM. (C) Czas pasażu jelita grubego wykazał istotne opóźnienie u myszy IM w porównaniu ze zwierzętami w grupie sham. GC dla 15 odcinków jelita przedstawiono jako średnią (n=5). Czasy pasażu jelita grubego przedstawiono jako średnią wraz ze wszystkimi wartościami indywidualnymi (n=6). *** = p<0.001, test t Studenta.

Rysunek 2. Wykrywanie komórek pozytywnych pod kątem MPO w obrębie ME jelita cienkiego. (A) Całe preparaty ME barwiono odczynnikiem Hankera Yatesa w celu wykrycia PMN pozytywnych pod kątem MPO 24 h po laparotomii (grupa pozorowana) lub procedurze IM. (B) Ilościowe oznaczenie komórek pozytywnych pod kątem MPO w 5 losowo wybranych polach na mysz. n= 6 zwierząt na grupę. *** = p<0.001, test t Studenta.

Rycina 3. Produkcja NO w supernatantach kultur ME. Próbki mięśni od kontrolnych myszy nieoperowanych, myszy poddanych operacji pozorowanej (sham) oraz myszy z IM pobrano 24 h po operacji i inkubowano przez 24 h. U myszy nieleczonych stwierdzono jedynie bardzo niską podstawową produkcję NO. Po laparotomii uwalnianie NO wzrosło, nie stwierdzając jednak istotnych różnic między grupą kontrolną a myszami po operacji pozorowanej. 24 h po IM produkcja NO gwałtownie wzrosła w porównaniu z myszami nieleczonymi lub po operacji pozorowanej. n= 5 zwierząt na grupę. *** = p<0.001, jednoczynnikowa ANOVA.

Dyskusja

Badanie porównawcze analizujące różne stopnie IM (ewisceracja jelita cienkiego przez 10 min versus delikatna inspekcja jelita cienkiego przy użyciu dwóch aplikatorów watnych versus IM z ewakuacją treści jelita cienkiego do kątnicy) wykazało korelację między zakresem manipulacji chirurgicznych a POI. W porównaniu z pozostałymi grupami, w przypadku IM odnotowano najwyższą liczbę leukocytów w ME (PNMs, makrofagi i komórki tuczne), co skutkowało przedłużonym i ciężkim przebiegiem POI.⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ethilon 5/0	Ethicon	1666H
Aplikatory bawełniane	MaiMed	71010
cewnik tętniczy	Vygon	115-798
płytka 96-dołkowa (czarna)	Greiner Bio One	655096
szklana kulka (średnica 2 mm)	Worf	dostępna na zapytanie
Szpilki entomologiczne	Fine Science Tools	26000-25
Odczynnik Hankera-Yatesa	Polyscience	560694
Aquatek	Merck	HC109850
DMEM	Lonza	BE12-604 F
FITC-dekstran (MW 70000)	Sigma Aldrich	46945-500MG-F