Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Podsumowanie

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Elektroprzędzenie jest skuteczną metodą przetwarzania służącą do otrzymywania nanowłókien udekorowanych grupami funkcjonalnymi. Nanowłókna udekorowane grupami funkcjonalnymi mogą być wykorzystywane do badania oddziaływań między materiałem a biomarkerami, tj. pełnić rolę biosensorów z potencjałem do wykrywania pojedynczych cząsteczek. Opracowaliśmy skuteczne podejście do przygotowania polimerów funkcjonalnych, w których funkcjonalność umożliwia specyficzne wiązanie z białkiem modelowym. W naszym systemie modelowym grupą funkcjonalną jest 2,4-dinitrofenyl (DNP), a białkiem jest anty-DNP IgE (immunoglobulina E). Polimer funkcjonalny, α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), przygotowano w drodze anionowej polimeryzacji żyjącej. Difunkcyjny inicjator wykorzystany w polimeryzacji otrzymano w reakcji przeniesienia elektronu pomiędzy α-metylostyrenem a metalicznym potasem (lustrzanym). Do inicjatora dodano najpierw monomer 2-metoksystyrenu, następnie drugi monomer, tlenek etylenu, a na koniec polimer żyjący zakończono metanolem. Polimer α,ω-dihydroksylowy [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] poddano reakcji z kwasem N-2,4-DNP-∈-aminokapronowym za pomocą sprzęgania DCC, co doprowadziło do powstania α,ω-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polimery scharakteryzowano za pomocą FT-IR, ¹H NMR oraz chromatografii żelowej (GPC). Rozkłady mas cząsteczkowych polimerów były wąskie (1,1-1,2), a w badaniu wykorzystano polimery o masach cząsteczkowych przekraczających 50 000. Polimery miały postać żółtych proszków i były rozpuszczalne w tetrahydrofuranie. Rozpuszczalny w wodzie kompleks CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimetoksyglikol etylenowy) wiąże się i osiąga stan równowagi wiązania z rozpuszczoną IgE w ciągu kilku sekund. Polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP o wyższej masie cząsteczkowej (nierozpuszczalne w wodzie, tj. około 50 000), zawierające 1% jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT), przetworzono na elektroaktywne nanowłókna (o średnicy od 100 nm do 500 nm) na podłożu krzemowym. Spektroskopia fluorescencyjna wykazuje, że anty-DNP IgE oddziałuje z nanowłóknami poprzez wiązanie się z grupami funkcjonalnymi DNP dekorującymi włókna. Obserwacje te sugerują, że odpowiednio funkcjonalizowane nanowłókna dają nadzieję na opracowanie urządzeń do wykrywania biomarkerów.

Protokół

1. Synteza polimeru α,ω-dihydroksylowego [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

1. Zmontować reaktor polimeryzacyjny zgodnie z Rysunkiem 1. Reaktor do tego doświadczenia składa się ze 100 ml kolby okrągło dna dwuszyjnej ze standardowym szlifem zewnętrznym (Chemglass), dwóch adapterów sterujących przepływem z kurkami (Chemglass) oraz jednej teflonowej prętowej mieszadła. Adapter A (Rysunek 1) służył do zapewnienia przepływu azotu o ultra wysokiej czystości (UHP) przez system w celu zapobiegania przedostawaniu się powietrza i wilgoci do układu obojętnego. Adapter B (Rysunek 1) służył do wprowadzania rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora do kolby reakcyjnej.
2. Osuszyć 200 ml tetrahydrofuranu (THF) nad metalicznym Na, używając benzofenonu jako wskaźnika, przez minimum 6 hr w strumieniu suchego azotu.
3. Osuszyć 10 ml 2-metoksystyrenu nad wodorkiem wapnia przez 24 hr.
4. Przygotować kąpiel niskotemperaturową utrzymującą temperaturę -78 °C, używając zawiesiny izopropanolu i ciekłego azotu.
5. Wlać 25 ml THF do kolby reakcyjnej do polimeryzacji (patrz Rysunek 1) w atmosferze azotu i utrzymywać reaktor w strumieniu azotu przez cały proces polimeryzacji.
6. Umieścić kolbę okrągło dna o pojemności 100 ml w zawiesinie.
7. Dodać 2 ml (0,27 mmol/ ml) roztworu inicjatora do kolby reakcyjnej.
8. Wprowadzić pierwszy monomer, 2-metoksystyren (4 ml), do kolby reakcyjnej.
9. Pozostawić reakcję na 40 min.
10. Dodać 1 ml drugiego monomeru, tlenku etylenu.
11. Kontynuować polimeryzację w temperaturze pokojowej przez dwa dni.
12. Zakończyć polimeryzację za pomocą HCl (6 M)/metanolu (1/20, obj/obj).
13. Oczyścić polimer poprzez wytrącenie w heksanach i wysuszyć polimer w suszarce próżniowej.
14. Przeprowadzić charakterystykę polimeru za pomocą NMR.

2. Funkcjonalizacja polimeru α,ω-dihydroksylowego kwasem N-2,4-DNP-ε-aminokapronowym w celu otrzymania funkcjonalnego polimeru CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

1. Do kolby trójszyjnej wprowadzić polimer α,ω-dihydroksylowy (0,05 mmol), kwas N-2,4-DNP-E-aminokapronowy (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) oraz DMAP (0,005 mmol), a następnie suszyć na linii próżniowej przez 4 hr.
2. Do kolby wlać przez destylację suchy dichlorometan (10 ml).
3. Zwolnić próżnię w atmosferze azotu i mieszać mieszaninę reakcyjną przez 12 hr w temperaturze pokojowej.
4. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną i odzyskać polimer poprzez dwukrotne wytrącenie w heksanach i metanolu.
5. Wysuszyć wytrącony polimer w suszarce próżniowej w temperaturze 40 °C.
6. Określić strukturę i funkcjonalność polimeru za pomocą FT-IR oraz ¹H NMR.

3. Przygotowanie roztworu CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT do elektrowprzędania

1. Rozpuścić 20 w % CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP w chlorobenzenie.
2. Rozpuścić 20 w % oraz 40 w % polistyrenu (MW 800,000) w chlorobenzenie w celu przygotowania dwóch roztworów. Polistyren o wyższej masie cząsteczkowej jest stosowany w celu zwiększenia splątania łańcuchów polimerowych i uzyskania optymalnej lepkości wymaganej do elektroprzędzenia.
3. Zmieszać roztwory polimerów przygotowane w punktach 3.1 i 3.2 w proporcjach 1:1 oraz 1:2, dodać do mieszaniny 1 w % jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT) i mieszać przez noc w celu równomiernego rozprzestrzenienia CNT.

4. Elektroprzędzenie kompozytu polimerowo-CNT

1. Zmontuj zestaw do elektroprzędzenia zgodnie z Rysunkiem 2. Po prawej stronie rysunku znajduje się źródło wysokiego napięcia Glassman. Obok niego znajduje się statyw laboratoryjny, do którego przymocowany jest wafelek krzemowy. Po lewej stronie znajduje się kolejny statyw laboratoryjny, na którym zamontowano strzykawkę, a za nim lampa umożliwiająca wizualizację przebiegu procedury.
2. Za pomocą strzykawki podskórnej pobierz niewielką ilość mieszaniny CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT (około 1 ml) i zamontuj strzykawkę na statywie laboratoryjnym.
3. Wafelek krzemowy zamocuj naprzeciwko strzykawki w bezpiecznej odległości 10 cm, a do niego przyczep zacisk uziemiający źródła wysokiego napięcia.
4. Przymocuj zacisk doprowadzający wysokie napięcie do igły strzykawki, lekko wciśnij tłok (aby na końcówce igły zawisła kropla) – w tym momencie układ do elektroprzędzenia jest gotowy.
5. Włącz źródło wysokiego napięcia i ustaw woltomierz na 10 kV. W zależności od rodzaju polimerów w kompozycie może być wymagane zastosowanie wyższych napięć, zwłaszcza jeśli pożądane są nanowłókna o średnicy poniżej stu nanometrów.
6. Zdejmij wafelek krzemowy i umieść go w eksykatore na noc, aby całkowicie go wysuszyć.

5. Charakterystyka nanowłókien

1. Wstępne obrazowanie nanowłókien wykonuje się za pomocą mikroskopu optycznego, aby przeanalizować ogólną strukturę włókien.
2. Wykorzystaj skaningowy mikroskop elektronowy do obserwacji szczegółów, takich jak morfologia, średnica, średnia wielkość porów itp.
3. Przeprowadź dalsze obrazowanie za pomocą mikroskopu sił atomowych w celu obserwacji topografii 3D włókien itp.

6. Specyficzność wiązania nanowłókien z białkiem anty-DNP IgE

1. Przygotować roztwór FITC-IgE (izocytjanian fluoresceiny-immunoglobulina E) o stężeniu 4 ug/l w roztworze PBS-BSA (bufor srolowy z fosforanem i albuminą surowiczą bydlęcą).
2. Umieścić niewielki fragment wafla krzemowego z nanowłóknami na szkiełku przykrywkowym do dołków MatTek. Inkubować nanowłókna w tym roztworze przez jedną godzinę. Inkubację przeprowadza się poprzez delikatne naniesienie pipetą 10 ul roztworu IgE na wafel krzemowy.
3. Po inkubacji usunąć niezwiązaną IgE, trzykrotnie płucząc próbkę roztworem buforu PBS-BSA. Roztwór PBS należy wlewać delikatnie na ściankę naczynia MatTek, aby uniknąć bezpośredniego strumieniowania buforu na nanowłókna. Delikatnie zakręcić naczyniem ręcznie, aby rozprowadzić roztwór buforu na nanowłóknach. Ostrożnie usunąć bufor pipetą i powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.
4. W celu wykonania próby kontrolnej inkubować nanowłókna w znakowanej fluorescencyjnie IgG (nieswoistej dla DNP) w tych samych warunkach.
5. Zwizualizować związane włókna za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zaobserwować wiązanie z IgE. W naszym badaniu użyto mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP2 z obiektywem 63x.

7. Charakterystyka prądowo-napięciowa nanowłókien

1. Podłącz dwa mikropozycjonery do źródła bardzo niskiego prądu, takiego jak czuły miernik źródłowy Keithley 6430. Układ do wyznaczania zależności prądowo-napięciowej przedstawiono na Rysunku 3. Rysunek ten pokazuje stację sondy wykorzystaną do wyznaczenia początkowych charakterystyk I-V nanowłókien. Składa się ona z mikroskopu Bausch and Lomb MicroZoom, stołu z uchwytem próżniowym oraz czterech mikropozycjonerów używanych do sondowania. W prawym górnym rogu znajduje się cyfrowy multimetr Agilent 34405A służący do pomiaru napięcia, a poniżej niego miernik źródłowy Keithley 6430 Sub-Femtoamp Remote Source Meter, służący do generowania niskich prądów wprowadzanych do włókien.
2. Zamocuj ramiona sond mikropozycjonerów nad matą z włókien po przeciwnych stronach, tak aby końcówki dotykały włókien.
3. Podłącz kolejne dwa mikropozycjonery do cyfrowego multimetru, zamocuj ramiona sond pomiędzy pozostałymi dwoma i oprzyj końcówki o matę z włókien. Upewnij się, że wszystkie cztery końcówki są w jak największym stopniu współliniowe.
4. Wprowadź zmienne wartości prądu z urządzenia Keithley (zazwyczaj z zakresu nanoamperów).
5. Dla każdej wartości dostarczonego prądu zmierz spadek napięcia między zewnętrznymi końcówkami.
6. Wykreślenie tych wartości pozwoli określić, jakiego typu urządzeniem jest mata z włókien.

8. Reprezentatywne wyniki

Polimer funkcyjny

Metoda syntezy α,ω-bi[2,4-dinitrophenylo-kapronianu][poli(tlenku etylenu)-b-poli(2-metoksystyrenu)-b-poli(tlenku etylenu)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP) przedstawiona jest na Rysunku 4.¹ Strukturę funkcjonalnego polimeru potwierdzono za pomocą spektroskopii FT-IR (Rysunek 5) oraz spektroskopii ¹H NMR 500 MHz (Rysunek 6). Widmo FT-IR wykazuje całkowity zanik szerokiego pasma absorpcji grup -OH w okolicach 3,500 cm^-1, co wskazuje na ilościową funkcjonalizację grupami CDNP. Potwierdza to również widmo NMR przedstawione na Rysunku 6. Na podstawie całkowania pików w widmie NMR ustalono, że polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP zostały sfunkcjonalizowane ilościowo.

Nanowłókna

Na Rysunku 7 przedstawiono matę przewodzących nanowłókien otrzymanych poprzez elektroprzędzenie CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyrenu/SWCNT z chlorobenzenu. Uzyskane obrazy konfokalne wykazały, że białko IgE wiąże się z DNP na powierzchni włókna.³ Świadczy to o specyficzności wiązania elektroprzędzonych polimerów DNP względem przeciwciała IgE. Natężenie światła jest wskaźnikiem obecności IgE na nanowłóknach, ponieważ białko to jest znakowane fluorescencyjnie.

Rysunek 8a przedstawia obraz AFM (mikroskopii sił atomowych) jednego z nanowłókien otrzymanych tą metodą, a Rysunek 8b pokazuje, że średnica tego konkretnego nanowłókna wynosi około 150 nm. Dzięki temu procesowi otrzymuje się włókna o średnicy od 100 do 700 nm. Obecnie przygotowanie włókien o ściśle określonych wymiarach jest trudne. Jest to zgodne z obserwacjami innych grup badawczych.⁴ Rysunek 9 przedstawia obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT, których średnica wynosiła od 200 nm do 300 nm. Przedstawiono trzy obrazy SEM nanowłókien przy różnych powiększeniach. Analiza tych trzech obrazów wykazuje, że morfologia włókien jest liniowa lub kropelkowata. Głównym celem jest przygotowanie włókien, które są w przeważającej mierze liniowe. Rysunek 10 przedstawia charakterystykę prądowo-napięciową (I-V) mat nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT. Wykres wskazuje zachowanie rezystora (omowe). Po związaniu antygenu z nanowłóknami spodziewamy się zmiany charakterystyki I-V maty włókien, ponieważ taka zmiana rezystancji jest cechą sugerującą, że funkcjonalne włókna mogą znaleźć zastosowanie jako aktywny komponent w sensorach do detekcji pojedynczych cząsteczek.

Rysunek 1. Reaktor polimeryzacji do syntezy polimeru α,ω-dihydroksylowego. A) Punkt wtrysku dla przepływu gazowego azotu UHP. B.) Punkt wtrysku rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora. C) Naczynie reakcyjne.

Rycina 2. Układ wykorzystany do elektroprzędzenia z zastosowaniem źródła wysokiego napięcia firmy Glassman.

Rycina 3. Układ wykorzystany do pomiaru charakterystyk prądowo-napięciowych (I-V) przy użyciu zdalnego miernika źródłowego Sub-femtoamp (Keithley).

Rycina 4. A). Podejście syntetyczne do otrzymywania polimerów OH-PEO-P2MS-PEO-OH. B) Funkcjonalizacja α,ω-dihydroksy[poli(tlenku etylenu)-b-poli(2-metoksystryrenu)-b-poli(tlenku etylenu)].

Rycina 5. Widma FT-IR (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, prekursora CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP oraz (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Rysunek 6. Widmo protonowego NMR 500 MHz dla CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Rysunek 7. A) Obraz wiązania FITC- IgE z włóknami CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP elektroprząśniętymi z chlorobenzenu. B) Obraz z mikroskopu konfokalnego dla kontroli (nanowłókna z IgG).

Rysunek 8. A) Obraz AFM włókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP wytworzonych metodą elektroprzędzenia z chlorobenzenu oraz B) profil AFM, t.j. wymiar jednego włókna przedstawionego na Rysunku 5a.

Rysunek 9. Obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT.

Rysunek 10. Wykres I-V mat z nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyrenu/SWCNT.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiliśmy skuteczne podejście do przygotowywania biofunkcjonalnych nanowłókien. Nanowłókna są dekorowane grupą funkcyjną specyficzną dla białka modelowego. Procedura i podejście opisane w tej komunikacji mają charakter ogólny i mogą być wykorzystane do przygotowania nanowłókien dekorowanych dowolną pożądaną grupą funkcyjną. Anionowa polimeryzacja żyjąca jest potężną metodą syntezy kontrolowanych struktur polimerowych kowalencyjnie połączonych z dowolną liczbą interesujących grup funkcyjnych lu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sód metaliczny	Sigma-Aldrich	282065
Benzofenon	Sigma-Aldrich	239852
2-metoksystyren	Sigma-Aldrich	563064
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	178810
Chlorobenzen	Sigma-Aldrich	319996
Jednościenne CNT	Sigma-Aldrich	704113
Polistyren	Sigma-Aldrich	81416
Wafery krzemowe	Silicon Quest Int’l	720200
Zeiss FESEM	Carl Zeiss Inc.	Ultra 60
Stacja pomiarowa z mikroskopem wysokiej wydajności Bausch & Lomb MicroZoom II	Bausch and Lomb
Skanujący system konfokalny Leica	Leica Microsystems	TCS SP2
Zdalny miernik źródłowy sub-femtoamperowy	Keithley Instruments	6430
Cyfrowy multimetr z autozakresem	Keithley Instruments	175A
Pompa strzykawkową	Chemyx Inc.	Fusion 200
Mikroskop optyczny Zeiss	Carl Zeiss Inc.	Zeiss/Axiotech