Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Podsumowanie

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Streszczenie

Krystalografia rentgenowska jest preferowaną metodą uzyskiwania szczegółowego obrazu struktury białek. Badania te muszą być uzupełnione o dalsze analizy biochemiczne w celu uzyskania szczegółowego wglądu w zależności między strukturą a funkcją. Postępy w technologii syntezy oligonukleotydów i genów sprawiają, że wielkoskalowe strategie mutagenezy stają się coraz bardziej wykonalne, w tym zastępowanie reszt docelowych wszystkimi 19 pozostałymi aminokwasami. Fenotypy związane z nabyciem lub utratą funkcji pozwalają wówczas na wyciągnięcie systematycznych wniosków, takich jak wkład konkretnych reszt w aktywność katalityczną, stabilność białka i/lub specyficzność oddziaływań białko-białko.

Aby przypisać różne fenotypy naturze mutacji, a nie wahaniom warunków eksperymentalnych, kluczowe jest oczyszczanie i analiza białek w sposób kontrolowany i powtarzalny. Strategie wysokoprzepustowe oraz automatyzacja protokołów manualnych na robotycznych platformach do obsługi cieczy stworzyły możliwości przeprowadzania tak złożonych procedur biologii molekularnej przy niewielkiej interwencji człowieka i minimalnym poziomie błędów^1-5.

Przedstawiamy tutaj ogólną metodę wysokoprzepustowego oczyszczania białek rekombinowanych z tagiem His. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy tę metodę do szczegółowego badania zależności struktura-funkcja TFIIB, komponentu podstawowego aparatu transkrypcyjnego. TFIIB jest niezbędny do transkrypcji kierowanej promotorem in vitro oraz kluczowy dla rekrutacji polimerazy RNA do kompleksu preinicjacyjnego^6-8. TFIIB zawiera elastyczną domenę łącznika, która wnika w szczelinę centrum aktywnego polimerazy RNA^9-11. Domena łącznika ta nadaje TFIIB dwie biochemicznie mierzalne aktywności, mianowicie (i) stymulację aktywności katalitycznej podczas „abortywnego” etapu inicjacji transkrypcji oraz (ii) dodatkowy wkład w specyficzną rekrutację polimerazy RNA do kompleksu preinicjacyjnego^4,5,12. Wykorzystaliśmy metodę wysokoprzepustowego oczyszczania do wytworzenia pojedynczych, podwójnych i potrójnych mutacji substytucyjnych oraz delecji w łączniku TFIIB, a następnie poddaliśmy je analizie w testach funkcjonalnych w celu zbadania ich efektu stymulującego na aktywność katalityczną polimerazy RNA⁴. Łącznie wytworzyliśmy, oczyściliśmy i przeanalizowaliśmy 381 mutantów – zadanie, którego wykonanie ręczne byłoby czasochłonne i żmudne. Białka otrzymano i przebadano w powtórzeniach, co pozwoliło nam ocenić wszelkie wariacje eksperymentalne i dało jasny obraz powtarzalności naszych wyników.

Niniejsza metoda służy jako ogólny protokół oczyszczania białek z dodatkiem znacznika His i została z sukcesem zastosowana do oczyszczania innych białek rekombinowanych. Obecnie jest zoptymalizowana pod kątem oczyszczania 24 białek, lecz może zostać dostosowana do oczyszczania do 96 białek.

Protokół

CZĘŚĆ A: Wysokoprzepustowa hodowla kultur bakteryjnych.

1. Hodowla bakterii przez noc w 2 ml pożywki autoindukcyjnej z użyciem płytek 24-dołkowych

1. Sterylizuj płytki 24-dołkowe w mikrofalówce.
2. Zaszczep 1,5 ml pożywki do autoindukcji (Overnight Express Medium) świeżo wyhodowanymi koloniami bakterii lub zamrożonymi stokami w glicerolu. Zwyczajowo szczepimy trzy dołki na jeden mutant, używając trzech oddzielnych sklonowanych kolonii. Zarezerwuj sześć dołków na kontrole pozytywne i negatywne. Dla kontroli pozytywnych hodujemy trzy klony typu dzikiego, a dla kontroli negatywnych dwa klony transformowane nieekspresyjnym plazmidem. Aby sprawdzić skuteczność sterylizacji płytki, pozostaw jeden dołek pusty jako kontrolę zawierającą samą pożywkę.
3. Hoduj komórki przez 18 hr w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm. Używamy komórek BL21 (DE3) Rosetta 2 indukowalnych laktozą. Pożywka do autoindukcji zawiera mieszaninę glukozy i laktozy. Bakterie początkowo wykorzystują glukozę, a następnie zaczynają zużywać laktozę, która jednocześnie indukuje ekspresję białek rekombinowanych.
4. Zdejmij pokrywkę i umieść płytkę na platformie robotycznej.

CZĘŚĆ B: Robotyczna puryfikacja białek rekombinowanych.

2. Przygotowanie platformy robotycznej

1. Przygotować bufor do płukania składający się z 20 mM imidazolu, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM octanu Trisu, pH 7,9, 10 mM MgOAc₂, 0,7 mM ZnOAc₂, 10% glicerolu oraz bufor do elucji składający się z 0,5 M imidazolu, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM octanu Trisu, pH 7,9, 10 mM MgOAc₂, 0,7 mM ZnOAc₂, 10% glicerolu. Bufory te będą odpowiednio wykorzystywane do płukania kulek po związaniu z nimi białek z tagiem lub do elucji białek z kulek.
2. Przygotować rozcieńczalnik bakteryjny (100 ml wody destylowanej z 15 μl odczynu odpieniającego). Roztwór ten będzie służył do rozcieńczania nocnych kultur bakterii w celu pomiaru gęstości optycznej (A600). Obecność środka odpieniającego w rozcieńczalniku zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które zakłócałyby pomiary w czytniku płytek.
3. Przygotować roztwór do lizy składający się z 10x odczynnika FastBreak, 2 μl lyzonazy na próbkę i 15 mM MgOAc₂. FastBreak zawiera mieszankę detergentów i soli, które rozbijają ściany komórkowe bakterii i ułatwiają uwalnianie białek wewnątrzkomórkowych. Lysonaza jest zastrzeżoną mieszaniną lizozymu i nukleazy. Lizozym wspomaga rozrywanie ściany komórkowej, a nukleaza trawi uwolnione kwasy nukleinowe bakterii.
4. Opcjonalnie: Przygotować 6 M roztwór chlorku guanydyny. Niektóre białka rekombinowane mają tendencję do przylegania do igieł pipetujących powlekanych teflonem. Roztwór chlorku guanydyny denaturuje białka i usuwa je skuteczniej niż woda, która jest rutynowo stosowana do płukania zmywalnych końcówek pipetujących robota po każdym kroku.
5. Przygotować odczynik do ilościowego oznaczania białek BCA (kwasu bicinchoniningowego) poprzez zmieszanie roztworu kwasu bicinchoniningowego (odczynnik A) i roztworu siarczanu miedzi (odczynnik B): Wiązania peptydowe redukują Cu²⁺ z komponentu CuSO₄ obecnego w odczynniku BCA do Cu¹⁺, przy czym ilość Cu¹⁺ jest proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych obecnych w roztworze. W drugim kroku dwie cząsteczki kwasu bicinchoniningowego chelatują Cu¹⁺, co powoduje przesunięcie absorbancji do 562 nm i nadaje roztworowi fioletowy kolor. Reakcja barwna jest zależna od czasu i zazwyczaj wymaga kilku godzin, aby stać się definitywna. Po tym czasie kolor pozostaje stabilny przez kilka godzin.
6. Napełnić korytka lub płytki o odpowiedniej wielkości i umieścić je w przypisanych pozycjach na platformie robotycznej.
7. Umieścić w odpowiednich pozycjach na platformie jedną płytkę 24-dołkową na odpady chlorku guanydyny, dwie przezroczyste płytki 96-dołkowe do pomiarów OD₆₀₀ i absorbancji oraz jedną niebieską płytkę 96-dołkową na oczyszczone białka. Umieścić jedną płytkę 96-głębokodołkową na statywie magnetycznym.
8. Rozcieńczyć 5-krotnie w wodzie destylowanej cząsteczki MagneHis Ni, które wiążą białka poprzez tworzenie chelatów z ich tagami His, i przelać je do jednostki mieszającej kuleczki. Włączyć mieszadło, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie.
9. Włączyć platformę robotyczną i płukać igły pipetujące przez kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które w przeciwnym razie wpływałyby na dokładność pipetowania. Wielorazowe igły pipetujące są płukane pomiędzy poszczególnymi krokami pipetowania. Alternatywnie można zastosować jednorazowe końcówki. Wszystkie kolejne kroki są wykonywane robotycznie. Protokół robotyczny jest dostępny na żądanie.

3. Kontrola wzrostu komórek poprzez pomiar OD600

1. 10 μl hodowli nocnej rozcieńcza się w 90 μl roztworu rozcieńczającego.
2. Zmierz OD₆₀₀, aby upewnić się, że bakterie osiągnęły podobną gęstość (Rysunek 1).

4. Rozbicie komórek w celu uwolnienia białek i umożliwienia wiązania z kuleczkami

1. Do każdego dołka drugiej płytki 24-dołkowej nanosi się 100 μl zawiesiny magnetycznych kulek niklowych (Ni-beads).
2. Do płytki 24-dołkowej zawierającej kulki przenosi się 900 μl każdej z małoscale'owych kultur bakteryjnych. Następnie dodaje się 100 μl mieszaniny 10x FastBreak/lysonase.
3. Płytkę 24-dołkową przenosi się na platformę wytrząsową w celu intensywnego mieszania (800 rpm) przez 30 min w temperaturze pokojowej. Ściany komórkowe bakterii zostają rozbite poprzez kombinację sił mechanicznych i działania chemicznego, a rekombinacyjnie produkowane białka zostają uwolnione do roztworu. Dzięki znacznikom powinowactwa natychmiast wiążą one paramagnetyczne chelujące kulki niklowe.

5. Płukanie kulek

1. Lizaty komórkowe zawierające resuspendowane kuleczki magnetyczne przenosi się do płytki 96-dołkowej typu deep-well, umieszczonej na statywie z prętami magnetycznymi, które wsuwają się pomiędzy dołki. Płytki 96-dołkowe posiadają kwadratowe dno w kształcie stożka, co ułatwia usuwanie nadsączu. Dołki mogą pomieścić objętości do 2,1 ml, lecz są wypełniane znacznie mniejszymi objętościami. Pozwala to na przeprowadzenie etapów intensywnego mieszania bez ryzyka kontaminacji krzyżowej próbek poprzez rozpryskiwanie.
2. Końcówki pipet są płukane pomiędzy poszczególnymi krokami pipetowania 6 M guanidyną-HCl. Krok ten jest kluczowy dla oczyszczania białka TFIIB oraz innych białek „lepkich” w celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej. W przypadku innych białek wystarczy obfite płukanie igieł wodą pomiędzy etapami pipetowania.
3. Pręty magnetyczne statywu przyciągają kuleczki paramagnetyczne, odciągając je od centrów dołków i zapewniając igłom pipetujący swobodny dostęp do nadsączu. Nadsącz zostaje usunięty.
4. Najpierw do płytki 24-dołkowej dodaje się 500 μl buforu do płukania, a następnie przenosi go do płytki 96-dołkowej, aby zapewnić całkowity transfer kuleczek. Płytkę 24-dołkową zdejmuje się z wytrząsarki.
5. Kolejne 500 μl buforu do płukania dodaje się bezpośrednio do płytki 96-dołkowej, następnie płytkę przenosi się na wytrząsarkę i intensywnie miesza przez 1 min. Płytkę przenosi się z powrotem na statyw magnetyczny i usuwa bufor do płukania.
6. Krok ten powtarza się dwukrotnie, a procedurę płukania kończy się poprzez usunięcie wszelkich pozostałości buforu z płytki.

6. Elucja białek w buforze elucyjnym

1. Do kulek dodaje się 100 μl buforu elucyjnego, a następnie płytkę przenosi się na wytrząsarkę i intensywnie wytrząsa przez 30 min w temperaturze pokojowej.
2. Płytkę przenosi się z powrotem na wytrząsarkę, a eluat zawierający oczyszczone białko rekombinowane przenosi się do nowej płytki.

7. Pomiar stężeń oczyszczonych białek

1. 190 μl mieszaniny odczynnika BCA przenosi się do przezroczystej płytki 96-dołkowej i dodaje 10 μl roztworu białka.
2. Po kilku godzinach inkubacji (zazwyczaj 5-6 lub przez noc), mierzy się absorbancję i porównuje ją ze standardami BSA, aby określić stężenia każdego z oczyszczonych preparatów białek (Rysunek 2).
3. Oczyszczone białka mogą teraz zostać wykorzystane w dalszych zastosowaniach w odpowiednich stężeniach (Rysunek 3).

8. Reprezentatywne wyniki

Protokół oczyszczania obejmuje dwa etapy kontroli jakości, których przykłady zostały przedstawione. Jesteśmy w stanie zidentyfikować i udokumentować potencjalne problemy na etapie wzrostu bakterii (Rycina 1) oraz później, podczas oceny wydajności oczyszczania białek (Rycina 2). Zazwyczaj oczyszczamy białka i testujemy je w trzech powtórzeniach. To, w połączeniu z dwoma krokami kontroli jakości, daje nam pewność, że wszelkie obserwowane zmienności w testach funkcjonalnych wynikają z fenotypu mutantów (Rycina 3), a nie z błędów eksperymentalnych lub nieudanych procesów oczyszczania. Uzyskane wydajności zazwyczaj mieszczą się w zakresie 50-200 μg i są w pełni wystarczające dla różnych testów funkcjonalnych.

Rysunek 1. Histogram pomiarów OD w płytce 24-dołkowej z kulturami nocnymi. Hodowano trzy klony sześciu wariantów mutantów TFIIB oraz TFIIB typu dzikiego. Jako kontrole negatywne posłużyły dwa klony zawierające nieekspresyjny plazmid oraz dołek zawierający samą pożywkę. Pomiary OD wykazują niewielkie różnice w tempach wzrostu pomiędzy poszczególnymi kulturami.

Rysunek 2. Wydajność białka uzyskana z tych kultur, określona za pomocą testu BCA i potwierdzona metodą SDS-PAGE. Jeden z wariantów nie jest wyrażany na wysokim poziomie. W połączeniu z Rysunkiem 1 można wywnioskować, że nie wynikało to z różnic w tempie wzrostu komórek, lecz z faktu, że ekspresja białka nie została prawidłowo indukowana.

Rysunek 3. Reprezentatywny wynik analizy transkrypcyjnej. Zmierzono aktywność stymulującą wariantów TFIIB w produkcji krótkich transkryptów abortywnych przez RNAP. Przedstawiono tutaj efekty stymulacji dla pełnej biblioteki pojedynczych podstawień aminokwasowych w pozycji K87 TFIIB. Wysoki stopień powtarzalności potwierdzają niskie wartości błędów. Poniżej przedstawiono przykładowy żel obrazujący wydajność trzech mutantów w porównaniu z typem dzikim (wt), kontrolami negatywnymi (NC) oraz kontrolami zawierającymi wyłącznie bufor elucyjny.

Dyskusja

Opisana tutaj zautomatyzowana metoda oczyszczania białek rekombinowanych umożliwia produkcję i oczyszczanie licznych białek mutantów w małej skali, w wysoce powtarzalnych warunkach i przy minimalnej ingerencji człowieka. Rysunki 1 i 2 przedstawiają wyniki systematycznej kontroli jakości oraz przykłady oczyszczonych białek. Rysunek 3 wykazuje, że oczyszczone czynniki transkrypcyjne wykorzystane w tym przykładzie wykazują wysoką powtarzalność w testach funkcjonalnych.

Mimo że procedura została opracowana w celu oczyszczania archaeal TFIIB, ma ona szerokie zastosowanie w oczyszczaniu białek z znacznikami powinowactwa. Wykorzystanie takich zautomatyzowanych protokołów oczyszczania znacznie ułatwi analizę biochemiczną białek rekombinowanych i przyczyni się do pogłębienia wiedzy na temat oddziaływań białko-białko w skali trudnej do osiągnięcia przy manualnym wykonywaniu tych procesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Overnight Express Instant TB Medium	Merck Chemicals Ltd	71491-4
FastBreak	Promega Ltd.	V8573
Odczynnik do bioprocesingu Lysonase/ 1 ml	Merck Chemicals Ltd	71230
Antifoam 204	Sigma-Aldrich Company Ltd	A6426
Cząstki MagneHis Ni-Particles	Promega	V8565
Imidazol	Sigma-Aldrich Company Ltd	56750
Trizma base	Sigma-Aldrich Company Ltd.	93362
NaCl	VWR	27810.295
Zestaw do oznaczania białek kwasem bicinchoninowym (BCA)	Sigma-Aldrich Company Ltd	BCA1-1KT
Płyta głębok 것owa (deep well plate) 2,2 ml, dołki kwadratowe, PP, op. 10 szt.	Anachem Ltd	1810-00
Mikropłytka MicroWell 96-dołkowa, płaskie dno, polistyren niepowlekany, 12 opakowań po 5 płytek, przezroczyste, objętość dołka 0,4 ml, 128 mm x 86 mm, Thermo Scientific Nunc	Fisher Scientific Ltd.	DIS-984-090M
Mikropłytka Blue	VWR	NUNC367001
Bloki 24-dołkowe RB (24)	Qiagen	19583
Chlorowodorek guanidyny	VWR	ALFAA13543.0B
Igła zmywalna do systemu TheOnyx	Aviso GmbH	8152-317001
Statyw na odczynniki do kulek magnetycznych	Aviso GmbH	8152-035003
Czytnik płytek Synergy HT	BioTek	4200-000043
Platforma robotyczna TheOnyx 44OH/150/100	Aviso GmbH	8145-050046
Wstrząsarka do mikropłytek Variomag Teleshaker	Inheco	3800047
Magnes do płytek 96-dołkowych typ A	Qiagen	36915