Łączenie PDMS bez użycia plazmy w celu taniego wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy, jak używać mikrofluidycznego urządzenia do neuronów bez konieczności wiązania plazmowego.

Streszczenie

W niniejszym filmie demonstrujemy, jak korzystać z mikrofluidycznego urządzenia do hodowli neuronów bez zastosowania wiązania plazmowego. W niektórych przypadkach pożądane może być odwracalne połączenie urządzeń z szkiełkiem podstawowym Corning nr 1. Może to wynikać na przykład z braku dostępu do urządzenia do czyszczenia plazmą. W innych sytuacjach może być konieczne usunięcie urządzenia ze szkła po hodowli neuronów w celu przeprowadzenia niektórych typów mikroskopii lub immunobarwienia, choć usuwanie urządzenia do immunobarwienia nie jest niezbędne, ponieważ neurony można barwić bezpośrednio w urządzeniu. Niektórzy badacze nadal jednak preferują usuwanie urządzenia. W takim przypadku możliwe jest to dzięki odwracalnemu połączeniu urządzenia ze szkiełkiem podstawowym. Wiązanie bez użycia plazmy wiąże się z pewnymi wadami, ponieważ tworzone uszczelnienie jest mniej szczelne. W niektórych przypadkach aksony mogą przerastać pod rowkami, zamiast przez nie. Ponadto, ze względu na hydrofobowość szkła i PDMS, ciecze nie wnikają łatwo do urządzenia, co sprawia, że czasami konieczne jest wtłaczanie pożywki i innych odczynników do wnętrza układu. Ciecze wnikną do urządzenia dzięki działaniu kapilarnemu, jednak proces ten trwa znacznie dłużej w porównaniu z urządzeniami poddanymi wiązaniu plazmowemu. Urządzenie do czyszczenia plazmą wytwarza tymczasowe ładunki hydrofilowe na szkle i urządzeniu, co po połączeniu ułatwia przepływ cieczy przez układ w ciągu kilku sekund. W przypadku urządzeń połączonych bez użycia plazmy przepływ cieczy trwa kilka minut. Należy również zaznaczyć, że urządzenia przeznaczone do wiązania bez plazmy muszą zostać wcześniej wysterylizowane, podczas gdy urządzenia traktowane plazmą nie wymagają sterylizacji przed użyciem, ponieważ proces plazmowy je sterylizuje.

Protokół

Przygotowanie urządzeń mikroprzepływowych do hodowli komórek neuronów

1) Oczyścić szkiełka przedmiotowe Corning nr 1 o wymiarach 24 mm X 40 mm

• Poddać szkiełka przedmiotowe sonikacji w kąpieli wodnej przez 30 minut
• Opłukać szkiełka przedmiotowe 70% EtOH
• Przemyć szkiełka trzy razy dH₂O
• Osuszyć szkiełka w komorze do hodowli tkanek przez kilka godzin, najlepiej przez noc

Uwaga: Używamy specjalnych metalowych tacek, do których wkładamy preparaty. Preparaty są rozdzielane i umieszczane w szczelinach tej metalowej podstawki. Następnie tacki te można umieścić w szklanej korytku wypełnionym wodą, wstawić do sonikatora z łaźnią wodną i sonikować przez 30 minut. Kolejne etapy płukania są przeprowadzane w tym korytku.

2) Przygotowanie urządzeń PDMS

• Wytnij formę z PDMS z płytki krzemowej, wykonaj otwory w odlewie z PDMS, a następnie podziel go na cztery części
• Oczyść urządzenia z PDMS, najpierw przedmuchując je gazem obojętnym (Argonem lub Azotem). Następnie użyj taśmy 3M Scotch Brand 471, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia

Uwaga: Ważne jest, aby trzymać urządzenia stroną górną do góry. Początkowo, podczas odcinania PDMS od wafla krzemowego, stroną czystą jest ta, która stykała się z waflem: znajdują się na niej kanały mikroprzepływowe. Staramy się być tak ostrożni, jak to możliwe, aby nie uszkodzić urządzenia i utrzymujemy czystą stronę skierowaną do góry aż do momentu rozpoczęcia wiązania plazmowego.

• Autoklawuj urządzenia w plastikowych pojemnikach
• Po autoklawowaniu oczyść szkiełka przedmiotowe Corning nr 1 i poddaj urządzenia obróbce plazmowej przy użyciu urządzenia do czyszczenia plazmowego marki Harrick, www.harrickplasma.com
• Umieść urządzenia czystą stroną do dołu na szkiełku przedmiotowym.

Urządzenie jest teraz powiązane plazmowo z szkiełkiem przedmiotowym.

3) Powlekanie urządzeń poli-L-lizyną (PLL)

• PLL dodaje się do dołka po każdej stronie urządzenia i pozwala mu przepłynąć do kolejnego dołka

=> 150 µl PLL do dużych dołków oraz 30 µl PLL do mniejszych dołków. Ilość nie musi być dokładna, o ile dołki są pełne.

Uwaga: Przyglądając się urządzeniu, zauważysz 4 dołki: każde dwa są ze sobą połączone. Należy umieścić PLL w jednym dołku w taki sposób, aby przepłynął on przez urządzenie do kolejnego dołka.

• Pozostaw PLL w urządzeniu na około 10 minut, a następnie dodaj więcej PLL do studni, aby je całkowicie wypełnić
• Umieść urządzenia zawierające PLL w inkubatorze w temperaturze 37°C na minimum 4 godziny (preferowane jest pozostawienie ich na noc)
• Po zakończeniu obróbki usuń nadmiar PLL za pomocą próżni, uważając jednak, aby nie odessać całej cieczy z urządzenia

Uwaga: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do kanałów lub komory. Należy jedynie odessać nadmiar PLL z dołków.

• Dodać autoklawowaną wodę destylowaną dH₂O do każdego dołka po obu stronach urządzenia i pozwolić jej przepłynąć do drugiego dołka dzięki działaniu kapilarnemu

Rysunek 1 przedstawia schemat urządzenia mikrofluidycznego. Zwróć uwagę, w jaki sposób połączona jest strona niebieska (strona somy) oraz strona czerwona (strona aksonalna). Kiedy mówimy o naniesieniu PLL, wody lub pożywki do jednej studni po każdej stronie urządzenia, mamy na myśli na przykład: nanieś 150 ul autoklawowanej dH₂O do jednej niebieskiej studni, a następnie nanieś 150 µl autoklawowanej dH₂0 do jednej czerwonej studni. Woda (lub PLL, pożywka lub komórki) przepłynie przez urządzenie do drugiej odpowiadającej jej studni.

  Rysunek 1

Uwaga: Proszę zwrócić uwagę, że od tej pory, mówiąc „umieść medium, komórki, wodę lub PLL w górnych studzienkach”, odnoszę się do powyższego schematu, na którym soma znajduje się po lewej stronie, a aksony rosną w prawo.

• Odssać wodę (pamiętając ponownie, aby nie usuwać całkowicie całego płynu z urządzenia), a następnie dodać kolejne 150 µl autoklawowanej dH₂O do każdego z połączonych otworów i pozwolić jej przepłynąć do odpowiadającego otworu.
• Umieścić urządzenie zawierające dH₂O w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę, a następnie ponownie powtórzyć etap płukania. Urządzenia należy przepłukać dH₂O łącznie trzy razy, z zachowaniem jednej godziny dla każdego cyklu.

Uwaga: Ze względu na możliwość absorpcji boranu z PLL do PDMS, niektórzy członkowie laboratorium Jeona zalecają inkubację urządzeń przez noc w autoklawowanej dH₂O po kilku wstępnych szybkich płukaniach. Zapewni to wymycie całego wolnego boranu z PDMS przed załadowaniem komórek. Jeśli ten krok zostanie pominięty, z czasem może dojść do uwalniania boranu do medium, co może prowadzić do cytotoksyczności.

• Do górnych studzienek dodać pożywkę Neural Basal Media (NBM) z niezbędnymi czynnikami (glutamax, B27, PenStrep)

Uwaga: Urządzenia można inkubować przez noc i zasiać z komórkami następnego dnia lub inkubować przez minimum 3 godziny w NMB + czynnikach przed wysianiem komórek.

Przygotowanie neuronów do wprowadzenia do urządzeń

Używamy kory płodowej szczura w 18. dniu rozwoju, którą kupujemy od firmy Brain Bits lub która jest dla nas przygotowywana na miejscu na kampusie. Preferujemy korzystanie ze świeżych tkanek.

1. Przygotować korę mózgu płodu (2 fragmenty tkanki) przechowywaną w Hibernate E
2. Wziąć 3 długie szklane pipety i wypalić ich końce nad lampą alkoholową, tworząc sukcesywnie mniejsze otwory
3. Przenieść tkanki z Hibernate E za pomocą szklanej pipety do sterylnej probówki 15 ml zawierającej 2 ml NMB + Factors.
4. TryTURACJA: Używając gruszki i szklanej pipety, przeprowadzić korę w górę i w dół około 5 do 10 razy. Następnie użyć kolejnej, mniejszej pipety do wielokrotnego pobierania i uwalniania tkanki. Na koniec powtórzyć czynność z najmniejszą pipetą. Należy upewnić się, że nie pozostały widoczne grudki.
   
   Uwaga: Niedawno laboratorium Jeon rozpoczęło porównywanie komórek z tkanek przechowywanych w Hibernate E z komórkami przygotowanymi z tkanek wstępnie traktowanych 0,125% Trypsyną w 50% buforze do sekcji wolnym od Ca++ i Mg++. Wyniki wskazują, że tkanki przygotowane przy użyciu trypsyny dają więcej żywych komórek niż tkanki umieszczone początkowo w Hibernate E. Jeśli tkanka NIE zostanie użyta natychmiast, należy ją przechowywać w Hibernate E.
   
   W przypadku natychmiastowego użycia tkanki w celu zwiększenia żywotności komórek, należy traktować tkankę Trypsyną przed tryturacją mechaniczną w następujący sposób: 1) rozcieńczyć 1 ml 0,25% Trypsyny (Gibco, Invitrogen) z 1 ml buforu do sekcji wolnego od Ca++ i Mg++ (końcowe stężenie Trypsyny = 0,125%) w probówce 15 ml (utrzymując w temperaturze lodowej); 2) umieścić tkankę w buforze i niezwłocznie inkubować w 37°C przez 8 minut; 3) dodać 10 ml DMEM/10% FBS, aby zatrzymać reakcję trypsyny i kontynuować protokół poniżej.
   
   
5. Odwirować komórki przy 1100 rpm przez 1 minutę
6. Ostrożnie odessać medium znad osadu komórkowego
7. Dodać 1 ml NMB + factors do osadu i resuspender go poprzez pipetowanie w górę i w dół
8. Przesprowadzić resuspenderowane komórki grawitacyjnie przez filtr w celu usunięcia skupisk (BD Falcon cell strainer 40 um nylon)
9. Policzyć i wysiać komórki:
   • Do probówki do mikrowirówki dodać 60 µl NMB + factors, 20 µl zawiesiny komórkowej oraz 20 µl błękitu trypanu, a następnie wymieszać
   • Nanieść około 10 µl tego roztworu do komory licznikowej (hemocytometru) i policzyć żywe komórki (niezafarbowane na niebiesko)
   • Dostosować stężenie do 2,5 - 4,5 x10⁶ cells/ml
     
     Uwaga: Zazwyczaj otrzymujemy stężenie około 2,5 - 4,5 x 106 cells/ml, w zależności od objętości, w której resuspenderowano komórki (normalnie 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep na korę). Jeśli tkanka była przygotowana z trypsyną, wydajność prawdopodobnie będzie wyższa.

Przygotowanie urządzeń na szalkach

1. Załaduj komórki (neurony pierwotne) do jednej studni urządzenia
2. Rozmieść 5 µl na małe urządzenie i 20 µl na duże urządzenie
   
   Uwaga: Można załadować 10 µl komórek do górnej części urządzenia i 10 µl do dolnej części (połowa całkowitej objętości) lub bezpośrednio całe 20 µl komórek do górnej studni somatycznej (5 µl do górnej studni somatycznej w przypadku małych urządzeń).
   
   
3. Inkubuj przez 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C, aby komórki mogły zacząć przywierać
4. Dodaj około 150/30 µl NMB + czynniki do każdej studni, zależnie od rozmiaru urządzenia
   
   Uwaga: Objętości mogą się różnić w zależności od grubości PDMS. Istotne jest jedynie, aby studnie były pełne.

Materiały uzupełniające dotyczące stosowania urządzeń bez wiązania plazmowego

Bez traktowania plazmą, Christina Tu, technik, która co tydzień z powodzeniem wykonuje tę procedurę bez użycia plazmy, zaleca natychmiastowe naniesienie komórek.

Pamiętaj, aby usunąć medium z obu studzienek po stronie soma (pozostawienie medium po stronie aksonu nie będzie miało znaczenia). To właśnie przepływ cieczy umożliwia komórkom przedostanie się do głównego kanału. Jeśli w studzienkach znajduje się medium, przepływ cieczy nie wystąpi.

Dyskusja

W niniejszej pracy zademonstrowaliśmy, jak używać mikrofluidycznego urządzenia do neuronów bez konieczności stosowania oczyszczacza plazmowego. Metodę tę określamy mianem łączenia bezplazmowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS	Odczynnik	Dow Corning		Sylgard 184 z utwardzaczem; prosimy skontaktować się z firmą Dow Corning w celu znalezienia najbliższego dystrybutora
Szkiełko podstawowe Corning No. 1	Szkiełko podstawowe	Corning	Corning No. X2935 244	Dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific, numer katalogowy Fisher 12-531D
B27	Odczynnik	Invitrogen	17504-044	B27 jest zastrzeżonym suplementem dostępnym w firmie Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Glutamax	Odczynnik	Invitrogen	35050-061	Glutamax jest dostępny w firmie Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Szalka Petri 60 mm	Narzędzie	Fisher Scientific	08-757-13A	Sterylne polistyrenowe szalki Petri 60 mm są używane do umieszczenia urządzenia przytwierdzonego do szkła.
Poly-L-Lizyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P-1274
Probówka BD Falcon 50 ml	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Dostępna za pośrednictwem Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-49A
Probówka BD Falcon 15 ml	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Dostępna za pośrednictwem Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-70C