Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka DISC1

Podsumowanie

Opisano generowanie, oczyszczanie oraz inwazję komórkową wewnątrzkomórkowych, cytoplazmatycznych aggresomów pełnowymiarowego białka DISC1 z kultur komórkowych, a także znakowanego, multimerycznego rekombinowanego fragmentu białka DISC1 w E. coli. Inwazyjność komórkową wykazano dla komórek biorców w kulturze komórkowej oraz dla neuronów in vivo po stereotaktycznej inokulacji mózgu.

Streszczenie

Agregacja białek jest uznawana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (Aβ, tau), choroba Parkinsona (α-synuclein), choroba Huntingtona (polyglutamine, huntingtin) i inne. Przyjmuje się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzonej proteostazy, tzn. braku równowagi między powstawaniem a degradacją błędnie sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka występują w formie zagregowanej w sporadycznych postaciach tych chorób, podczas gdy w rzadkich wariantach postaci rodzinnych są one zmutowane.

Schizofrenia jest chronicznym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. W podejściu opartym na genach kandydackich zbadaliśmy, czy białko Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z chronicznymi chorobami psychicznymi^{1, 2}, może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób z przypadkami sporadycznymi schizofrenii³. Korzystając z SMRI CC, zidentyfikowaliśmy u około 20% pacjentów z CMD, ale nie w grupach kontrolnych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkosylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Dalsze badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa związany z chorobą polimorfizm S704C⁴ oraz że aggresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową⁵, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ⁶, tau^7-9, α-synuclein¹⁰, poliglutaminy¹¹ lub SOD1¹². Wyniki te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że co najmniej podgrupa przypadków CMD, a mianowicie te z zagregowanym DISC1, mogą być zaburzeniami konformacyjnymi białek.

W niniejszej pracy opisujemy sposób generowania aggresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczanie na gradiencie sacharozowym oraz wykorzystanie ich w badaniach nad inwazyjnością komórkową. Analogicznie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowanie i oczyszczanie na potrzeby badań nad inwazyjnością komórkową. Wykorzystując rekombinowane multimery DISC1, osiągamy podobną inwazyjność komórkową, jak w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synucleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.

Protokół

1. Przygotowanie komórek donora aggresomów: transfekcja monomerycznej czerwonej białka fluorescencyjnego (mRFP) lub ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) z tagiem pełnej długości (FL) ludzkiego białka DISC1

1. Wysiać 1,5 x 10⁶ komórek ludzkiego neuroblastoma NLF (NLF; Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA) na każdą z dziesięciu szalek o średnicy 10 cm i inkubować przez noc. Komórki NLF hodować w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS, penicylinę/streptomycynę oraz L-glutaminę. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć 70-80% konfluencji.
2. Przeprowadzić transfekcję przejściową komórek na każdej szalce 10 cm za pomocą 15 μg plazmidowego DNA i odczynnika do transfekcji Metafectene (Biontex, Martinsried, Niemcy). W skrócie: dla szalki 10 cm, 15 μg plazmidowego DNA oraz 30 μl Metafectene dodano do 750 μl Opti-MEM, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 min. 5 szalek transfekowano plazmidem pcDNA3.1 z ludzkim (FL) DISC1 oznaczonym mRFP/eGFP, a 5 szalek samym plazmidem eGFP.

2. Oczyszczanie aggresomów z transfektowanych komórek dawcy

Opisany tutaj protokół stanowi połączenie metody oczyszczania ciał Lewy z tkanki mózgowej¹³ oraz protokołu izolacji dużych agregatów i aggresomów¹⁴. Ponieważ istniejące już metody opierają się na zastosowaniu detergentów, kluczowe jest wyizolowanie białka wolnego od detergentów do zastosowania w testach inwazyjności komórkowej.

1. 48 h po transfekcji monitoruj ekspresję eGFP i mRFP/eGFP-DISC1 oraz potwierdź tworzenie się aggresomów pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 1).
2. Przemyj komórki PBS pH 7.4, zeskrob każdą z nich w 400 μl PBS, dodaj 1X koktajl inhibitorów proteaz (Roche, Indianapolis, IN) i rozbij komórki za pomocą homogenizatora Precellys24 (Bertin technologies, Francja). W skrócie: dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do 2 ml probówki do lizy i dodaj 10 kulek ceramicznych. Lizuj komórki za pomocą 3 impulsów po 60 s. Siła mechaniczna tego procesu może podnieść temperaturę w próbce powyżej 37 °C, dlatego należy zadbać o schłodzenie próbki na lodzie po procedurze lizy.
3. Schłodź komórki na lodzie, dodaj 10 mM MgCl₂, 40 U/ml DNazy A i inkubuj przez 60 min w 37 °C.
4. Przygotuj roztwory sacharozy (w/v) o stężeniach 80%, 50% i 20% w PBS pH 7.4 (po 10 ml każdego).
5. Przygotuj gradient sacharozy w 15 ml probówce typu Falcon, zaczynając od 2 ml 80% sacharozy, a następnie dodając 50% i 20%. Wlewaj gradient powoli, uważając, aby nie zmącić już wlanych warstw. Nałóż strawiony lizat na wierzch gradientu i wiruj przez 15 min przy 1000 x g w 4 °C.
6. Ostrożnie pobierz pipetą interfazę między warstwami 50% a 80% sacharozy i zmieszaj z 5 objętościami PBS pH 7.4. Wiruj przez 15 min przy 1000 x g w 4 °C. Powtórz przemywanie jeszcze dwukrotnie. W tej interfazie aggresomy wykazują fluorescencję i można je wizualizować pod mikroskopem w świetle UV.
7. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 250-500 μl PBS pH 7.4. Osad ten zawiera oczyszczone aggresomy (Rycina 2).

3. Traktowanie komórek biorcy SH-SY5Y aggresomami mRFP/eGFP-DISC1

1. Wysiać 5 x 10⁴ komórek neuroblastoma człowieka SH-SY5Y (komórki biorcy), konstytutywnie eksprymujących GFP-DISC1(598-854), na sterylne szkiełka nakrywkowe w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Komórki SH-SY5Y hodować w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej o penicylinę/streptomycynę, niezasadnicze aminokwasy (NEAA) oraz 10% FBS.
2. Po 24 h dodać 10 μl do każdego dołka i inkubować przez 48-72 h.
3. Przemyć komórki 3 x PBS pH 7.4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową za pomocą 0,04% Trypan Blue przez 5 min.
4. Utrwalić komórki w 4% PFA w PBS pH 7.4 przez 10 min na lodzie, przemyć raz sterylną H₂O i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu medium montażowego ProLong Gold z DAPI (Invitrogen, USA).
5. Potwierdzić pobranie/inwazję egzogennie wprowadzonych aggresomów poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami eksprymowanymi przez komórki biorcy na obrazach Z-stack.

Jednakże pobieranie/inwazja białek egzogennych może nie być wykrywalne równolegle z rekrutacją białek komórki gospodarza. W naszym przykładzie aggresomy z DISC1 znakowane mRFP rekrutują rozpuszczalne białko DISC1(598-854) znakowane GFP, ekspresjonowane przez komórkę gospodarza (patrz Rycina 3). Zdjęcia wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.

4. Generowanie rekombinowanego DISC1(598-785)

W poprzedniej publikacji przeanalizowaliśmy zdolność różnych fragmentów białka DISC1 do autinterakcji na podstawie obecności domen samoprzylegania. spośród wszystkich przetestowanych fragmentów białek ludzkie DISC1(598-785) wykazało najsilniejszą tendencję do multimeryzacji⁴ (Rycina 4). W związku z tym ludzkie DISC1(598-785) sklonowano do wektora pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin) zawierającego N-terminalny znacznik 6-histydynowy, wyekspresowano w E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, US) i oczyszczono w warunkach denaturujących w 8 mol/l mocznika zgodnie z opisem⁴. Poniżej przedstawiono skrócony opis protokołu.

1. Bakterie BL21-(IDE3) Rosetta E. coli hodowano w 2 x 500 ml pożywki 2YT zawierającej 5 mM-argininę-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu do osiągnięcia OD₆₀₀: 0,6-0,8, a następnie indukowano ekspresję DISC1(598-785) za pomocą 1 mM IPTG.
2. Ekspresję DISC1(598-785) prowadzono przez 4 hr w 37 °C, a następnie przerwano ją poprzez zebranie bakterii metodą wirowania.
3. Osad bakteryjny resuspendowano w 50 ml buforu TE (50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) z dodatkiem 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lizozymu, 20 mM MgCl₂ oraz 400 U/50 ml DNazy I. Aby zapewnić całkowitą lizę, mieszaninę inkubowano przez 30 min w RT przy łagodnym mieszaniu.
4. Dodano 10 mM β-merkaptoetanolu (ME) oraz 500 mM NaCl i inkubowano przez kolejne 30 min.
5. Ciałka inkluzyjne bakterii osadzono przez wirowanie przy 20.000 g przez 30 min w 4 °C.
6. Osad resuspendowano w 50 ml buforu ekstrakcyjnego zawierającego 50mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 8 M mocznika oraz 10 mM β-ME, a następnie usunięto zanieczyszczenia przez wirowanie przy 20.000 g przez 30 min w 4 °C.
7. Matrycę agarozową Ni-NTA przemyto buforem ekstrakcyjnym. Resuspendowany, uprzednio oczyszczony ekstrakt białkowy inkubowano z matrycą Ni-NTA przez 2 hr w RT.
8. Matrycę Ni-NTA przemyto buforem ekstrakcyjnym zawierającym 12 mM imidazolu.
9. Białko elukowano powoli za pomocą 15 ml buforu elucyjnego zawierającego 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolu, 8 M mocznika, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA oraz 10 mM β-ME.
10. Białko dializowano etapowo przeciwko PBS pH 7,4 zawierającemu 10 mM β-ME.

Z 1 L kultury startowej bakterii można wyizolować do 50 mg rekombinowanego białka DISC1(598-785).

Renaturacja α-synucleiny

Do eksperymentów z α-synukleiną wykorzystano 500 μg rekombinowanego białka (Sigma-Aldrich, USA), które rozpuszczono w PBS do stężenia 1 mg/ml. W celu otrzymania oligomerów przeprowadzono refolding przez noc w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji¹⁰.

5. Znakowanie rekombinowanego białka DISC1(598-785) barwnikiem DyLight594

1. Przed kolejnym etapem znakowania białko DISC1(598-785) musi zostać uwolnione z β-ME. W związku z tym białko poddaje się dializie 3-krotnie przeciwko PBS pH 7.4 w rozcieńczeniu 1:2,000.
2. Znakuj 1 mg białka DISC1(598-785) przy użyciu DyLight 594 maleimide (Thermo Scientific, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: rozpuść 1 mg/ml białka w PBS pH 7.4 i dodaj 5 mM TCEP, aby przywrócić wolne grupy tiolowe. Dodaj 20 μl barwnika rozpuszczonego w DMF do mieszaniny reakcyjnej i inkubuj przez 2 hr w RT.
3. Dializuj białko 3 x przeciwko PBS pH 7.4 w stosunku 1:2000 przez 2 hr w każdej sesji.

Aby dodatkowo zwiększyć czystość znakowanego białka, przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa oparte na znaczniku His₆ na kolumnie Ni-NTA.

4. Przemyć 1 ml macierzy Ni-NTA (Qiagen, Niemcy) za pomocą 10 ml PBS pH 7.4.
5. Nanieść znakowane, dializowane białko na kolumnę i pozwolić mu powoli przez nią spłynąć.
6. Przemyć białko 3 x 20 ml PBS pH 7.4.
7. Eluować białko, dodając kroplami PBS pH 7.4 z 500 mM imidazolem, monitorując jednocześnie kolorowy prążek na kolumnie Ni-NTA, aby zminimalizować objętość eluatu.
8. Przedializować eluat 3 razy przeciwko 10 mM NaPi pH 7.4 przy rozcieńczeniu 1:2000 przez 2 h w każdym cyklu.
9. Przefiltrować eluat za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0.45 μm, rozdzielić na 5 x 100 μl próbek i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie. Całkowita ilość białka w każdej 100 μl porcji powinna wynosić 0.5 - 1 μg/ml.

opcjonalny etap zagęszczania

10. W celu wykonania stereotaktycznych iniekcji u szczurów, białko zagęszczono 10-krotnie w wirówce próżniowej (Eppendorf Concentrator 5301). Końcowy skład buforu wynosił 100 mM NaPi.

Znakowanie α-synukleiny

Oznakowanie i oczyszczanie (kolumna Ni-NTA) rekombinowanej α-synukleiny przeprowadzono równolegle do DISC1(598-785). Całkowita ilość materiału wyjściowego wynosiła 500 μg zamiast 1 mg w przypadku DISC1(598-785).

6. Inkubacja komórek biorców SH-SY5Y z znakowanym rekombinowanym białkiem DISC1 (598-785)

1. Wysiać 5x10⁴ komórek biorcy – ludzkich komórek neuroblastoma SH-SY5Y konstytutywnie eksponujących GFP-DISC1(598-854) – na sterylnych szkiełkach podstawkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
2. Dodać znakowane białko do pożywki hodowlanej w stężeniu 5-10 μg/ml i inkubować przez 48-72 hr.
3. Przemyć komórki 3 x w PBS pH 7.4 i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową przy użyciu 0,04% błękitu trypanu przez 5 min.
4. Utrwalić komórki w 4% PFA w PBS pH 7.4 przez 10 min na lodzie, przemyć raz sterylną H₂O i zamontować szkiełka podstawkowe na szkiełkach przedmiotowych, stosując medium montażowe ProLong Gold z DAPI (Invitrogen, USA).
5. Potwierdzić pobranie/inwazję egzogennie podanego białka rekombinowanego poprzez kolokalizację z białkami rekrutowanymi, eksponowanymi przez komórki biorcy, na obrazach Z-stack uzyskanych za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Nawet jeśli rekrutacja białka endogennego nie zostanie wyraźnie wykryta równolegle z inwazją białka komórki gospodarza, obrazy Z-stack mogą nadal potwierdzić inwazyjny charakter białka.

W naszym przykładzie rekombinowany DISC1(598-785)* przynajmniej częściowo rekrutuje rozpuszczalne białko DISC1(598-854) z tagiem GFP ekspresjonowane przez komórkę gospodarza (patrz Rysunek 5A). W przypadku rekombinowanej α-synukleiny wykazano inwazję, ale brak rekrutacji (Rysunek 5B). Zdjęcia wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 lub mikroskopu Zeiss Axiovision Apotome2.

Wstrzyknięcie stężonego (ok. 4 μl w stężeniu 2,5 μg/μl), znakowanego DISC1(598-785)* do mPFC skutkuje rozprzestrzenieniem się białka wokół miejsca wstrzyknięcia, co można wykryć nawet po perfuzji zwierzęcia 4% PFA w PBS pH 7,4 przy użyciu zestawu filtrów do rodaminy. W naszym przykładzie DISC1(598-785) jest pobierany przez określoną liczbę neuronów i może być monitorowany za pomocą obrazowania Z-stack (Rysunek 6).

Ogólnie rzecz biorąc, wstrzykiwanie białek innych niż te zastosowane w niniejszej pracy nie musi prowadzić do inwazji komórkowej. Zjawisko inwazji zależy w zasadzie od natury białka, niemniej jednak czyste oczyszczenie jest warunkiem wstępnym do dalszej analizy.

7. Reprezentatywne wyniki

Aggresomy składające się z rekombinowanego FL DISC1-eGFP oczyszczonego z komórek NLF wnikały do komórek biorcy SH-SY5Y z niską wydajnością (około 0,3% ⁵), co wykazano poprzez kolokalizację w mikroskopii konfokalnej (Rysunek 3). Jak zgłoszono wcześniej, DISC1(598-785) ekspresowany i oczyszczony z E. coli, który tworzył multimery ⁴, wykazywał podobną zdolność do wnikania do komórek przy wydajności około 20% ⁵ (Rysunek 5A), co było zbliżone do wyników dla α-synukleiny, użytej równolegle jako kontrola pozytywna (Rysunek 5B). Znakowany rekombinowany DISC1(598-785) ekspresowany i oczyszczony z E. coli był również zdolny do wnikania do neuronów in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu multimerycznego białka do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura (Rysunek 6; Pum, Bader, Huston, Korth, niepublikowane).

Rycina 1. Komórki neuroblastoma NLF przejściowo eksponujące FP-DISC1 (czerwony). Wewnątrz komórek można wykryć czerwone fluorescencyjne aggresomy.

Rycina 2. Oczyszczone aggresomy DISC1 znakowane mRFP po oczyszczaniu w gradiencie sacharozy.

Rycina 3. Obraz fluorescencyjny zainwadowanych aggresomów. Oczyszczone aggresomy flDISC1 znakowane mRFP inkubowano z komórkami neuroblastoma SH-SY5Y nadekspresującymi rozpuszczalne DISC1(598-854) znakowane GFP. Pobieranie znakowanych aggresomów monitorowano za pomocą obrazowania Z-stack na mikroskopie skaningowym laserem (Zeiss LSM 510).

Rycina 4. Profil SEC rekombinowanego białka DISC1(598-785) zawierającego polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) S704 i C704. Oba warianty wykazują zaburzenie uporządkowanej oligomeryzacji i tworzenie multimerów o wysokiej masie cząsteczkowej (czerwona strzałka). Rycina zmodyfikowana na podstawie publikacji Leliveld et al., Biochemistry 2009.

Rysunek 5. Obraz Z-stack z mikroskopii fluorescencyjnej inwazyjnego, znakowanego DyLight rekombinowanego białka DISC1(598-785). Komórki neuroblastoma SH-SY5Y wykazujące ekspresję rozpuszczalnego GFP-DISC1(598-854) inkubowano z znakowanym białkiem rekombinowanym w stężeniu 5 μg/ml. (A) Czerwone agregaty obrazują inwazję rekombinowanego białka DISC1(598-785), a żółte kropki wskazują rekrutację rozpuszczalnego GFP-DISC1(598-854) do agregatów. (B) Rekombinowana α-synukleina (czerwona) wnika do komórek bez rekrutacji z częstotliwością około 20%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 6. Obraz immunofluorescencyjny wstrzykniętego, znakowanego rekombinowanego białka DISC1(598-785). Obrazowanie Z-stack potwierdza obecność białka rec. DISC1(598-785) w neuronach kory szczura zabarwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym (NeuN, zielony).

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisujemy oczyszczanie aggresomów mRFP/eGFP-DISC1 z transfekowanej linii komórek neuroblastoma, przygotowanie i znakowanie rekombinowanego białka DISC1 oraz ich zastosowanie w eksperymentach dotyczących inwazyjności komórkowej w komórkach biorców in vitro oraz in vivo.

Oczyszczanie natywnych aggresomów mRFP/eGFP-DISC1 opracowano na podstawie protokołów izolacji struktur przypominających ciałka Lewy'ego oraz większych agregatów^{13, 14}, jednak zmodyfikowano je, aby uniknąć stosowania detergentów i zminimalizować ryzyko fałszywie dodatniego wyniku inwazji komórkowej, która mogłaby wystąpić wskutek ułatwionej przez detergenty penetracji błon.

Jedną z możliwych przyszłych ulepszeń mogłoby być dalsze zwiększenie czystości aggresomów poprzez sonikację, aby całkowicie oddzielić pozostałe membrany i cytoszkielet od aggresomów. Poprzez zwiększenie ogólnej czystości, liczba zarejestrowanych całkowitych zdarzeń inwazji dla dużych aggresomów może ulec zwiększeniu⁵. To, czy ograniczona definicja sugerowanego przez nas 3-fazowego gradientu sacharozy jest wystarczająca dla aggresomów innych gatunków białek, wymaga przetestowania; w tym sensie opisany tutaj protokół należy traktować jako punkt wyjścia do indywidualnej optymalizacji. Oczyszczone aggresomy okazały się w naszych badaniach dość stabilne; dodatkowe etapy przemywania (bez detergentu) w celu usunięcia śladów sacharozy nie zmniejszyły znacząco całkowitej wydajności.

W poprzedniej publikacji opisaliśmy, że montaż oligomerów DISC1 zależy od odrębnych domen multimeryzacji w C-końcu⁴ (Rysunek 4). Fragment ten wybraliśmy do rekombinacyjnej ekspresji rozpuszczalnej w E. coli i późniejszego oczyszczania za pomocą Ni-NTA. Aby monitorować jego multimeryzację i porównać jego inwazyjność komórkową z opisanym białkiem inwazyjnym, takim jak α-synuclein, oznakowaliśmy DISC1(598-785) fluorescencyjnym barwnikiem DyLight594 i porównaliśmy jego inwazyjność komórkową z inwazyjnością analogicznie oznakowanej α-synuclein. Inwazyjność komórkowa rekombinowanego fragmentu DISC1 była znacznie większa w porównaniu z natywnymi, pełnowymiarowymi aggresomami DISC1, co prawdopodobnie wynika z jego mniejszego rozmiaru i znacznie wyższej czystości. Ponownie wydaje się, że czystość odgrywa decydującą rolę w inwazyjności komórkowej.

W naszym przykładzie inwazyjne aggresomy rekrutowały rozpuszczalne białko homologiczne z linii komórkowej docelowej, które zostało wyrażone rekombinacyjnie w formie rozpuszczalnej, t.j. rozproszonej w komórce. Ekspresja białka fluorescencyjnego (np. GFP lub RFP) w linii komórkowej biorcy jest korzystna, ponieważ pozwala na kolokalizację inwazyjnych aggresomów i białek rekombinowanych w obrębie granic komórki biorcy za pomocą obrazowania Z-stack.

Inwazyjne komórkowo aggresomy DISC1 oraz fragmenty multimeryczne ekspresowane i oczyszczane z E. coli mogą stanowić cechę definiującą białkowe choroby konformacyjne związane z DISC1, czyli DISC1opatie ¹⁵.

Rozwiązywanie problemów:

Niska wydajność aggresomów po oczyszczaniu w gradiencie sacharozy:

Gradient sacharozy wprowadzony w tym protokole działa skutecznie w przypadku aggresomów eGFP/mRFP-DISC1(FL). Aggresomy składające się z innych białek mogą mieć różne rozmiary, dlatego stężenia sacharozy powinny zostać zoptymalizowane przez innych użytkowników.

Niewystarczające oczyszczanie białka rekombinowanego:

Wszelkie zanieczyszczenia bakteryjne w procesie oczyszczania białka rekombinowanego zostaną również znakowane w późniejszych etapach protokołu. Aby uniknąć zanieczyszczeń, należy poddać białko elektroforezie SDS-PAGE i potwierdzić, że białko rekombinowane jest czyste w co najmniej 95% poprzez barwienie Coomassie-Blue. W celu zapewnienia najwyższej jakości i wydajności, protokół musi zostać zoptymalizowany dla każdego konkretnego białka.

Niska wydajność znakowania białek rekombinowanych:

Wszelkie zanieczyszczenia zawierające wolne grupy SH zmniejszą wydajność znakowania białka. Dlatego niezbędne jest przeprowadzenie dokładnej dializy oraz oczyszczania z wykorzystaniem Ni-NTA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093	Medium zależy od linii komórek gospodarza. Optymalna linia komórek biorcy powinna zostać określona przez użytkownika.
DMEM/F-12	Invitrogen	11320-033	Medium zależy od linii komórek biorcy. Optymalną linię komórek biorcy powinien określić użytkownik.
PBS	Invitrogen	14190-250
Metafectene	Biontex	T020-1.0	Inne odczynniki do transfekcji mogą również być skuteczne, jednak nie zostały one przetestowane w ramach naszego protokołu.
agaroza Ni-NTA	Qiagen	30210	Eksperymenty przeprowadzono z użyciem agarozy Ni_NTA firmy Qiagen, jednak produkty innych dostawców powinny również być odpowiednie.
DNaza I	Roche	04716728001	W procesie oczyszczania aggresomów nie ma potrzeby stosowania DNazy wolnej od RNazy.
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062	Pożywka bezsurowicza sprawdza się równie dobrze
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140122	Suplement do pożywki dla komórek SH-SY5Y i NLF
Niezbędne aminokwasy (NEAA)	Sigma-Aldrich	M7145	Suplement do pożywki dla komórek SH-SY5Y
Błękit trypanu 0,4%	Sigma-Aldrich	T8154	Toksyczny odczynnik
DyLight 594 Maleimide	Thermo-Fisher Scientific	46608	Zredukowany barwnik reaktywny z cysteiną w celu utworzenia stabilnych grup tio–więzi. Dostępne również w innych kolorach.
ProLong Gold z DAPI	Invitrogen	P36935	Ten medium montażowe zapobiegające blaknięciu (antifade) zapewnił w naszych badaniach lepsze rezultaty.
koktajl inhibitorów proteaz	Roche	11873580001	Rozpuścić 1 tabletkę w 500 μl H2O dla roztworu 100X.
Syntetyczna α-synukleina	Sigma	S7820	Przeprowadzić refolding zgodnie z opisem w tekście.
Tabela specyficznych odczynników.
Precellys 24	Bertin Technologies	03119.200.RD000	Nie testowaliśmy innych homogenizatorów mechanicznych niż ten. Inne metody homogenizacji bez użycia detergentów również mogą być skuteczne, jednak nie zostały one sprawdzone w ramach niniejszego protokołu.
Koncentrator 5301 (speedvac)	Eppendorf	5301 000.210	Konieczne tylko w przypadku konieczności zagęszczenia białka.
LSM 510 oraz Axiovision Apotome2	Zeiss	Patrz w katalogu producenta	Oba mikroskopy posiadają funkcję obrazowania w stosie Z (Z-stack). Jest to warunek niezbędny do rzetelnej i wiarygodnej oceny zdarzeń inwazyjnych.
Plastikowy materiał do hodowli komórkowych	Nunc	szalki 10 cm #172958, płytki 24-dołkowe #142475	Zastosowanie różnych materiałów z tworzyw sztucznych może wpływać na oddziaływanie białek rekombinowanych lub aggresomów z powierzchniami plastikowymi. Nie testowaliśmy materiałów innych niż opisane w niniejszym opracowaniu.
Tabela konkretnych materiałów i sprzętu.
Numer	Nazwa buforu	Agregacja białek jest uważana za ogólną cechę charakterystyczną przewlekłych, degeneracyjnych schorzeń mózgu, takich jak na przykład neurodegeneracyjne choroby Alzheimera (Aβ, tau), Parkinsona (α-synukleina), Huntingtona (poliglutamina, huntingtyna) i inne. Uważa się, że agregacja białek zachodzi w wyniku zaburzeń proteostazy, czyli braku równowagi między powstawaniem a degradacją źle sfałdowanych białek. Warto zauważyć, że te same białka występują w formie zagregowanej w sporadycznych postaciach tych chorób, jak i w rzadkich wariantach postaci rodzinnych, w których są one zmutowane. Schizofrenia jest przewlekłym, postępującym schorzeniem mózgu, któremu w wielu przypadkach towarzyszy trwały i nieodwracalny deficyt poznawczy. W podejściu opartym na genie kandydującym zbadaliśmy, czy białko DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia 1) – gen sklonowany w szkockiej rodzinie z powiązaniem z przewlekłą chorobą psychiczną (CMD) – może występować w formie nierozpuszczalnych agregatów w mózgach osób ze sporadyczną schizofrenią. Wykorzystując SMRI CC, zidentyfikowaliśmy w około 20% przypadków CMD, ale nie w grupach kontrolnych ani u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, immunoreaktywność DISC1 nierozpuszczalną w sarkosylu po frakcjonowaniu biochemicznym. Kolejne badania in vitro wykazały, że na skłonność DISC1 do agregacji wpływa związany z chorobą polimorfizm S704C, a agresomy DISC1 generowane in vitro wykazują inwazyjność komórkową, podobnie jak wykazano w przypadku agregatów Aβ, tau, α-synukleiny, poliglutaminy lub SOD1. Wyniki te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że co najmniej podgrupa przypadków CMD – a konkretnie pacjenci z zagregowanym białkiem DISC1 – może należeć do zaburzeń konformacyjnych białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy sposób generowania agresomów DISC1 w komórkach ssaków, ich oczyszczania na gradiencie sacharozy oraz wykorzystania ich do badań nad inwazyjnością komórkową. Podobnie opisujemy sposób generowania wyłącznie multimerycznego fragmentu C-końcowego DISC1, jego znakowania i oczyszczania na potrzeby badań nad inwazyjnością komórkową. Używając rekombinowanych multimerów DISC1, osiągnęliśmy podobną inwazyjność komórkową, co w przypadku analogicznie znakowanego syntetycznego fragmentu α-synukleiny. Wykazujemy również, że fragment ten jest pobierany in vivo po stereotaktycznym wstrzyknięciu do mózgu zwierząt biorców.	Komentarze
1.	Pożywka do wzrostu bakterii	16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM argininy-HCl, 5 mM MGSO4, 100 μg/ml karbenicyliny, 35 μg/ml chloramphenikolu	Hodować bakterie do OD600: 0,6-0,8 indukować ekspresję przy użyciu 1 mM IPTG.
2.	Bufor do resuspensji bakterii	50 mM TRIS-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lizozymu, 20 mM MgCl22 oraz 400 U/50 ml DNazy I	Osad bakteryjny z 1 l hodowli nocnej zawiesić ponownie w 50 ml buforu do resuspensji.
3.	Bufor do ekstrakcji białek	50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME
4.	Bufor do płukania kolumny Ni-NTA	50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M mocznik i 10 mM b-ME, 12 mM imidazol	Zmodyfikowany bufor ekstrakcyjny z dodatkiem 12 mM imidazolu.
5.	bufor elucyjny do kolumny Ni-NTA	50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M mocznik, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA i 10 mM b-ME	Bufor elucyjny zawiera 10 mM β-ME, który jest później dializowany.
6.	PBS	8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, doprowadzić do pH 7,4
7.	Bufor do znakowania	PBS zawierający 5 mM TCEP
Tabela z recepturami.