Wytwarzanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych dla komórek form białka DISC1

Summary

Opisana jest generacja, oczyszczanie i inwazja komórek wewnątrzkomórkowych, cytoplazmatycznych agresomów białkowych DISC1 o pełnej długości z hodowli komórkowych oraz znakowanego, multimerycznego rekombinowanego fragmentu białka DISC1 w E. coli. Inwazyjność komórek wykazano dla komórek biorczych w hodowli komórkowej oraz dla neuronów in vivo po stereotaktycznej inokulacji mózgu.

Abstract

Agregacja białek jest postrzegana jako ogólna cecha charakterystyczna przewlekłych, zwyrodnieniowych chorób mózgu, takich jak na przykład choroby neurodegeneracyjne: choroba Alzheimera (Aβ, tau), choroba Parkinsona (α-synukleina), choroba Huntingtona (poliglutamina, huntingtyna) i inne. Uważa się, że agregacja białek zachodzi z powodu zaburzonej proteostazy, tj. braku równowagi między powstawaniem a degradacją nieprawidłowo sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka znajdują się zagregowane w sporadycznych formach tych chorób, które są zmutowane w rzadkich wariantach form rodzinnych.

Schizofrenia to przewlekła, postępująca choroba mózgu, która w wielu przypadkach idzie w parze z trwałym i nieodwracalnym deficytem poznawczym. W podejściu genowym kandydującym zbadaliśmy, czy Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z przewlekłą chorobą psychiczną^{1, 2}, można znaleźć jako nierozpuszczalne agregaty w mózgu sporadycznych przypadków schizofrenii³. Korzystając z SMRI CC, zidentyfikowaliśmy w około 20% przypadków z CMD, ale nie z normalną grupą kontrolną lub pacjentami z chorobami neurodegeneracyjnymi nierozpuszczalną w sarkozylu immunoreaktywność DISC1 po frakcjonowaniu biochemicznym. Późniejsze badania in vitro ^{wykazały, że} na skłonność do agregacji DISC1 miał wpływ związany z chorobą polimorfizm S704C⁴, a agresomy DISC1 generowane in vitro były inwazyjne dla komórek5, podobnie jak wykazano dla Aβ6,^{tau 7-9}, α-synukleiny¹⁰, poliglutaminy¹¹ lub agregatów SOD1¹². Odkrycia te skłoniły nas do zaproponowania, że przynajmniej podzbiór przypadków z CMD, tych z zagregowanym DISC1, może być zaburzeniami konformacyjnymi białek.

Tutaj opisujemy, jak generujemy agresomy DISC1 w komórkach ssaków, oczyszczamy je na gradiencie sacharozy i wykorzystujemy do badań inwazyjności komórek. Podobnie opisujemy, w jaki sposób generujemy wyłącznie multimeryczny C-końcowy fragment DISC1, znakujemy go i oczyszczamy do badań inwazyjności komórek. Stosując rekombinowane multimery DISC1 uzyskujemy podobną inwazyjność komórkową, jak w przypadku podobnie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synukleiny. Pokazujemy również, że fragment ten jest wychwytywany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.

Protocol

1. Przygotowanie komórek dawcy agresomów: transfekcja monomerycznego białka czerwonej fluorescencji (mRFP) lub wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) znakowanego ludzkim krążkiem pełnej długości (FL) DISC1

1. Nasienie 1,5 x 10⁶/10 cm szalka ludzka neuroblastoma NLF (NLF; Szpital Dziecięcy w Filadelfii, Filadelfia, PA) w dziesięciu 10-centymetrowych szalkach i rosną przez noc. Komórki NLF są hodowane w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS, penicyliną/strepomycyną, L-glutaminą. Następnego dnia komórki powinny mieć 70-80% konfluencji.
2. Przejściowo transfekować każde 10 cm naczynie 15 μg plazmidowego DNA i odczynnikiem do transfekcji metafektenu (Biontex, Martinsried, Niemcy). Krótko mówiąc, na 10-centymetrową szalkę, 15 μg plazmidowego DNA i 30 μl Metafektenu dodano do 750 μl Opti-MEM, wymieszano i inkubowano w RT przez 20 minut. 5 szalek transfekowano ludzkim DISC1 pcDNA3.1 mRFP/eGFP-tagged (FL) i 5 szalek z samym plazmidem eGFP.

2. Oczyszczanie agresomalne z transfekowanych komórek dawcy

Opisany tutaj protokół jest kombinacją metody oczyszczania ciał Lewy'ego z tkanki mózgowej¹³ oraz protokołu izolowania dużych agregatów i agresomów¹⁴. Ponieważ już istniejące metody opierają się na stosowaniu detergentów, izolacja białka wolnego od detergentów do zastosowania w testach inwazyjności komórkowej ma kluczowe znaczenie.

1. 48 godzin po transfekcji monitorować ekspresję eGFP i mRFP/eGFP-DISC1 i potwierdzić tworzenie się agresomów pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1).
2. Umyj komórki PBS pH 7,4, zeskrob po 400 μl PBS, dodaj koktajl 1X Protease Inhibitor (Roche, Indianapolis, IN) i rozbij komórki za pomocą homogenizatora Precellys24 (Bertin technologies, Francja). Krótko dodać 1 ml zawiesiny komórek do probówki do lizy o pojemności 2 ml i dodać 10 kulek ceramicznych. Lizuj komórki za pomocą impulsów 3 x 60 sekund. Siła mechaniczna występująca w procesie może spowodować wzrost temperatury w próbce powyżej 37 °C, dlatego należy zachować ostrożność, aby po procedurze lizy schłodzić próbkę na lodzie.
3. Schłodzić komórki na lodzie i dodać 10 mM MgCl₂, 40 U/ml DNazy A i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C
4. Przygotować roztwory 80%, 50%, 20% sacharozy (w/v) o pH PBS 7,4 (po 10 ml).
5. Przygotuj gradient sacharozy w 15 ml probówce sokoła, zaczynając od 2 ml 80% sacharozy, a następnie 50% i 20%. Wlewaj gradient powoli i uważaj, aby nie naruszyć już wylanych warstw. Przefermentowany lizat ułożyć warstwami na wierzchu gradientu i wirować przez 15 minut w temperaturze 1000 x g w temperaturze 4 °C.
6. Ostrożnie zebrać interfazę między 50-80% warstwą sacharozy za pomocą pipety i wymieszać z 5 objętościami PBS o pH 7,4. Wirować przez 15 minut przy 1000 x g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć mycie jeszcze dwa razy. W tej interfazie agresomy są fluorescencyjne i można je uwidocznić pod mikroskopem w świetle UV.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250-500 μl PBS o pH 7,4. Ta osadka zawiera oczyszczone agresomy (ryc. 2).

3. Leczenie komórek biorcy SH-SY5Y agresomami mRFP/eGFP-DISC1

1. Nasiona 5 x 10⁴ biorców ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y konstytuujących ekspresję GFP-DISC1 (598-854) na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Komórki SH-SY5Y są hodowane w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej penicyliną/streptomycyną, aminokwasami endogennymi (NEAA) i 10% FBS.
2. 24 godziny później dodać 10 μl do każdej studzienki i inkubować przez 48-72 godziny.
3. Umyj komórki 3 x PBS pH 7,4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową 0,04% błękitem trypanowym przez 5 minut.
4. Utrwalić komórki za pomocą 4% PFA w PBS pH 7,4 przez 10 minut na lodzie, przemyć raz sterylnym_H2Oi zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą ProLong Gold z podłożem montażowym DAPI (Invitrogen, USA).
5. Potwierdź wychwyt/inwazję egzogennie stosowanych agresomów poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami wyrażanymi przez komórki biorcze w obrazach stosu Z.

Jednak wychwyt/inwazja białka egzogennego może nie być zasadniczo wykryta równolegle z rekrutacją białka komórki gospodarza. W naszym przykładzie agresomy DISC1 znakowane mRFP rekrutują rozpuszczalne białko DISC1 (598-854) znakowane GFP wyrażane przez komórkę gospodarza (patrz ryc. 3). Zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.

4. Generacja rekombinowanego DISC1(598-785)

W poprzedniej publikacji analizowaliśmy zdolność różnych fragmentów białka DISC1 do samointerakcji w oparciu o obecność domen samoasocjacji. Spośród wszystkich badanych fragmentów białek ludzki DISC1 (598-785) wykazywał najsilniejszą skłonność do multimeryzacji⁴ (Figura 4). Dlatego ludzki DISC1 (598-785) został sklonowany do pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin) zawierający N-końcowy znacznik 6-histydyny, wyrażony w E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, USA) i oczyszczony w warunkach denaturacji w moczniku 8 mol / l, jak opisano⁴. Krótko mówiąc, protokół jest opisany poniżej.

1. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli hodowano w 2 x 500 ml 2YT zawierających 5 mM-arginina-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg / ml karpencyliny, 35 μg / ml chloramfenikolu do OD₆₀₀: 0,6-0,8 i ekspresję DISC1 (598-785) indukowano za pomocą 1 mM IPTG.
2. DISC1 (598-785) wyrażano przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, ekspresję zakończono przez zebranie bakterii przez odwirowanie.
3. Osad bakteryjny zawieszono w 50 ml buforze TE (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) plus 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lizozymu, 20 mM MgCl₂ i 400 U/50 ml DNazy I. Aby zapewnić całkowitą lizę, reakcję inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
4. Dodać 10 mM β-merkaptoetanolu (ME) i 500 mM NaCl i inkubować przez kolejne 30 minut.
5. Odwirowywać inkluzje bakteryjne w temperaturze 20 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
6. Zawiesić osad w 50 ml buforze ekstrakcyjnym zawierającym 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 8 M mocznika i 10 mM β-ME i usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie w temperaturze 20 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
7. Przemyć matrycę agarozy Ni-NTA buforem ekstrakcyjnym. Zawiesiony, wstępnie oczyszczony ekstrakt białkowy inkubować z matrycą Ni-NTA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
8. Przepłukać matrycę Ni-NTA buforem ekstrakcyjnym zawierającym 12 mM imidazolu.
9. Powoli eluować białko za pomocą 15 ml buforu elucyjnego zawierającego 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolu, 8 M mocznika, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA i 10 mM β-ME.
10. Białko należy dializować stopniowo do PBS pH 7,4 zawierającego 10 mM β-ME.

Z 1 L początkowej kultury bakteryjnej można wyizolować do 50 mg rekombinowanego białka DISC1(598-785).

α-ponowne fałdowanie synukleiny

Dla eksperymentów z α-synukleiną, 500 μg rekombinowanego białka (Sigma-Aldrich, USA) rozpuszczono w PBS w stężeniu 1 mg/ml. Aby uzyskać oligomery, ponowne fałdowanie przeprowadzono przez noc w temperaturze 37 °C, jak opisano w poprzedniej publikacji¹⁰.

5. Etykietowanie rekombinowanego DISC1(598-785) za pomocą DyLight594

1. Przed kolejnym procesem znakowania białko DISC1 (598-785) musi zostać uwolnione od β-ME. Dlatego białko jest dializowane 3 razy do PBS pH 7,4 w rozcieńczeniu 1:2,000.
2. Oznaczyć 1 mg DISC1 (598-785) maleimidem DyLight 594 (Thermo Scientific, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, rozpuść 1 mg / ml białka w PBS pH 7,4 i dodaj 5 mM TCEP, aby odzyskać wolne grupy tiolowe. Dodać 20 μl rozpuszczonego barwnika DMF do reakcji i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Białko dializować 3 x do PBS pH 7,4 w stosunku 1:2000 przez 2 godziny każde.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć czystość znakowanego białka, przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa na podstawie 6 znaczników His_na kolumnie Ni-NTA.

4. Przemyć 1 ml matrycy Ni-NTA (Qiagen, Niemcy) 10 ml PBS o pH 7,4.
5. Nałóż znakowane, dializowane białko do kolumny i pozwól mu powoli przepływać po kolumnie.
6. Umyj białko 3 x 20 ml PBS o pH 7,4
7. Eluować białko za pomocą PBS pH 7,4, 500 mM imidazolu kroplami, monitorując kolorowy pasek na kolumnie Ni-NTA w celu zmniejszenia objętości eluatu.
8. Dializować eluat 3 x do 10 mM NaPi pH 7,4 w rozcieńczeniu 1:2000 przez 2 godziny każdy.
9. Użyć sterylnego filtra strzykawkowego 0,45 μm, aby przefiltrować eluat, podwielokrotność w próbkach 5 x 100 μl i zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. Całkowita ilość białka powinna wynosić 0,5 - 1 μg/ml na każde 100 μl podwielokrotności.

opcjonalny krok koncentracji

10. W przypadku stereotaktycznych wstrzyknięć szczurom, białko zagęszczono 10-krotnie w speed-vac (Eppendorf Concentrator 5301). Ostateczny warunek bufora wynosił 100 mM NaPi.

α-synukleina Etykietowanie

Znakowanie i oczyszczanie (kolumna Ni-NTA) rekombinowanej α-synukleiny przeprowadzono równolegle do DISC1 (598-785). Całkowity materiał wyjściowy wynosił 500 μg zamiast 1 mg dla DISC1 (598-785).

6. Leczenie komórek biorcy SH-SY5Y znakowanym rekombinowanym białkiem DISC1 (598-785)

1. Nasiona 5x10⁴ biorców ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y konstytuujących ekspresję GFP-DISC1 (598-854) na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
2. Dodać znakowane białko do pożywki do hodowli komórkowej o stężeniu 5-10 μg/ml i inkubować przez 48-72 godziny.
3. Umyj komórki 3 x PBS pH 7,4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową 0,04% błękitem trypanowym przez 5 minut.
4. Utrwalić komórki za pomocą 4% PFA w PBS pH 7,4 przez 10 minut na lodzie, przemyć raz sterylnym_H2Oi zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą ProLong Gold z podłożem montażowym DAPI (Invitrogen, USA).
5. Potwierdź wychwyt/inwazję egzogennie zastosowanego białka rekombinowanego poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami wyrażanymi przez komórki biorcze w obrazach stosu Z generowanych przez laserową skaningową mikroskopię konfokalną. Jednak rekrutacja endogennego białka może nie być zasadniczo wykrywana równolegle z inwazją białka komórki gospodarza, obrazy Z-stack mogą nadal potwierdzać inwazyjny charakter białka.

W naszym przykładzie rec. DISC1(598-785)* przynajmniej częściowo rekrutuje rozpuszczalne białko DISC1(598-854) znakowane GFP, wyrażane przez komórkę gospodarza (patrz Rysunek 5A). Dla rekombinowanej inwazji α-synukleiny, ale nie wykazano rekrutacji (ryc. 5B). Zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.

Wstrzyknięcie skoncentrowanego (ok. 4 μl z 2,5 μg/μl), oznaczonego jako DISC1(598-785)* do mPFC powoduje rozprzestrzenianie się białka wokół miejsca wstrzyknięcia, co można wykryć nawet po perfuzji zwierzęcia z 4% PFA w PBS pH 7,4 za pomocą zestawu filtrów rodaminy. W naszym przykładzie DISC1 (598-785) jest pochłaniany przez wyraźną liczbę neuronów i może być monitorowany za pomocą obrazowania Z-stack (ryc. 6).

Ogólnie rzecz biorąc, wstrzykiwanie białek innych niż te użyte tutaj niekoniecznie prowadzi do inwazji komórek. Zdarzenie inwazji jest zasadniczo zależne od charakteru białka, niemniej jednak czyste oczyszczenie jest warunkiem wstępnym dalszej analizy.

7. Reprezentatywne wyniki

Aggresomy składające się z rekombinowanego FL DISC1-eGFP oczyszczonego z komórek NLF zaatakowały komórki biorcy SH-SY5Y z niską wydajnością (około 0,3% ⁵), co widać przez kolokalizację za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 3). Jak wcześniej informowano, DISC1 (598-785) wyrażony i oczyszczony z multimerów ^utworzonych przez E. coli 4 był równie inwazyjny dla komórek z wydajnością około 20% ⁵ (Figura 5A) podobnie jak w przypadku α-synukleiny, która była używana równolegle jako kontrola pozytywna (Figura 5B). Znakowany rekombinowany DISC1 (598-785) wyrażany i oczyszczany z E. coli był również inwazyjny dla neuronów in vivo, gdy białko multimeryczne zostało stereotaktycznie wstrzyknięte do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, niepublikowane).

Rysunek 1. Komórki nerwiaka zarodkowego NLF przejściowo eksprymujące FP-DISC1 (czerwony). W komórkach można wykryć agresomy czerwonej fluorescencji.

Rysunek 2. Oczyszczone agresomy DISC1 oznaczone mRFP po oczyszczeniu w gradiencie sacharozy.

Rysunek 3. Fluorescencyjny obraz zaatakowanych agresomów. Aggresomy flDISC1 znakowane mRFP oczyszczono i inkubowano z komórkami nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z nadekspresją rozpuszczalnego DISC1 znakowanego GFP (598-854). Wychwyt znakowanych agresomów jest monitorowany za pomocą obrazowania stosu Z w mikroskopie laserowym (Zeiss LSM 510).

Rysunek 4. Profil SEC rec. DISC1 (598-785) zawierający polimorfizmy pojedynczego nukleotydu S704 i C704 (SNP). Oba warianty wykazują zaburzenie uporządkowanej oligomeryzacji i powstawanie multimerów o dużej masie cząsteczkowej (czerwona strzałka). Ten obraz został zmodyfikowany na podstawie publikacji Leliveld et al., Biochemistry 2009.

Rysunek 5. Fluorescencyjny obraz stosu Z inwazyjnego rekombinowanego DISC1 znakowanego DyLight (598-785). Komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y eksprymujące rozpuszczalny GFP-DISC1 (598-854) inkubowano z znakowanym, rekombinowanym białkiem w stężeniu 5 μg / ml. (A) Czerwone agregaty pokazują inwazję białka rec. DISC1 (598-785), a żółte kropki wskazują na rekrutację rozpuszczalnego GFP-DISC1 (598-854) do agregatów. (B) Rekombinowana α-synukleina (czerwona) atakuje komórki bez rekrutacji z częstością około 20%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 6. Immunofluorescencyjny obraz wstrzykniętego, znakowanego, rekombinowanego białka DISC1 (598-785). Obrazowanie Z-stack potwierdza obecność białka rec. DISC1(598-785) w neuronach korowych szczurów barwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym (NeuN, kolor zielony).

Discussion

W niniejszej pracy opisano oczyszczanie agresomów mRFP/eGFP-DISC1 z transfekowanej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego, przygotowanie i znakowanie rekombinowanych gatunków białek DISC1 oraz ich zastosowanie w eksperymentach inwazji komórkowej komórek biorcy in vitro i in vivo.

Oczyszczanie natywnych agresomów mRFP/eGFP-DISC1 opracowano na podstawie protokołów izolowania struktur podobnych do ciał Lewy'ego i większych agregatów^{13, 14}, ale zmodyfikowano je w celu uniknięcia stosowania detergentów i zminimalizowania ryzyka fałszywie dodatniej inwazji komórek, która może wystąpić w wyniku penetracji błony ułatwionej przez detergent.

Jedną z możliwych przyszłych ulepszeń może być dalsze zwiększanie czystości agresomów za pomocą sonikacji w celu całkowitego oddzielenia pozostałych błon i cytoszkieletu od agresomów. Zwiększając ogólną czystość, można zwiększyć łączną liczbę zdarzeń inwazji zarejestrowanych dla dużych agresomów⁵. Należy sprawdzić, czy ograniczona definicja sugerowanej przez nas 3-fazowej sacharozy jest wystarczająca dla agresomów innych gatunków białek, w tym sensie przedstawiony tutaj protokół powinien być traktowany jako punkt wyjścia do indywidualnej optymalizacji. Oczyszczone agresomy okazały się dość wytrzymałe w naszych rękach, dodatkowe etapy mycia (bez detergentu) w celu wyeliminowania śladowych ilości sacharozy nie zmniejszyły znacząco ogólnej wydajności.

W poprzedniej publikacji opisaliśmy, że składanie oligomerów DISC1 jest zależne od odrębnych domen multimeryzacyjnych w C-końcu⁴ (Figura 4). Wybraliśmy ten fragment do rekombinowanej rozpuszczalnej ekspresji w E. coli, a następnie do oczyszczania i Ni-NTA. Aby monitorować jego multimeryzację i porównać jego inwazyjność komórkową z opisanym białkiem inwazyjnym dla komórek, takim jak α-synukleina, oznaczyliśmy DISC1 (598-785) barwnikiem fluorescencyjnym DyLight594 i porównaliśmy jego inwazyjność komórkową z równo znakowaną α-synukleiną. Inwazyjność komórkowa rekombinowanego fragmentu DISC1 została dramatycznie zwiększona w porównaniu z natywnymi agresomami DISC1 o pełnej długości, prawdopodobnie ze względu na jego mniejszy rozmiar i znacznie wyższą czystość. Ponownie, czystość wydaje się odgrywać decydującą rolę w inwazyjności komórek.

W naszym przykładzie inwazyjne agresomy rekrutowały rozpuszczalne białko homologiczne docelowej linii komórkowej, które uległo rekombinowanej ekspresji w postaci rozpuszczalnej, tj. rozproszonej w komórkach. Ekspresja białka fluorescencyjnego (np. GFP lub RFP) w linii komórkowej biorcy jest zaletą, ponieważ umożliwia kolokalizację inwazyjnych agresomów i rekombinowanych białek w obrębie limitu komórek biorcy poprzez obrazowanie Z-stack.

Inwazyjne dla komórek agresomy DISC1 i fragmenty multimeryczne ulegające ekspresji i oczyszczeniu z E. coli mogą być cechą definiującą choroby konformacyjne białka związane z DISC1, DISC1opatiami ¹⁵.

Rozwiązywanie problemów:

Niski plon agresomu po oczyszczeniu sacharozy w gradiencie:

Gradient sacharozy wprowadzony w tym protokole dobrze współpracuje z agresomami eGFP/mRFP-DISC1(FL). Agresomy składające się z innych białek mogą mieć różne wymiary, dlatego stężenia sacharozy powinny być optymalizowane przez innych użytkowników.

Niewystarczające oczyszczanie białka rekombinowanego:

Wszelkie zanieczyszczenia bakteryjne w procesie oczyszczania rekombinowanego białka zostaną również oznaczone w późniejszych krokach protokołu. Aby uniknąć zanieczyszczeń, uruchom białko na SDS-PAGE i potwierdź, że rekombinowane białko jest czyste w co najmniej 95%, barwiąc Coomassie-Blue. Aby zapewnić najwyższą jakość i wydajność, protokół musi być zoptymalizowany dla każdego białka z osobna.

Niska skuteczność znakowania białek rekombinowanych:

Wszelkie zanieczyszczenia zawierające wolne grupy SH zmniejszają efektywne znakowanie białka. Dlatego obowiązkowa jest intensywna dializa i oczyszczanie oparte na Ni-NTA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093	Pożywka jest zależna od linii komórek gospodarza. Optymalna linia komórkowa biorcy powinna być określona przez użytkownika.
DMEM/F-12	Invitrogen	11320-033	Pożywka jest zależna od linii komórkowej biorcy. Optymalna linia komórkowa biorcy powinna być określona przez użytkownika.
PBS	Invitrogen	14190-250
Metafectene	Biontex	T020-1.0	Inne odczynniki do transfekcji mogą również działać, ale nie zostały przetestowane zgodnie z naszym protokołem.
Agaroza Ni-NTA	Qiagen	30210	Eksperymenty przeprowadzono z agarozą Ni_NTA firmy Qiagen, inni dostawcy również powinni działać.
DNaza I	Roche	04716728001	Nie ma potrzeby stosowania DNazy wolnej od RNaz w procesie oczyszczania agresomów.
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062	Pożywka bez surowicy działa również
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140122	Suplement dla pożywki SH-SY5Y i NLF
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Sigma-Aldrich	M7145	Suplement dla podłoża SH-SY5Y
Błękit trypanowy 0,4%	Sigma-Aldrich	T8154	Odczynnik toksyczny
DyLight 594 Maleimide	Thermo-Fisher Scientific	46608	Zredukowany barwnik reaktywny cysteiny w celu uzyskania stabilnego thi– Z drugiej strony, w tym samym czasie, w którym nie ma nic wspólnego z Dostępny również w innych kolorach.
ProLong Gold z DAPI	Invitrogen	P36935	Ten płynny uchwyt zapobiegający blaknięciu dał doskonałe rezultaty w naszych rękach.
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11873580001	Rozpuść 1 stół w 500 μ l H2O dla roztworu 100X.
Syntetyczna a-synukleina	Sigma	S7820	Złóż zgodnie z opisem w tekście.
Tabela konkretnych odczynników.
Precellys 24	Bertin Technologies	03119.200.RD000	Nie testowaliśmy innych homogenizatorów mechanicznych poza tym. Inne metody homogenizacji bez detergentów mogą również działać, ale nie zostały przetestowane pod kątem tego protokołu.
5301 Koncentrator (speedvac)	Eppendorf	5301 000.210	Konieczne tylko wtedy, gdy białko musi być zagęszczone.
LSM 510 i Axiovision Apotome2	Zeiss	Zobacz katalog producentów	Oba mikroskopy mają możliwość wykonywania obrazowania w układzie Z. Jest to warunek wstępny dla solidnej i poważnej oceny wydarzeń związanych z inwazją.
Tworzywo sztuczne do hodowli komórkowych	Nunc	10 cm szalki #172958, płytki 24-dołkowe #142475	Zastosowanie różnych tworzyw sztucznych może wpływać na interakcję rekombinowanych białek lub agresomów z powierzchniami z tworzywa sztucznego. Nie testowaliśmy materiałów innych niż te opisane tutaj.
Tabela konkretnych materiałów i wyposażenia.
Number Nazwa bufora content Uwagi 1. Bakteryjna pożywka wzrostowa 16 g/l Bacto Trypton, 10 g/l Ekstrakt drożdżowy Bacto, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5mM MGSO4, 100 μ g/ml karpencyliny, 35 & mu; g / ml chloramfenikolu Hoduj bakterie do OD600: 0,6-0,8 indukują ekspresję za pomocą 1 mM IPTG. 2, Bufor do reprodukcji bakterii 50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μ g/ml lizozymu, 20 mM MgCl2 i 400 U/50 ml DNazy I Resupend osad bakteryjny z 1 L hodowli nocnej w 50 ml buforu do rezaspensji. 3, Bufor do ekstrakcji białek 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME 4, bufor do płukania kolumny Ni-NTA 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME, 12 mM imidazol Zmodyfikowany bufor ekstrakcyjny z dodatkiem 12 mM imidazolu. 5, Bufor elucyjny kolumnowy Ni-NTA 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M mocznik, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA i 10 mM b -ME Bufor elucyjny zawiera 10 mM b -ME, który jest później dializowany. 6, PBS 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, dostosować do pH 7,4 7, Bufor do znakowania PBS zawierający 5 mM TCEP Tabela przepisów.