Artykuł metodologiczny

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

18.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4097

⸱

23 lipca 2012

 ,  ,  , 
1Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Streszczenie

Mikroglej to komórki linii mieloidalnej bytujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Komórki te odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu chorób związanych z neurozapaleniem, takich jak stwardnienie rozsiane (MS)2. Mikroglej w prawidłowym OUN wykazuje ekspresję markera makrofagicznego CD11b i przejawia fenotyp spoczynkowy, charakteryzujący się niskim poziomem markerów aktywacji, takich jak CD45. Podczas zdarzeń patologicznych w OUN mikroglej ulega aktywacji, co potwierdza wzrost ekspresji CD45 oraz innych markerów3. Czynniki wpływające na fenotyp i funkcje mikrogleju w OUN nie są jeszcze dobrze poznane. MikroRNA (miRNA) to stale rosnąca rodzina konserwatywnych cząsteczek (o długości ok. 22 nukleotydów), które uczestniczą w wielu prawidłowych procesach fizjologicznych, takich jak wzrost i różnicowanie komórek4, a także w procesach patologicznych, takich jak zapalenie5. MiRNA obniżają ekspresję określonych genów docelowych poprzez wiązanie sekwencji komplementarnych do ich mRNA i odgrywają ważną rolę w aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych, w tym makrofagów6 i mikrogleju7. Aby zbadać zależne od miRNA szlaki określające fenotyp i funkcję biologiczną mikrogleju oraz odróżnić mikroglej od innych typów makrofagów, istotna jest ilościowa ocena ekspresji konkretnych mikroRNA w odrębnych podgrupach mikrogleju bytującego w OUN. Powszechne metody pomiaru ekspresji miRNA w OUN obejmują ilościowe PCR z całej tkanki neuronalnej oraz hybrydyzację in situ. Jednak ilościowe PCR z homogenatu całej tkanki nie pozwala na ocenę ekspresji miRNA w samym mikrogleju, który stanowi jedynie 5-15% komórek tkanki neuronalnej. Hybrydyzacja in situ umożliwia ocenę ekspresji mikroRNA w konkretnych typach komórek w przekrojach tkankowych, lecz metoda ta nie jest w pełni ilościowa. W niniejszym opracowaniu opisujemy ilościową i czułą metodę detekcji miRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w mikrogleju izolowanym z prawidłowego OUN lub podczas neurozapalenia z wykorzystaniem eksperymentalnego autoimmunizacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), będącego modelem mysim stwardnienia rozsianego. Opisana metoda będzie użyteczna do pomiaru poziomu ekspresji mikroRNA w mikrogleju w prawidłowym OUN lub podczas neurozapalenia związanego z różnymi patologiami, w tym stwardnieniem rozsianym, udarem, urazami mechanicznymi, chorobą Alzheimera oraz guzami mózgu.

Protokół

1. Izolacja mikrogleju z prawidłowego OUN

Izolację mikrogleju przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą z wprowadzonymi modyfikacjami3.

  1. Przygotować instrumenty do sekcji i perfuzji: nożyczki, pęsetę, strzykawkę 10 ml z igłą 27g, homogenizator Dounce 15 ml (teflonowo-szklany), nylonowe sito do komórek 40 μm, roztwory Percoll 40% i 70%, 1X PBS.
  2. Uśmiercić myszy poprzez szybką asfiksję (pozbawienie tlenu) w komorze z CO2 i natychmiast przenieść je na stół laboratoryjny w celu przeprowadzenia manipulacji chirurgicznych i perfuzji.
  3. Przeprowadzić manipulacje chirurgiczne (używając nożyczek, pęsety oraz 70% etanolu jako środka antyseptycznego): otworzyć jamę otrzewną, przeciąć przeponę, otworzyć jamę klatki piersiowej i naciąć prawy przedsionek nożyczkami.
  4. Przeprowadzić całociałową perfuzję wewnątrzsercową, wprowadzając strzykawkę 10 ml do lewej komory i przykładając nacisk. Przepuścić 8-10 ml 1X PBS przez układ krwionośny w powolnym i stałym tempie.
  5. Powtórzyć kroki 1.2-1.4 dla wszystkich myszy w grupie (zazwyczaj 5-10 myszy). Po perfuzji trzymać mysz na lodzie do czasu perfuzji wszystkich osobników.
  6. Po perfuzji wszystkich myszy wypreparować mózgi i rdzenie kręgowe. (Opcjonalnie: aby zbadać ekspresję miRNA w różnych obszarach mózgu, wypreparować konkretne obszary, takie jak móżdżek, hipokamp itp. dla grupy 5-10 myszy i połączyć je w celu homogenizacji).
  7. Zhomogenizować mózgi i rdzenie kręgowe za pomocą homogenizatora Dounce 15 ml. Umieścić jeden mózg i jeden rdzeń kręgowy w homogenizatorze i dodać 5 ml 1X PBS. Wykonać 10-20 delikatnych uderzeń; przepuścić homogenat przez sito do komórek do probówki stożkowej 50 ml i wirować przy 2000 rpm w dużej wirówce przez 5-7 minut.
  8. Odlać supernatant, resuspendować homogenat mózgu/rdzenia kręgowego od 2-3 myszy w 5-7 ml 70% Percoll i nałożyć warstwę 7 ml 40% Percoll. Wirować przy 2000 rpm (bez hamowania!) przez 30 minut.
  9. Usunąć uszkodzone komórki/szczątki mieliny znajdujące się nad warstwą 70% i zebrać komórki mononuklearne z granicy faz 40%/70%. Rozcieńczyć zebrane komórki co najmniej w stosunku 1:1 przy użyciu 1X PBS i wirować przy 2000 rpm przez 5-7 minut. Resuspendować komórki w 0,5 ml PBS i przenieść je do probówki eppendorfa 1,7 ml. Typowa wydajność to ~500 x 103 komórek mononuklearnych na mysz, co dla preparatu z mózgów i rdzeni kręgowych 2-3 myszy daje liczbę komórek mikrogleju ~1x106 w 0,5 ml.

2. Kontrola czystości mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej

Barwienie przeciwciałami przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą z wprowadzonymi modyfikacjami7,8.

  1. Przygotować bufor do FACS (1X PBS z 2% FBS), przeciwciała blokujące FcR, przeciwciała anti-CD11b-PE oraz anti-CD45-APC-Cy7, a także 1% paraformaldehyd w PBS.
  2. Odobrać 50 μl komórek z kroku 1.9, przenieść je do nowej probówki Eppendorf 1,7 ml i dodać 350 μl buforu FACS.
  3. Dodać 5-10 μl przeciwciał anti-FcR i inkubować przez 10-15 minut w lodzie.
  4. Podzielić komórki do dwóch probówek Eppendorf. Do jednej probówki dodać 1 μl przeciwciał anti-CD11b-PE oraz 2 μl przeciwciał anti-CD45-APC-Cy7 i inkubować przez 10-15 minut w lodzie. Druga probówka posłuży jako kontrola negatywna dla barwienia przeciwciałami. Po inkubacji z przeciwciałami dodać 1 ml buforu FACS do obu probówek i wirować w małej wirówce przy 5400 rpm przez 5 min. Po wirowaniu utrwalić komórki, resuspendując je w 400 μl 1% paraformaldehydu w PBS i mieszając na wortexie.
  5. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym (LSR II, BD Biosciences), używając kulek kompensacyjnych BD compubeads (BD Biosciences) do kontroli kompensacji, zgodnie z opisem8. Przykłady prawidłowych i nieprawidłowych preparatów przedstawiono na Rys. 1a, b.

3. Izolacja mikrogleju i makrofagów obwodowych z zapalonego OUN w mysim modelu neurozapalenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) indukowano zgodnie z opisem przedstawionym w naszej wcześniejszej pracy7; sortowanie FACS przeprowadzono w sposób zbliżony do opublikowanego protokołu8.

  1. Indukuj EAE poprzez podskórne uodpornienie grupy 5-10 myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni dawką 150 mg peptydu MOG35-55 w 4 mg/ml kompletnego adjuwantu Freunda (CFA). Toksynę krztuścową należy podawać d.o. (150 ng/mysz) w dniu zero oraz w drugim dniu po uodpornieniu. Myszy obserwuje się pod kątem objawów choroby począwszy od 10. dnia po uodpornieniu, a nasilenie choroby ocenia się w skali numerycznej od 0 do 5 w następujący sposób: 0) brak choroby; 1) słabość ogona lub chwiejny chód; 2) niedowład kończyn tylnych; 3) paraliż kończyn tylnych; 4) paraliż kończyn tylnych i przednich; oraz 5) śmierć lub eutanazja z przyczyn humanitarnych. Do eksperymentu wykorzystuje się myszy w szczycie choroby (21. dzień po uodpornieniu), przy typowej ocenie nasilenia choroby w zakresie od 1,5 do 2,5.
  2. Wyizoluj komórki mononuklearne z OUN grupy 5-10 myszy zgodnie z krokami 1.1-1.4 i zabarw komórki przeciwciałami anty-CD11b oraz anty-CD45 zgodnie z krokami 2.1-2.4. W kroku 2.4 nie utrwalaj komórek, lecz resuspenduj je w 400 μl 1X PBS zamiast 1% paraformaldehydu.
  3. Sortowanie komórek przeprowadza się za pomocą FACSAria dla populacji mikrogleju CD11b+CD45low oraz komórek CD11b+CD45hi (~80% z nich to makrofagi obwodowe, a ~20% to aktywowany mikroglej3; w dalszej części będziemy określać te komórki mianem „makrofagów”). Do zbierania próbek należy używać probótek eppendorfowskich o pojemności 1,7 ml. Do probótek z próbkami należy dodać 300 μl 1X PBS z 10% FBS, aby zapobiec uszkodzeniu sortowanych komórek. Przykłady trzech populacji mikrogleju, makrofagów i limfocytów przedstawiono na Rys. 2a, a odpowiednie ustawienia bram sortowania na Rys. 2b. Typowa czystość sortowania wynosiła 98-100%, co określono poprzez ponowną analizę sortowanych populacji mikrogleju (Rys. 2c) i makrofagów (Rys. 2d). Typowa wydajność wynosi 20-50 x103 dla mikrogleju i 50-100 x103 dla makrofagów wyizolowanych z grupy pięciu myszy.

4. Izolacja RNA

RNA zostanie wyizolowane przy użyciu zestawu mirVana zgodnie z instrukcjami producenta z wprowadzonymi modyfikacjami.

  1. Wirować mikroglej z normalnego OUN z kroku 1.9 lub wyselekcjonowane podzbiory mikrogleju i makrofagów z kroku 3.3 w probówkach Eppendorf 1,7 ml przy 5400 rpm przez 5-7 minut w małej wirówce, ostrożnie odrzucić nadsącz i zamrozić pellety komórkowe na suchem lodzie. Przejść do kroku 4.2 lub przenieść zamrożone pellety komórkowe do temperatury -70 °C, gdzie mogą być przechowywane przez 2-3 miesiące.
  2. Przenieść zamrożone pellety komórkowe na zwykły lód w celu rozmrożenia. Dodać 300 μl Buforu Lizującego z zestawu mirVana i delikatnie wymieszać, pipetując 5-7 razy.
  3. Dodać 30 μl Dodatku do Homogenatu z zestawu mirVana, mieszać na wstrząsarku vorex przez 30 sekund, przechowywać na lodzie przez 10 minut.
  4. Dodać 300 μl kwas fenol:chloroform z zestawu mirVana, mieszać na wstrząsarku vortex przez 30 sekund, wirować przez 5 min przy 10 000 rpm w małej wirówce.
  5. Ostrożnie pobrać górną fazę wodną (300 μl) i przenieść do drugiej probówki Eppendorf 1,7 ml, wymieszać z 375 μl 100% etanolu, przenieść do wkładu filtrującego z zestawu mirVana i wirować przez 1 min przy 10 000 rpm.
  6. Odrzucić filtrat, dodać 700 μl Roztworu Przepłukującego I z zestawu mirVana i wirować przez 1 min przy 10 000 rpm.
  7. Przepłukać dwukrotnie 500 μl Roztworem Przepłukującym II z zestawu mirVana, a następnie eluować RNA z wkładu za pomocą 60 μl uprzednio podgrzanej wody wolnej od nukleaz.
  8. Ilość i jakość RNA ocenia się za pomocą spektrofotometru Nanodrop. Stężenie RNA powinno wynosić od 5 do 20 ng/ml, a stosunek OD λ260/ λ280 powinien mieścić się w zakresie 1,7-2,0. Jeśli stężenie RNA jest niższe niż 3 ng/ml, a OD 260λ/280λ jest niższe niż 1,6, próbki są odrzucane. Próbki RNA można przechowywać w temperaturze -70 °C przez 6-12 miesięcy.
  9. W celu dalszej oceny jakości RNA próbki są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej w 15% żelu TBE-Urea (Life Technologies). Typowe przykłady preparatów RNA dobrej i złej jakości przedstawiono odpowiednio na Rys. 3a i Rys. 3b.

5. Detekcja miRNA w mikrogleju i makrofagach

W celu analizy ekspresji miRNA przeprowadzane są analizy ilościowej odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) z wykorzystaniem testów TaqMan z primerami i sondami fluorescencyjnymi dla konkretnych, badanych mikroRNA oraz jednego z powszechnie eksponowanych krótkich RNA (np. snoRNA-55, snoRNA-135 lub U6) w celu normalizacji. Primery i sondy fluorescencyjne dla konkretnych zestawów ludzkich lub mysich miRNA można nabyć od Life Technologies Inc. W tym przykładzie jako badane miRNA wykorzystamy miR-124, a do normalizacji snoRNA-55.

  1. Przeprowadź reakcję odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA z próbek RNA, używając zestawu do odwrotnej transkrypcji TaqMan:
SkładnikObjętość (μl) na próbkę
5x Primer RT1.00
Próbka RNA1.67
Mieszanina enzymu RT 
dNTPs 25 mM każdy (łącznie 100 mM)0.050
MultiScribe Reverse Transcriptase)0.333
10X Bufor RT0.500
AB RNase Inhibitor0.063
Woda wolna od nukleaz1.388
Suma5.00

Rozcieńcz próbki RNA do stężenia 3 ng/μl. Przygotuj mieszaninę enzymu RT, odmień 3,33 μL do probówek PCR i dodaj 1,67 μl próbki RNA. Inkubuj w termocyklerze (BioRad) w temperaturze 16 °C przez 30 min, 42 °C przez 30 min, 85 °C przez 5 min, a następnie ustaw podtrzymanie temperatury 4° C.

  1. Przeprowadź reakcję PCR w czasie rzeczywistym z użyciem mieszaniny TaqMan PCR mix:
SkładnikObjętość (μl) na próbkę
Produkt RT1.0
2X TaqMan Master Mix5.0
5X Sonda2.0
Woda wolna od nukleaz2.0
Suma10.0

Do każdej reakcji należy użyć przezroczystej optycznej płytki reakcyjnej z 384 dołkami (Life Technologies) oraz urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym AB 7900 HT. Warunki cykliczne: 95 °C przez 10 min, [95 °C przez 5 sec, 60 °C przez 60 sec] x 40 cykli.

  1. Typowe krzywe dla ilości swoistych produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie (osie y) dla snoRNA-55 i miR-124 w próbkach RNA (każda próbka w duplikacie) wyizolowanych z mikrogleju i makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMDMs) w funkcji liczby cykli (osie x) przedstawiono na Rys. 4a, b.

6. Normalizacja i analiza danych

Poziomy względnej ekspresji analizowanego miRNA (miR-124) oblicza się metodą ΔΔCT, zgodnie z wcześniejszymi opisami7,9, wykorzystując snoRNA-55 do normalizacji początkowej ilości RNA.

  1. Przykład obliczenia względnego poziomu ekspresji miR-124 dla mikrogleju i BMDM przedstawiono w Tabeli I.
  2. W pierwszym kroku, na podstawie krzywych qRT-PCR, wyznacza się wartości Ct dla snoRNA-55 i miR-124 dla mikrogleju oraz BMDM (Rys. 4; Tabela I, kolumny: snoRNA-55 oraz miR-124).
  3. W drugim kroku oblicza się wartości ΔCt dla każdego duplikatu każdej próbki poprzez odjęcie Ct dla snoRNA-55 (normalizacja) od Ct dla miR-124 (doświadczenie) (Tabela I, kolumny: Ct (Norm), Ct(Exp) oraz ΔCt).
  4. W trzecim kroku oblicza się wartości ΔΔCt poprzez odjęcie ΔCt próbki referencyjnej (ΔCt(Ref)) od wartości ΔCt pozostałych próbek (Tabela I, kolumna: ΔΔCt). Jedna próbka zostaje zdefiniowana jako referencyjna; względny poziom ekspresji miRNA dla tej próbki zostanie określony jako 1,0. Wszystkie pozostałe próbki zostaną porównane z tą próbką referencyjną. W naszym przypadku poziom miR-124 w pierwszej próbce dla mikrogleju definiujemy jako 1,0, zatem ΔCt(Ref)=0,49 (Tabela I, pierwszy wiersz, zaznaczony na czerwono).
  5. Na koniec względny poziom ekspresji oblicza się jako 2-ΔΔCt (Tabela I, kolumna: miR-124 expression).
  6. Wszystkie analizy qRT-PCR są przeprowadzane w triplikatach lub duplikatach, a względny poziom ekspresji przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (S.D.) dla triplikatów (Rys. 5a,b) lub jako oba duplikaty obok siebie, jak pokazano na Rys. 5c.

7. Reprezentatywne wyniki

Typowe krzywe dla PCR w czasie rzeczywistym i wartości CT dla miR-124 (badane mikroRNA) oraz snoRNA-55 (normalizacja), a także względne poziomy ekspresji miR-124 przedstawiono na Rys. 4 i w Tabeli I. W naszych eksperymentach jako kontrolę do normalizacji wykorzystaliśmy snoRNA-55. Jak wspomniano powyżej, do normalizacji można użyć również innych powszechnie występujących RNA, takich jak snoRNA-135 i U6.

Przykłady ekspresji miR-124 w mikrogleju dorosłych w porównaniu z makrofagami pochodzącymi z szpiku kostnego (BMDMs) przedstawiono na Rys. 5a (BMDMs hodowano w obecności M-CSF zgodnie z opisem7). Na Rys. 5b porównano ekspresję miR-124 w wyselekcjonowanych populacjach mikrogleju CD45low oraz makrofagów CD45hi. W obu tych eksperymentach wykazano, że mikroglej różni się od innych makrofagów wyższym poziomem ekspresji miR-124. Podobne eksperymenty mogą być w przyszłości przeprowadzone w celu zbadania kinetyki aktywacji mikrogleju in vivo lub in vitro.

Ekspresję miR-124 w mikrogleju wyizolowanym z OUN myszy C57BL/6 na różnych etapach rozwoju przedstawiono na Ryc. 5c. Dane te wykazują, że mikroglej we wczesnych etapach rozwoju wykazuje niższe poziomy miR-124, co korelowało z ich aktywowanym fenotypem7. Podobną analizę można przeprowadzić w celu zbadania funkcji mikrogleju w prawidłowym OUN, np. poprzez porównanie ekspresji konkretnych miRNA w mikrogleju wyizolowanym z różnych obszarów OUN: móżdżku, rdzenia kręgowego, hipokampa itp.

Cytometria przepływowa; CD11b vs CD45; wyniki preparowania mikrogleju; diagram; analiza prawidłowych komórek OUN.

Rycina 1. Przykłady prawidłowego i nieprawidłowego przygotowania mikrogleju określonego za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku „prawidłowej” izolacji mikrogleju z normalnego OUN 95-98% komórek stanowi mikroglej CD11b+CD45low, a 2-5% to makrofagi okołonaczyniowe CD11b+CD45hi. Powinno występować mniej niż 1% limfocytów CD11b-CD45hi lub komórek astroglialnych, oligodendroglialnych bądź fragmentów komórkowych CD11b-CD45- (a). Przedstawiono tutaj przypadek „nieprawidłowego” przygotowania (b), w którym obecne jest 18% zanieczyszczeń w postaci komórek CD11b-CD45- (b, dolny lewy kwadrant), co sugeruje niewystarczającą separację w gradiencie Percoll. W przypadku prawidłowego przygotowania 95-98% komórek powinno stanowić mikroglej CD11b+CD45low (a, górny lewy kwadrant), 2-5% wszystkich komórek powinno stanowić makrofagi okołonaczyniowe CD11b+CD45hi (a, górny prawy kwadrant), a mniej niż 1% wszystkich komórek powinno stanowić zanieczyszczające komórki CD11b-ujemne (a, dolny lewy kwadrant). W przypadku „nieprawidłowego przygotowania” występuje znaczne zanieczyszczenie komórkami CD11b-CD45- lub fragmentami komórkowymi (astroglia, cząstki mieliny itp.) (b, dolny lewy kwadrant), co sprawia, że przygotowane komórki nie nadają się do izolacji RNA i dalszych analiz. Dodatkowo, w przypadku „nieprawidłowego przygotowania” mogą występować komórki CD11b-CD45hi (b, dolny prawy kwadrant), co wskazuje na zanieczyszczenie limfocytami krwi na skutek niewystarczającej perfuzji.

Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej; identyfikacja mikrogleju, makrofagów i limfocytów; badanie OUN myszy z EAE.
Rysunek 2. Analiza cytometryczna i sortowanie populacji mikrogleju oraz makrofagów obwodowych z chorym OUN. (a) Podczas neurozapalenia w OUN obecne są trzy populacje komórek: CD11b+CD45low (mikroglej), CD11b+CD45hi (makrofagi) oraz CD11b-CD45hi (limfocyty), odpowiednio w górnym lewym, górnym prawym i dolnym prawym kwadrancie. Bramki do sortowania populacji mikrogleju CD11b+CD45low i makrofagów CD11b+CD45hi przedstawiono w (b), a czystość ponownie analizowanych posortowanych populacji pokazano w (c,d). Zastosowano wstępne bramkowanie żywych komórek na podstawie parametrów FSC/SSC.

Porównanie integralności RNA; żel elektroforetyczny; RNA nienaruszone vs zdegradowane; prążki rRNA 18S, 5.8S, 5S.
Rycina 3. Przykłady „dobrej” i „złej” jakości RNA wyizolowanego z mikrogleju i analizowanego za pomocą elektroforezy żelowej. W przypadku dobrej jakości widoczna jest drabinka RNA oraz RNA rybosomalne (a). W przypadku złej jakości widoczne jest rozmycie (smear) oraz produkty degradacji o niskiej masie cząsteczkowej (b).

Wykres ekspresji snoRNA i miR-124; porównanie cykli qPCR dla mikrogleju i BMDM.
Rysunek 4. Krzywe qRT-PCR w czasie rzeczywistym dla fluorescencyjnie znakowanych produktów PCR miR-124 i snoRNA-55. Przedstawiono krzywe dla snoRNA-55 (a) oraz miR-124 (b) dla mikrogleju i makrofagów pochodzenia szpikowego (BMDMs). Eksperyment przeprowadzono w duplikacie. Wartości Ct określono poprzez przecięcie linii bazowej z dolną częścią zakresu liniowego krzywych qRT-PCR, jak pokazano na (b). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

snoRNA-55miR-124DCt=Ct(Exp)-Ct(Norm)DDCt=DCt-DCt(Ref)Względny poziom ekspresji=2-DDCt
Ct (Norm)Ct(Exp)DCtDDCtEkspresja miR-124
Mikroglej z prawidłowego OUN24.08224.5720,49(Ref)01.0
23.76624.2910.5250.0351.02
Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego (BMDM)26.87932.2315.3525.3170.025
26.52632.0785.5525.5170.022

Tabela I. Obliczanie względnych poziomów ekspresji miR-124 w mikrogleju w porównaniu do makrofagów pochodzących z szpiku kostnego na podstawie wartości Ct dla miR-124 (badany mikroRNA) i snoRNA-55 (kontrola do normalizacji).

Wykresy ekspresji miR-124 w mikrogleju; porównanie OUN, EAE i wieku; wykres słupkowy analizy danych mysich.


Rysunek 5. Analiza ekspresji miR-124 w mikrogleju i makrofagach. Porównanie ekspresji miR-124 w mikrogleju z prawidłowego OUN w stosunku do makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMDMs) przedstawiono w (a). Porównanie poziomu miR-124 w mikrogleju w stosunku do makrofagów obwodowych izolowanych z OUN myszy z neurozapaleniem przedstawiono w (b). Zmiany poziomu ekspresji miR-124 w mikrogleju podczas rozwoju u myszy w wieku 1, 2 i 4 tygodni w porównaniu z myszami dorosłymi (w wieku 8 tygodni) przedstawiono w (c). W (a, b) eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach, przedstawiając średnią ± S.D. z trzech oddzielnych reakcji PCR. W (c) eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, zgodnie z oznaczeniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnim czasie odnotowano znaczne zainteresowanie mikroglejem oraz udziałem tych komórek w wielu patologiach związanych z neurozapaleniem i neurodegeneracją. Ponadto w ciągu ostatnich kilku lat gwałtownie wzrosło znaczenie roli mikroRNA w różnicowaniu komórek odpornościowych i nowotworowych5,10. Wcześniej zgłaszaliśmy rolę miR-124 w utrzymaniu fenotypu nieaktywnego lub spoczynkowego mikrogleju w prawidłowym OUN7, jednak rola innych typów mikroRNA w fenotypie i stanie aktywacji mikrogleju wciąż po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez grant badawczy NIH R01 NS071039-01A1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X PBSGIBCO14190Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4
10X PBSThermo ScientificSH30258.02Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBSGBCO11965; 10438
zestaw miRVanaInvitrogenAM1561
PercollSigmaP4937-500 ml100 ml 100% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 10 ml 10X PBS i 90 ml Percollu z firmy Sigma. 50 ml 70% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 35 ml 100% Percollu i 15 ml DMEM; 50 ml 40% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 20 ml 100% Percollu i 30 ml 1X PBS
peptyd MOG35-55AnaSpec Inc60130-5
CFADIFCO263810
Toksyna krztuścaSigmaP7208
Przeciwciała blokujące FcRBD Biosciences553142Klon 2.4G2
mAb przeciwko CD11b-PEBD Biosciences553311Można stosować z różnymi fluoroforami (np. AF488)
mAB przeciwko CD45-APC-Cy7Biolegend103116Można stosować z różnymi fluoroforami (np. APC)
Paraformaldehyd (16%)EMS Inc15710Rozcieńczyć 1:15 w 1X PBS
Żel 15% TBE-mocznikowyLife Technologies Inc.EC68855BOX
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqManLife Technologies Inc4366596
TaqMan Universal PCR Master MixLife Technologies Inc4304437
Testy TaqMan MicroRNA mmu-miR-124aLife Technologies Inc4427975 ID 001182
Testy TaqMan MicroRNA snoRNA-55Life Technologies Inc4427975 ID 001228
Woda wolna od nukleazLife Technologies IncAM9937Woda wolna od nukleaz
Przezroczysta optyczna płytka reakcyjna 384-dołkowaLife Technologies Inc.4309849Można zastąpić innymi płytkami (np. płytką 96-dołkową) w różnych instrumentach do Real-time PCR
Homogenizator Dounce'a (15 ml)Wheaton Science Products.358044 Teflon/szkło
Nylonowe sitko do komórek 40 μFalcon352340
Duża wirówkaSorvalRT 6000BŚrednica rotora 18.5 cm
Mała wirówkaEppendorf5415 RŚrednica rotora 6.5 cm
Instrument do Real-time PCRLife Technologies Inc.AB 7900 HTMożna zastąpić innymi instrumentami
Cytometr przepływowyBD BiosciencessLSR IIMożna zastąpić innymi instrumentami
FACSBD BiosciencesFACSAriaMożna zastąpić innymi instrumentami
Spektrofotometr NanodropThermo ScientificNanodrop 1000

Bibliografia

  1. Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
  2. Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
  3. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  4. Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
  5. McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
  6. He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
  7. Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
  8. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
  9. Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
  10. Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  12. Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
  13. Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mikroglejudetekcja mikroRNAcytometria przep ywowagradient Percolaekstrakcja RNAmetoda delta delta CTmarkery CD11b CD45model mysi EAEhomogenizacja tkanek OUN

Powiązane artykuły