Ilościowa ocena migracji komórek za pomocą testu fagokinetycznego ruchu torowego

Podsumowanie

Test toru ruchu fagokinetycznego jest metodą używaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test mierzy chemokinezę (losową ruchliwość komórek) w czasie w sposób ilościowy. Test wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym.

Streszczenie

Ruchliwość komórkowa jest ważnym procesem biologicznym zarówno dla organizmów jednokomórkowych, jak i wielokomórkowych. Jest niezbędna do przemieszczania się organizmów jednokomórkowych w kierunku źródła składników odżywczych lub z dala od nieodpowiednich warunków, a także w organizmach wielokomórkowych do rozwoju tkanek, nadzoru immunologicznego i gojenia się ran, by wymienić tylko kilka ról^1,2,3. Deregulacja tego procesu może prowadzić do poważnych chorób neurologicznych, sercowo-naczyniowych i immunologicznych, a także do zaostrzenia powstawania i rozprzestrzeniania się nowotworów^4,5. Wykazano, że molekularnie polimeryzacja aktyny i recykling receptorów odgrywają ważną rolę w tworzeniu rozszerzeń komórkowych (lamellipodia), które napędzają ruch komórki^{do przodu 6,7,8}. Jednak wiele biologicznych pytań dotyczących migracji komórek pozostaje bez odpowiedzi.

Centralna rola ruchliwości komórek w ludzkim zdrowiu i chorobach podkreśla znaczenie zrozumienia specyficznych mechanizmów związanych z tym procesem i sprawia, że dokładne metody oceny ruchliwości komórek są szczególnie ważne. Mikroskopy są zwykle używane do wizualizacji ruchu komórek. Jednak komórki poruszają się raczej wolno, co sprawia, że ilościowy pomiar migracji komórek jest procesem wymagającym kosztownych kamer i oprogramowania do tworzenia ilościowych filmów poklatkowych ruchliwych komórek. Dlatego zdolność do wykonania ilościowego pomiaru migracji komórek, który jest opłacalny, niepracochłonny i wykorzystuje zwykły sprzęt laboratoryjny, jest wielką potrzebą wielu badaczy.

Test fagokinetycznego ruchu toru wykorzystuje zdolność poruszającej się komórki do usuwania cząsteczek złota ze swojej drogi, aby stworzyć mierzalny ślad na koloidalnym, pokrytym złotem szkiełku nakrywkowym^9,10. Za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania można ocenić wiele ścieżek dla każdego zabiegu, aby spełnić wymagania statystyczne. Test może być wykorzystany do oceny ruchliwości wielu typów komórek, takich jak komórki rakowe^11,12, fibroblasty⁹, neutrofile¹³, komórki mięśni szkieletowych¹⁴, keratynocyty¹⁵, trofoblasty¹⁶, komórki śródbłonka¹⁷ i monocyty^10,18-22. Protokół polega na stworzeniu szkiełek pokrytych nanocząstkami złota (Au°), które są generowane przez redukcję kwasu chloroaurowego (Au³⁺) przez cytrynian sodu. Metoda ta została opracowana przez Turkevicha i wsp. w 1951 r.²³, a następnie udoskonalona w latach 70. przez Frensa i wsp.^24,25. W wyniku tego etapu chemicznej redukcji cząstki złota (o średnicy 10-20 nm) wytrącają się z mieszaniny reakcyjnej i mogą być nakładane na szklane szkiełka nakrywkowe, które są następnie gotowe do użycia w analizach migracji komórkowej^9,26,27.

Ogólnie rzecz biorąc, test fagokinetycznego motoryki jest szybkim, ilościowym i łatwym pomiarem ruchliwości komórek. Ponadto może być stosowany jako prosty test wysokoprzepustowy, do stosowania z typami komórek, które nie są podatne na obrazowanie poklatkowe w czasie, a także do innych zastosowań w zależności od potrzeb badacza. Razem możliwość ilościowego pomiaru ruchliwości komórkowej wielu typów komórek bez konieczności stosowania drogich mikroskopów i oprogramowania, wraz z wykorzystaniem powszechnego sprzętu laboratoryjnego i chemikaliów, sprawiają, że test fagokinetycznej ruchliwości toru jest solidnym wyborem dla naukowców zainteresowanych zrozumieniem ruchliwości komórek.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną

1. Umieść szkiełka nakrywkowe ze szkła mytego kwasem (o średnicy 15 mm) w sterylnym plastikowym naczyniu (naczyniach) o średnicy 100 mm. Umieść 8-9 szkiełek nakrywkowych na naczynie i upewnij się, że nie stykają się ze sobą ani z bokami naczynia.

Uwaga: Szkiełka nakrywkowe, igły i pęsety muszą być sterylne, aby wyeliminować możliwe mikroorganizmy zanieczyszczające, a także endotoksyny, które wpływają na funkcje komórkowe, w tym ruchliwość.

2. Zważyć żelatynę w proszku i ponownie zawiesić proszek w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać roztwór żelatyny o końcowym stężeniu 0,5 g/300 ml. Następnie roztwór żelatyny należy poddać autoklawowaniu.
3. Odpipetuj 2-3 krople żelatyny (~100-150 ml) na każde szkiełko nakrywkowe.

Uwaga: Uważaj, aby żelatyna nie dotknęła naczynia, bo nie będziesz w stanie usunąć szkiełek nakrywkowych z naczynia.

4. Szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną piec w naczyniu o średnicy 100 mm w piekarniku w temperaturze 90 °C przez 10 minut.
5. Usunąć nadmiar żelatyny, delikatnie pipetując.
6. Szkiełka nakrywkowe suszyć w naczyniu o średnicy 100 mm w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 45 minut.
7. Po wyschnięciu usuń szkiełka nakrywkowe z naczynia o średnicy 100 mm za pomocą sterylnej, wolnej od endotoksyn igły i pęsety (igła służy do delikatnego popychania szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić jego delikatne usunięcie pęsetą).
8. Umieść pojedyncze szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną w oddzielnych dołkach 24-dołkowego naczynia.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym

1. Zważyć odpowiednią ilość kwasu chloroaurowego (trójwodnego kwasu tetrachloroaurowego; HAuCl₄·3H₂O), a następnie ponownie zawiesić w sterylnej wodzie dejonizowanej w celu przygotowania końcowego roztworu 14,5 mM (toksycznego). Przygotować 1,5 ml roztworu na 8-9 szkiełek nakrywkowych.

Ostrzeżenie: Kwas chloroaurowy jest szkodliwy po połknięciu, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu oraz może powodować reakcję alergiczną skóry. Działa toksycznie po połknięciu.

2. Zważyć odpowiednią ilość cytrynianu sodu (diwodoru trisodowego, 2-hydroksypropano-1,2,3-trikarboksylanu; Na₃C₆H₅O₇), a następnie ponownie zawiesić proszek w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać końcowy 0,5% roztwór. Przygotować 1 ml roztworu na 8-9 szkiełek nakrywkowych.

Ostrzeżenie: Cytrynian sodu może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może również powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych.

3. W sterylnej, wolnej od endotoksyn zlewce wymieszaj 1,5 ml sterylnego roztworu 14,5 mM HAuCl₄ i 13,5 ml sterylnej wody dejonizowanej; wynik powinien dać słabo żółty roztwór. Powyższe tomy pozwolą na wykonanie 8-9 szkiełek nakrywkowych ze złota koloidalnego.
4. Ciągle mieszając, podgrzej roztwór na gorącej płycie, aż zacznie wrzeć.

Uwaga: Podgrzewanie roztworu powinno odbywać się w dygestorium, ponieważ opary mogą być szkodliwe/toksyczne. Opary działają destrukcyjnie na tkanki błon śluzowych i górnych dróg oddechowych.

5. Wyjmij zlewkę z płyty grzejnej.
6. Mieszając, dodać 0,7 ml 0,5% roztworu cytrynianu sodu. Wspomniana objętość pozwoli na wykonanie 8-9 szkiełek nakrywkowych ze złota koloidalnego.
7. Mieszaj ten połączony roztwór przez około 2 minuty (Uwaga: Kolor roztworu będzie stopniowo zmieniał się z bladożółtego, przez klarowny, szary, fioletowy, do ciemnofioletowego, zanim w końcu osiągnie kolor czerwonego wina lub, najlepiej, rdzy). Ten produkt to Twój roztwór złota koloidalnego.
8. Schłodzić roztwór złota koloidalnego w pipecie o pojemności 10 ml przez 1-2 minuty (aby zapobiec stopieniu się warstwy żelatyny na szkiełku nakrywkowym po dodaniu roztworu złota koloidalnego), a następnie dodać 1,0-2,0 ml roztworu złota koloidalnego na każde żelatynowe szkiełko nakrywkowe umieszczone uprzednio w 24-dołkowym naczyniu (naczyniu) (ilość roztworu złota koloidalnego, którą dodaje się do szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną, zależy od tego, jak dobrze cząsteczki złota wytrącone w roztworze - patrz komentarze poniżej).

Uwaga: Ponieważ mogą wystąpić różnice w efektywności wytrącania cząsteczek złota, zaleca się najpierw dodać 0,5-1 ml roztworu złota koloidalnego do pokrytych żelatyną szkiełek nakrywkowych, a następnie umieścić 24-dołkową szalkę w inkubatorze na 0,5 godziny. Po tym czasie inkubacji szkiełka nakrywkowe należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym pod kątem odpowiedniej gęstości cząstek złota na szkiełkach nakrywkowych. Na rysunku 1 przedstawiono 20-krotne obrazy mikroskopowe przedstawiające przykłady zbyt niskiego i zbyt wysokiego stężenia cząstek złota. Na rysunku 2 przedstawiono 40-krotne obrazy mikroskopowe przedstawiające idealne stężenie cząstek złota (przynajmniej w przypadku monocytów). Optymalna gęstość nanocząstek złota na szkiełku powinna być eksperymentalnie określona dla każdego użytego typu ogniwa, ponieważ charakterystyka różnych komórek będzie dyktować ich siłę ruchu na szkiełkach nakrywkowych. Jeżeli stężenie cząstek złota jest niewystarczające, dodać dodatkowe 0,5-1 ml koloidalnego roztworu złota do szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną.

W zależności od wielkości komórki, odpowiednie stężenie cząsteczek złota może się różnić, a więc ostatecznie zależy od wielkości komórki badanej pod kątem ruchliwości. Na przykład, ponieważ ludzkie monocyty są małymi komórkami (~10-20 μm²⁸), w naszych analizach wymagane było wyższe stężenie cząstek złota. Odpowiedni rozkład nanocząstek złota zapewnia badaczowi możliwość łatwego i skutecznego rozróżniania krawędzi ścieżek komórkowych. Zbyt wysokie stężenie cząsteczek złota ogranicza zdolność komórek do poruszania się, a tym samym do dokładnego pomiaru ich ruchliwości, podczas gdy zbyt niskie stężenie cząstek złota ogranicza zdolność do wyznaczenia dokładnej ścieżki ruchliwości.

Ważna uwaga: Jeśli synteza nanocząstek złota jest problematyczna, zsyntetyzowane nanocząstki złota są dostępne na rynku w rozmiarach od 5 nm do 400 nm. Ponadto mikrosfery fluorescencyjne zostały również wykorzystane w badaniach ruchliwości komórek²⁹. Jednak zastosowanie tych mikrosfer wymaga mikroskopu fluorescencyjnego do analizy migracji komórek.

9. Umieścić 24-dołkową szalkę z szkiełkami nakrywkowymi pokrytymi złotem koloidalnym w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować od 1 godziny do nocy.
10. Po inkubacji wypłukać/usunąć niezwiązane złoto, zanurzając szkiełka nakrywkowe (3x) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; pH 7,4).
11. Umieść te szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym w czystym 12-dołkowym naczyniu (naczyniach) zawierającym PBS.
12. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia (przed włożeniem do lodówki należy sfilmować płytkę).

Ważna uwaga: Zawsze przechowuj koloidalne szkiełka nakrywkowe pokryte złotem w jakimś rodzaju płynu/mediów, ponieważ cząsteczki złota mogą odłupywać się od szkiełek nakrywkowych, jeśli pozwolisz im wyschnąć. Szkiełka nakrywkowe ze złota koloidalnego należy zużyć w ciągu 2-3 miesięcy od daty ich wykonania.

Kontrola jakości: W pojedynczym teście fagokinetycznego ruchu toru, bardzo ważne jest użycie szkiełek nakrywkowych, które charakteryzują się podobnym stężeniem cząsteczek złota. Ten prosty punkt pozwoli na to, aby ilościowe różnice w ruchliwości komórek między próbkami wynikały wyłącznie z charakteru obróbki, a nie z właściwości fizycznych szkiełek nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym. Opowiadamy się za stosowaniem wyłącznie szkiełek nakrywkowych wykonanych w tym samym czasie w poszczególnych eksperymentach, chociaż wykazaliśmy, że o ile gęstość nanocząsteczek złota jest równa, stosowanie szkiełek nakrywkowych z różnych preparatów jest właściwe.

3. Analiza ruchliwości komórek

1. Umieść szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym w podłożu komórkowym odpowiednim dla interesujących komórek.
2. Przenieść odpowiednio poddane działaniu substancji komórki na szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym, umieszczone w 24-dołkowym naczyniu (naczyniach)

Uwaga: Liczba komórek przeniesionych do pojedynczego dołka musi być określona dla każdego badanego typu komórki. Idealnie byłoby, gdyby komórki były równomiernie rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym pokrytym złotem koloidalnym, co z kolei pozwoli na analizę statystyczną tylko ścieżek utworzonych przez pojedynczą komórkę. Jeśli komórki zostaną posiane w zbyt wysokim stężeniu, staje się wysoce prawdopodobne, że będą widoczne nakładające się na siebie ścieżki wielu komórek. Nakładające się na siebie ścieżki nie mogą być dokładnie określone ilościowo, a co za tym idzie, nie mogą być uwzględnione w końcowych analizach ruchu badanych komórek. Nakładające się na siebie ścieżki w wyniku zaangażowania wielu komórek są zwykle łatwe do zaobserwowania; jako połączone lub skrzyżowane ścieżki (w obszarze analizy), w których można zaobserwować dwie lub więcej komórek w tym samym ciągłym oczyszczonym obszarze.

3. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 godziny (lub przez dowolny odpowiedni czas; Np. przeanalizowaliśmy ruchliwość monocytów między 6 godziną a 24 godziną po leczeniu i komórkami śródbłonka po 12 godzinach po zabiegu). Optymalne ramy czasowe dla określenia i pomiaru ruchliwości komórek będą się różnić w zależności od badanego typu komórki, a zatem powinny być eksperymentalnie określone dla każdego typu komórki (dobrym punktem wyjścia jest jednak 6 - 12 godzin po leczeniu).

Uwaga: Jeśli eksperymentalne szkiełka nakrywkowe pokryte złotem koloidalnym muszą być przechowywane i/lub analizowane w późniejszym czasie, komórki i nanocząstki złota muszą być przymocowane do szkiełek nakrywkowych. Aby wykonać ten krok fiksacji; postępując zgodnie z Krokiem 3.3, najpierw dokładnie umyj szkiełka nakrywkowe 2 razy za pomocą 1x PBS (preferowane jest zanurzanie szkiełek nakrywkowych, ponieważ należy unikać usuwania nanocząstek złota z szkiełek nakrywkowych), a następnie użyj standardowej metody utrwalania komórek, takiej jak inkubacja z temperaturą pokojową 3% paraformaldehydu. Po 15-minutowej inkubacji należy usunąć 3% paraformaldehydu i dokładnie umyć szkiełka nakrywkowe 3 razy 1x PBS. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w lodówce.

4. Za pomocą mikroskopu świetlnego uchwyć obrazy ścieżek utworzonych przez pojedynczą poruszającą się komórkę (Uwaga: Powiększenie używane do robienia zdjęć ścieżek komórkowych z pewnością będzie się różnić w zależności od badanego typu komórki). Przykłady ścieżek komórkowych utworzonych przez komórki nieruchome i ruchliwe na szkiełkach nakrywkowych pokrytych złotem koloidalnym przedstawiono na rysunku 2.

Uwaga: Stwierdzono, że nanocząstki złota o rozmiarze użytym w teście fagokinetycznego ruchu toru są całkowicie nietoksyczne dla komórek³⁰. W razie potrzeby żywotność badanych komórek można ocenić poprzez barwienie błękitem trypanowym lub zbadać pod kątem innych markerów żywotności komórek. Trzeba by wziąć pod uwagę potrzebę fiksacji, rodzaj fiksacji itp., jeśli ten krok musi zostać podjęty.

5. Korzystając z ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak oprogramowanie ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) lub NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/), oba opracowane w National Institutes of Health, lub ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) opracowanym w University of Texas Health Science Center w San Antonio, średnia powierzchnia (w dowolnych jednostkach) złota koloidalnego oczyszczonego przez 10-20 lub więcej komórek (na próbkę) jest określana dla każdego ramienia eksperymentalnego na podstawie przechwyconych obrazów. Na zebranych wynikach można następnie przeprowadzić statystyki. Na przykład wyniki można wykreślić jako średnie ± błędów standardowych średnich (SEM) z przeprowadzonymi testami t Studenta i wartością P <0,05 używaną jako miara istotności statystycznej między próbami. Rysunki 3 i 4 pokazują etapy analizy obszaru złota koloidalnego oczyszczonego przez komórkę.

Wyniki

Pokazany jest przykład zdjęć wykonanych pod mikroskopem świetlnym, pokazujących obszar ścieżki oczyszczony przez pojedynczą komórkę (monocyt z naszych eksperymentów jest pokazany na rysunku 2). Nieruchome komórki tworzą wokół siebie charakterystyczne małe, owalne lub okrągłe odcinki, co wskazuje na niski podstawowy poziom ruchu tych niestymulowanych komórek (ryc. 2A i 2B). W przeciwieństwie do tego, wysoce ruchliwe komórki [w naszym systemie, komórki zakażone ludzkim wirusem cytomegalii ...

Dyskusja

Przedstawiony w tym artykule test fagokinetycznej ruchliwości toru jest prostą i wysoce skuteczną metodą ilościowej analizy migracji komórek. Ponieważ można analizować wiele typów komórek^{w godzinach 9-17}, metoda ta ma potencjalnie szerokie zastosowanie w wielu dyscyplinach. Zastosowanie szkiełek nakrywkowych ze szkła pokrytego złotem koloidalnym pozwala na pomiar powierzchni toru oczyszczonej przez ruchomą komórkę. Test może mierzyć wpływ różnych bodźców (tj. czynników wzrostu, oczyszczonych ligandów ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe szklane (15mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Żelatyna 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Trójwodny kwas tetrachloroaurowy	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (końcowy roztwór roboczy)
Cytrynian sodu	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (końcowy roztwór roboczy)
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	O4042	3% (końcowy roztwór roboczy)
100 mm Naczynie do kultur tkankowych	Sarstedt	83.1802
Płytki 12-dołkowe	Fisher Scientific	08-772-29
Płytki 24-dołkowe	Fisher Scientific	07-200-84
Hybrydyzator do piekarników Techne HB-1D	LabPlanet	2040500	Wystarczy standardowy piec laboratoryjny
Pipety serologiczne 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid Filler/Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Jednokanałowa pipeta ręczna	Rainin	PR-200
200 ml Końcówki barierowe	CLP	BT200
ImageJ oprogramowanie	http:// rsb.info.nih.gov/ij/		Licencja: Domena publiczna
Nikon Eclipse TE300 z fotometrycznym monochromatycznym 12-bitowym aparatem CCD CoolSNAPfx	Nikon		Wycofany; Najbardziej porównywalną specyfikację ma Nikon Eclipse Ti, ale odpowiedni będzie również Nikon 80i z niższej półki. Inne marki również oferują porównywalne mikroskopy.
Uwaga: Wymienione poniżej odczynniki i sprzęt zostały przez nas wykorzystane w naszych różnych badaniach. Można używać innych materiałów eksploatacyjnych, dostawców, odczynników i sprzętu, o ile mają one podobne specyfikacje.