Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Podsumowanie

Opisano skuteczne podejście do przygotowania nanowłókien ozdobionych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznego oddziaływania z białkami. Podejście to wymaga najpierw przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest wytwarzany w nanowłókna metodą elektroprzędzenia. Skuteczność wiązania nanowłókien z białkiem bada się za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Elektroprzędzenie to skuteczna metoda przetwarzania do przygotowania nanowłókien ozdobionych grupami funkcyjnymi. Nanowłókna ozdobione grupami funkcyjnymi mogą być wykorzystywane do badania oddziaływań materiał-biomarker, czyli pełnić rolę biosensorów z potencjałem jako detektory pojedynczych cząsteczek. Opracowaliśmy skuteczne podejście do otrzymywania polimerów funkcjonalnych, w których funkcjonalność ma zdolność specyficznego wiązania się z białkiem modelowym. W naszym układzie modelowym grupą funkcyjną jest 2,4-dinitrofenyl (DNP), a białkiem jest anty-DNP IgE (immunoglobulina E). Polimer funkcjonalny, α,ω-bi[2,4-dinitrofenyl kaproin][poli(tlenek etylenu)-b-poli(2-metoksystyren)-b-poli(tlenek etylenu)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), otrzymuje się w procesie żywej polimeryzacji anionowej. Dwufunkcyjny inicjator zastosowany w polimeryzacji został przygotowany w reakcji przeniesienia elektronów α-metylostyrenu i potasu (lustrzanego) metalu. Najpierw do inicjatora dodano monomer 2-metoksystyrenu, następnie dodano drugi monomer, tlenek etylenu, a na końcu żywy polimer zakończono metanolem. Polimer α,ω-dihydroksylowy [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] poddano reakcji z kwasem N-2,4-DNP-∈-aminokapronowym przez sprzężenie DCC, w wyniku czego powstał α,ω-bi[2,4-dinitrofenylokapronowy][poli(tlenek etylenu)-b-poli(2-metoksystyren)-b-poli(tlenek etylenu)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polimery scharakteryzowano za pomocą FT-IR, ¹H NMR i chromatografii żelowej (GPC). Rozkłady masy cząsteczkowej polimerów były wąskie (1,1-1,2), a w tym badaniu zastosowano polimery o masie cząsteczkowej większej niż 50 000. Polimery były żółtymi proszkami i były rozpuszczalne w tetrahydrofuranie. Rozpuszczalny w wodzie kompleks CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (glikol dimetoksyetylenowy) wiąże się i osiąga wiązanie w stanie ustalonym z roztworem IgE w ciągu kilku sekund. Polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP o większej masie cząsteczkowej (nierozpuszczalne w wodzie, tj. około 50 000) zawierające 1% jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT) przetworzono na elektroaktywne nanowłókna (o średnicy od 100 nm do 500 nm) na podłożu krzemowym. Spektroskopia fluorescencyjna pokazuje, że anty-DNP IgE oddziałuje z nanowłóknami poprzez wiązanie się z grupami funkcyjnymi DNP zdobiącymi włókna. Obserwacje te sugerują, że odpowiednio funkcjonalizowane nanowłókna są obiecujące dla opracowania urządzenia do wykrywania biomarkerów.

Protokół

1. Synteza polimeru α,ω-dihydroksylowego [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

1. Zmontować reaktor polimeryzacyjny, jak pokazano na rysunku 1. Reaktor do tego eksperymentu składa się z 100 ml kolby z okrągłym dnem i 2 szyjkami ze standardowym stożkowym złączem zewnętrznym (Chemglass), dwóch adapterów kontroli przepływu z kurkami (Chemglass) i jednego teflonowego pręta mieszającego. Adapter A (ilustracja 1) został użyty do utrzymania przepływu azotu o ultra wysokiej czystości (UHP) przez system, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza i wilgoci do systemu obojętnego. Adapter B (rysunek 1) został użyty do wstrzyknięcia rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora do kolby reakcyjnej.
2. Wysuszyć 200 ml tetrahydrofuranu (THF) na metalu, używając benzofenonu jako wskaźnika, przez co najmniej 6 godzin w suchym gazowym azocie.
3. Suszyć 10 ml 2-metoksystyrenu na wodorku wapnia przez 24 godziny.
4. Przygotować kąpiel w zimnej temperaturze utrzymywanej w temperaturze -78 °C, używając zawiesiny izopropanolu i ciekłego azotu.
5. Dodać 25 ml THF do kolby reakcyjnej polimeryzacji (patrz rysunek 1) w atmosferze azotu gazowego i utrzymywać reaktor w atmosferze azotu gazowego przez cały czas polimeryzacji.
6. Umieścić 100 ml kolby okrągłodennej w gnojowicy.
7. Dodać 2 ml (0,27 mmol/ml) roztworu inicjującego do kolby reakcyjnej.
8. Wstrzyknąć pierwszy monomer, 2-metoksystyren (4 ml) do kolby reakcyjnej.
9. Pozostawić reakcję na 40 minut.
10. Dodać 1 ml drugiego monomeru, tlenku etylenu.
11. Pozwól polimeryzacji kontynuować w temperaturze pokojowej przez dwa dni.
12. Zakończyć polimer HCl (6 M)/metanolem (1/20, obj./obj.).
13. Oczyść polimer poprzez wytrącanie do heksanów i wysuszenie polimeru w piecu próżniowym.
14. Scharakteryzować polimer za pomocą NMR.

2. Funkcjonalizacja polimeru α,ω-dihydroksylowego kwasem N-2,4-DNP-ε-aminokapronowym w celu otrzymania funkcjonalnego polimeru, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

1. W kolbie z trzema szyjkami umieścić polimer α,ω-dihydroksylowy (0,05 mmol), kwas N-2,4-DNP-E-amino-kapronowy (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) i DMAP (0,005 mmol) i suszyć na linii próżniowej przez 4 godziny.
2. Destylować suchy dichlorometan (10 ml) do kolby.
3. Zwolnij próżnię pod azotem i mieszaj reakcję przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
4. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną i odzyskać polimer przez dwukrotne wytrącanie do heksanów i metanolu.
5. Wysuszyć wytrącony polimer w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C.
6. Określ strukturę i funkcjonalność polimeru za pomocą FT-IR i ¹H NMR.

3. Przygotowanie rozwiązania CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT do elektroprzędzenia

1. Rozpuścić 20 % CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP w chlorobenzenie.
2. Rozpuść 20 % i 40 % w polistyrenu (MW 800 000) w chlorobenzenie, aby przygotować dwa roztwory. Polistyren o wyższej masie cząsteczkowej służy do zwiększenia splątania łańcuch-łańcuch polimeru i uzyskania optymalnej lepkości wymaganej do elektroprzędzenia.
3. Roztwory polimerów przygotowane w ppkt 3.1 i 3.2 należy zmieszać ze sobą, aby uzyskać proporcje 1:1 i 1:2 polimerów i dodać do mieszaniny 1 % jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT) i mieszać przez noc w celu równomiernego rozprowadzenia nanorurek węglowych.

4. Elektroprzędzenie kompozytu polimerowo-CNT

1. Zmontuj zestaw do elektroprzędzenia, jak pokazano na rysunku 2. Po prawej stronie rysunku znajduje się źródło wysokiego napięcia Glassmana. Obok niego znajduje się podstawka retortowa na której przymocowana jest płytka krzemowa. Po lewej stronie znajduje się kolejny stojak na retortę, na którym zamontowana jest strzykawka, a za nim znajduje się lampa do wizualizacji przebiegu zabiegu.
2. Za pomocą strzykawki podskórnej pobrać niewielką ilość mieszaniny CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT (około 1 ml) i zamontować strzykawkę podskórną na stojaku retortowym.
3. Płytka krzemowa jest bezpiecznie zamontowana w poprzek strzykawki w odległości 10 cm, a zacisk uziemiający źródła wysokiego napięcia jest do niej przymocowany.
4. Przymocuj klips z wysokim napięciem, które ma być przyłożone do igły na strzykawce, lekko wciśnij tłok (aby zawiesić kroplę na końcówce igły) i w tym momencie elektrowirowanie jest gotowe.
5. Włącz źródło wysokiego napięcia i ustaw miernik napięcia na 10 kV. W zależności od charakteru polimerów w kompozycie mogą być wymagane wyższe napięcia, zwłaszcza jeśli pożądane są nanowłókna o średnicy poniżej stu nanometrów.
6. Odmontuj wafel krzemowy i umieść go na noc w eksykatorze do całkowitego wyschnięcia.

5. Charakterystyka nanowłókien

1. Wstępne obrazowanie nanowłókien odbywa się za pomocą mikroskopu optycznego w celu obserwacji ogólnej perspektywy włókien.
2. Wykorzystaj skaningowy mikroskop elektronowy, aby obserwować drobniejsze szczegóły, takie jak morfologia, średnica, średnia wielkość porów itp.
3. Przeprowadź dalsze obrazowanie za pomocą mikroskopu sił atomowych, aby obserwować topografię 3D włókien itp.

6. Specyficzność wiązania nanowłókien z białkiem IgE anty-DNP

1. Przygotować roztwór 4 μg/l, znakowany fluorescencyjnie, FITC-IgE (izotiocyjanian-immunoglobulina E) w roztworze PBS-BSA (albumina surowicy bydlęcej buforowanej solą fizjologiczną).
2. Umieść mały kawałek płytki krzemowej, na której znajdują się nanowłókna, na szkiełku nakrywkowym MatTek. Inkubuj nanowłókna w tym roztworze przez jedną godzinę. Inkubacja odbywa się poprzez delikatne odpipetowanie 10 ul roztworu IgE na płytkę krzemową.
3. Po inkubacji usunąć niezwiązaną IgE, przemłukując próbkę trzykrotnie roztworem buforowym PBS-BSA. Roztwór PBS jest delikatnie dozowany na ściankę naczynia MatTek, aby uniknąć rozpylania buforu bezpośrednio na nanowłókna. Delikatnie obracaj naczyniem ręcznie, aby rozprowadzić roztwór buforowy na nanowłóknach. Ostrożnie usuń bufor pipetą i powtórz to jeszcze dwa razy.
4. Dla kontroli inkubować nanowłókna w znakowanej fluorescencyjnie IgG (niespecyficznej dla DNP) w tych samych warunkach.
5. Wizualizuj związane włókna za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zaobserwować wiązanie z IgE. W naszym badaniu użyto mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP2 z obiektywem 63x.

7. Zachowanie nanowłókien pod względem prądowo-napięciowym

1. Podłącz dwa mikro pozycjonery do źródła o bardzo niskim natężeniu prądu, takiego jak światłomierz Keithley 6430. Konfiguracja do określania zachowania napięcia prądowego jest pokazana na rysunku 3. Rysunek ten przedstawia stację sondy używaną do określenia początkowej charakterystyki I-V nanowłókien. Składa się z mikroskopu MicroZoom firmy Bausch and Lomb, stolika z uchwytem próżniowym i czterech mikropozycjonerów używanych do sondowania. W prawym górnym rogu znajduje się multimetr cyfrowy Agilent 34405A służący do pomiaru napięcia, a poniżej znajduje się miernik zdalnego źródła Keithley 6430 Sub-Femtoamp służący do pozyskiwania niskich prądów, które zostały wprowadzone do włókien.
2. Zamontuj ramiona sondy mikro pozycjonerów nad matą światłowodową po przeciwnych stronach, tak aby końcówki stykały się z włóknami.
3. Podłącz kolejne dwa mikropozycjonery do multimetru cyfrowego, zamontuj ramiona sondy pomiędzy dwoma pozostałymi i umieść końcówki na macie światłowodowej. Upewnij się, że cztery końcówki są tak wyrównane, jak to tylko możliwe.
4. Wprowadź różne ilości prądu z Keithleya (zazwyczaj w zakresie nanoamperów).
5. Zmierz spadek napięcia na zewnętrznych końcówkach, dla każdej wielkości prądu pozyskiwanego.
6. Wykreślenie tych wartości wskaże typ urządzenia, do którego działa mata światłowodowa.

8. Reprezentatywne wyniki

Funkcjonalny polimer

Metoda syntezy α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl kaproic][poli(tlenek etylenu)-b-poli(2-metoksystyren)-b-poli(tlenek etylenu)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP) pokazano na rysunku 4. ¹ Struktura funkcjonalnego polimeru została potwierdzona za pomocą FT-IR (rysunek 5) i spektroskopii ¹H NMR 500 MHz (rysunek 6). FT-IR pokazuje całkowity zanik szerokiej absorpcji -OH około 3,500 ^cm-1, co wskazuje na ilościową funkcjonalizację z grupą CDNP. Potwierdza to również widmo NMR pokazane na rysunku 6. Wykorzystując integrację pików w widmie NMR, stwierdzono, że polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP są funkcjonalizowane ilościowo.

Nanowłókna

Na rysunku 7 pokazana jest mata z przewodzących nanowłókien uzyskanych przez elektroprzędzenie CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT z chlorobenzenu. Uzyskane obrazy konfokalne wykazały, że białko IgE wiąże się z DNP na powierzchni włókna. ³ Wskazuje to na specyficzność wiązania elektroprzędzonych polimerów DNP z przeciwciałem IgE. Natężenie światła jest wskaźnikiem obecności IgE na nanowłóknach, ponieważ białko jest znakowane fluorescencyjnie.

Rysunek 8a to obraz AFM (Atomic Force Microscope) jednego z nanowłókien uzyskanych w tym procesie, a Rysunek 8b pokazuje, że wymiar tego konkretnego nanowłókna ma średnicę około 150 nm. W tym procesie uzyskuje się włókna o długości fali 100-700 nm. W obecnych czasach wyzwaniem jest przygotowanie włókien o określonym wymiarze. Jest to zgodne z tym, co obserwują inne grupy. ⁴ Rysunek 9 przedstawia obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT, a średnica nanowłókien wynosiła od 200 nm do 300 nm. Istnieją trzy obrazy SEM nanowłókien pokazane w różnych powiększeniach. Badanie trzech obrazów pokazuje, że morfologie włókien są liniowe i zrubione. Ogólnym celem jest przygotowanie włókien, które są w większości liniowe. Rysunek 10 przedstawia wykres I-V mat z nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT. Wykres przedstawia zachowanie rezystora (Ohmic). Kiedy antygen jest związany z nanowłóknami, spodziewamy się zmiany w zachowaniu I-V maty włóknistej, ponieważ ta zmiana rezystancji jest cechą, która sugeruje, że włókna funkcjonalne mają potencjalne zastosowanie jako aktywny składnik w czujnikach do wykrywania pojedynczych cząsteczek.

Rysunek 1. Reaktor polimeryzacyjny do syntezy polimeru α,ω-dihydroksylowego. A) Punkt wtrysku przepływającego azotu gazowego UHP. B.) Punkt wstrzykiwania rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora. C) Naczynie reakcyjne.

Rysunek 2. Konfiguracja używana do elektroprzędzenia przy użyciu źródła wysokiego napięcia Glassmana.

Rysunek 3. Konfiguracja używana do pomiaru wykresów I-V za pomocą zdalnego miernika źródła Sub-femtoamp (Keithley).

Rysunek 4. A). Syntetyczne podejście do otrzymywania polimerów OH-PEO-P2MS-PEO-OH. B) Funkcjonalizacja α,ω-dihydroksy[poli(tlenku etylenu)-b-poli(2-metoksystyren)-b-poli(tlenek etylenu)].

Rysunek 5. Widma FT-IR (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, prekursor CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP i (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Rysunek 6. 500 MHz Proton NMR CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Rysunek 7. A) Obraz wiązania FITC-IgE z włóknami CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP elektroprzędzonymi z chlorobenzenu. B) Obraz kontrolny w mikroskopie konfokalnym (nanowłókna z IgG).

Rysunek 8. A) Obraz AFM włókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP elektroprzędzonych z chlorobenzenu oraz B) Profil AFM, tj. wymiar jednego włókna pokazany na rysunku 5a.

Rysunek 9. Obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT.

Rysunek 10. I-V wykres mat z nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiliśmy skuteczne podejście do przygotowania biofunkcjonalnych nanowłókien. Nanowłókna są ozdobione grupą funkcyjną, która jest specyficzna dla białka modelowego. Procedura i podejście przedstawione w niniejszym komunikacie mają charakter ogólny i mogą być stosowane do przygotowania nanowłókien ozdobionych dowolną pożądaną grupą funkcyjną. Żywa polimeryzacja anionowa jest potężną metodą syntezy kontrolowanych struktur polimerowych kowalencyjnie połączonych z dowolną liczbą interesujących gru...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sód metaliczny	Sigma-Aldrich	282065
Benzofenon	Sigma-Aldrich	239852
2-metoksystyren	Sigma-Aldrich	563064
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	178810
Chlorobenzen	Sigma-Aldrich	319996
Jednościenne CNT	Sigma-Aldrich
Polistyren	Sigma-Aldrich	81416
Wafle krzemowe	Silicon Quest Int’ l	720200
Zeiss FESEM	Carl Zeiss Inc.	Ultra 60
Probestation z Bausch & Wysokowydajny mikroskop Lomb MicroZoom II	Bausch and Lomb
Leica Skaningowy system konfokalny	Leica Microsystems	TCS SP2
Sub-femtoamp Zdalny miernik źródłowy	Keithley Instruments	6430
Multimetr cyfrowy z automatyczną zmianą zakresu	Keithley Instruments	175A
Pompa strzykawkowa	Chemyx Inc.	Fusion 200
Zeiss	Carl Zeiss Inc.	Zeiss/Axiotech