Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Maciej T. Nogalski; Gary C.T. Chan; Emily V. Stevenson; Donna K. Collins-McMillen; Andrew D. Yurochko

doi:10.3791/4165

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4165

⸱

4 grudnia 2012

Maciej T. Nogalski¹^,² , Gary C.T. Chan³ , Emily V. Stevenson¹^,² , Donna K. Collins-McMillen¹^,² , Andrew D. Yurochko¹^,²^,⁴

¹Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, ²Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, ³Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, ⁴Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Streszczenie

Ruchliwość komórkowa jest istotnym procesem biologicznym zarówno dla organizmów jednokomórkowych, jak i wielokomórkowych. Jest ona niezbędna do przemieszczania się organizmów jednokomórkowych w kierunku źródła składników odżywczych lub z dala od niekorzystnych warunków, a w organizmach wielokomórkowych odgrywa wiele ról, m.in. w rozwoju tkanek, nadzorze immunologicznym oraz gojeniu ran^1,2,3. Rozregulowanie tego procesu może prowadzić do poważnych chorób neurologicznych, sercowo-naczyniowych i immunologicznych, a także do nasilenia powstawania i rozprzestrzeniania się nowotworów^4,5. Na poziomie molekularnym wykazano, że polimeryzacja aktyny oraz recykling receptorów odgrywają istotną rolę w tworzeniu wypustek komórkowych (lamellipodiów), które napędzają ruch komórki do przodu^6,7,8. Niemniej jednak wiele pytań biologicznych dotyczących migracji komórek pozostaje nieodpowiedzianych.

Centralna rola ruchliwości komórkowej w zdrowiu i chorobach ludzi podkreśla znaczenie zrozumienia konkretnych mechanizmów zaangażowanych w ten proces i sprawia, że dokładne metody oceny ruchliwości komórek są szczególnie istotne. Do wizualizacji ruchu komórek zazwyczaj wykorzystuje się mikroskopy. Jednak komórki poruszają się dość wolno, co sprawia, że ilościowy pomiar migracji komórek jest procesem zasobochłonnym, wymagającym drogich kamer i oprogramowania do tworzenia ilościowych filmów poklatkowych z ruchliwymi komórkami. W związku z tym, możliwość przeprowadzenia ilościowego pomiaru migracji komórek, który byłby kosztowo efektywny, niewymagający dużego nakładu pracy i wykorzystujący powszechne wyposażenie laboratoryjne, stanowi ogromną potrzebę wielu badaczy.

Analiza ruchomości metodą śladów fagokinetycznych wykorzystuje zdolność poruszającej się komórki do usuwania cząsteczek złota z jej drogi, co pozwala na utworzenie mierzalnego śladu na szkiełku podstawowym pokrytym koloidalnym złotem^9,10. Dzięki zastosowaniu ogólnodostępnego oprogramowania można ocenić wiele śladów dla każdej serii badawczej w celu spełnienia wymogów statystycznych. Analizę tę można wykorzystać do oceny ruchomości wielu typów komórek, takich jak komórki nowotworowe^11,12, fibroblasty⁹, neutrofile¹³, komórki mięśni szkieletowych¹⁴, keratynocyty¹⁵, trofoblasty¹⁶, komórki śródbłonka¹⁷ oraz monocyty^10,18-22. Protokół obejmuje przygotowanie szkiełek pokrytych nanocząsteczkami złota (Au°), które powstają w wyniku redukcji kwasu chloroauronego (Au³⁺) cytrynianem sodu. Metoda ta została opracowana przez Turkevicha et al. w 1951 roku²³, a następnie udoskonalona w latach 70. przez Frensa et al.^24,25. W wyniku tego etapu redukcji chemicznej z mieszaniny reakcyjnej wytrącają się cząsteczki złota (o średnicy 10-20 nm), które można nanieść na szkiełka podstawowe, przygotowując je następnie do analiz migracji komórkowych^9,26,27.

Ogólnie rzecz biorąc, test ruchliwości w śladzie fagokinetycznym jest szybką, ilościową i prostą metodą pomiaru ruchliwości komórkowej. Ponadto może on być wykorzystywany jako prosty test wysokoprzepustowy w przypadku typów komórek, które nie nadają się do obrazowania poklatkowego, a także w innych zastosowaniach, zależnie od potrzeb badacza. Możliwość ilościowego pomiaru ruchliwości wielu typów komórek bez konieczności stosowania drogich mikroskopów i oprogramowania, w połączeniu z wykorzystaniem powszechnie dostępnego sprzętu i odczynników laboratoryjnych, sprawia, że test ruchliwości w śladzie fagokinetycznym jest odpowiednim wyborem dla naukowców zainteresowanych badaniem ruchliwości komórkowej.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek coverglass pokrytych żelatyną

Umieść szkiełka nakrywkowe (o średnicy 15 mm) przemyte kwasem w sterylnym plastikowym naczyniu o średnicy 100 mm. W każdym naczyniu umieść 8–9 szkiełek, upewniając się, że nie dotykają one siebie ani ścianek naczynia.

Uwaga: Kryszalki, igły i pęsety muszą być sterylne, aby wyeliminować możliwe zanieczyszczenie mikroorganizmami, a także endotoksynami, które wpływają na funkcje komórkowe, w tym na ruchliwość.

Odważ proszek żelatynowy i zawieś go w wodzie dejonizowanej, aby przygotować roztwór żelatyny o końcowym stężeniu 0,5 g/300 ml. Następnie roztwór żelatyny należy poddać autoklawowaniu.
Nanieś pipetą 2-3 krople żelatyny (~100-150 ml) na każdą szkiełko nakrywkę.

Uwaga: Należy uważać, aby żelatyna nie dotknęła ścianek naczynia, w przeciwnym razie nie będzie można wyjąć szkiełek nakrywkowych z naczynia.

Wygrzewać szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną w szalce 100 mm w piekarniku w temperaturze 90 °C przez 10 min.
Usunąć nadmiar żelatyny za pomocą delikatnego pipetowania.
Osuszyć szkiełka nakrywkowe w szalce 100 mm w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 45 min.
Po wyschnięciu wyjąć szkiełka nakrywkowe z szalki 100 mm, używając sterylnej, wolnej od endotoksyn igły i pęsety (igły służy do delikatnego uniesienia szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić jego ostrożne usunięcie pęsetą).
Umieścić poszczególne szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną w osobnych studzienkach płytki 24-dołkowej.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem

Odważ odpowiednią ilość kwasu chloroaurycznego (trydrat tetrachlorozłotowego(III); HAuCl₄·3H₂O>), a następnie rozpuść go w sterylowanej wodzie dejonizowanej, aby przygotować końcowy roztwór o stężeniu 14,5 mM (toksyczny). Przygotuj 1,5 ml roztworu na każde 8–9 szkiełek nakrywkowych.

Ostrzeżenie: Kwas chloroaurowy jest szkodliwy w przypadku połknięcia, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu oraz może wywołać reakcję alergiczną skóry. Toksyczny w przypadku połknięcia.

Odważ odpowiednią ilość cytrynianu sodu (triwodorogeno-2-hydroksypropano-1,2,3-tricarboksylan trisodu; Na₃C₆H₅O₇), a następnie resuspenduj proszek w wodzie dejonizowanej, aby przygotować końcowy roztwór o stężeniu 0,5%. Przygotuj 1 ml roztworu na każde 8-9 szkiełek nakrywkowych.

Ostrzeżenie: Cytrynian sodu może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może również powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych.

W sterylnym, wolnym od endotoksyn zlewce połącz 1,5 ml sterylnego roztworu HAuCl₄ o stężeniu 14,5 mM oraz 13,5 ml sterylnej wody dejonizowanej; w wyniku powstanie roztwór o bladożółtym kolorze. Wymienione objętości pozwolą na przygotowanie 8-9 szkiełek nakrywkowych z koloidalnym złotem.
Podgrzewaj roztwór na płycie grzewczej przy ciągłym mieszaniu, aż zacznie wrzeć.

Ostrzeżenie: Podgrzewanie roztworu należy przeprowadzać w dygestorium, ponieważ opary mogą być szkodliwe/toksyczne. Opary te działają niszcząco na błony śluzowe oraz górne drogi oddechowe.

Zdejmij zlewka z płyty grzewczej.
Podczas mieszania dodaj 0,7 ml 0,5% roztworu cytrynianu sodu. Wyżej wymieniona objętość pozwoli na przygotowanie 8–9 szkiełek nakrywkowych z koloidalnym złotem.
Mieszaj połączony roztwór przez około 2 min (Uwaga: kolor roztworu będzie stopniowo zmieniać się z bladego żółtego na bezbarwny, szary, fioletowy i ciemnofioletowy, aż w końcu osiągnie kolor czerwonego wina lub, najlepiej, rdzy). Otrzymany produkt jest roztworem koloidalnego złota.
Schłodź roztwór koloidalnego złota w pipecie 10 ml przez 1–2 min (aby zapobiec stopieniu się warstwy żelatyny na szkiełku nakrywkowym po dodaniu roztworu koloidalnego złota), a następnie nanieś 1,0–2,0 ml roztworu koloidalnego złota na każde szkiełko nakrywkowe pokryte żelatyną, umieszczone wcześniej w płytce(ach) 24-dołkowej (ilość roztworu koloidalnego złota dodawana do szkiełek pokrytych żelatyną zależy od stopnia wytrącenia cząsteczek złota w roztworze – zapoznaj się z poniższymi uwagami).

Uwaga: Z uwagi na możliwe różnice w efektywności wytrącania cząsteczek złota, zaleca się najpierw dodać 0,5-1 ml koloidalnego roztworu złota do szkiełek nakrywek powlekanych żelatyną, a następnie umieścić płytkę 24-dołkową w inkubatorze na 0,5 h. Po tym czasie inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem świetlnym, czy gęstość cząsteczek złota na szkiełkach nakrywkach jest odpowiednia. Obrazy mikroskopowe przy powiększeniu 20x przedstawiające przykłady zbyt niskiego i zbyt wysokiego stężenia cząsteczek złota znajdują się na Rysunku 1. Obrazy mikroskopowe przy powiększeniu 40x przedstawiające idealne stężenie cząsteczek złota (przynajmniej do zastosowań z monocytami) znajdują się na Rysunku 2. Optymalna gęstość nanocząsteczek złota na szkiełku powinna zostać wyznaczona doświadczalnie dla każdego rodzaju użytych komórek, ponieważ charakterystyka różnych komórek determinuje siłę ich ruchu po szkiełkach nakrywkach. Jeśli stężenie cząsteczek złota jest niewystarczające, należy dodać do powlekanych żelatyną szkiełek nakrywek dodatkowe 0,5-1 ml koloidalnego roztworu złota.

W zależności od wielkości komórki odpowiednie stężenie cząsteczek złota może się różnić i w konsekwencji będzie zależeć od wielkości komórki badanej pod kątem ruchliwości. Na przykład w przypadku monocytów ludzkich, które są komórkami o niewielkim rozmiarze (~10-20 μm²⁸), w naszych analizach wymagane było wyższe stężenie cząsteczek złota. Odpowiednia dystrybucja nanocząsteczek złota umożliwia badaczowi łatwe i wydajne rozróżnienie krawędzi śladów komórkowych. Zbyt wysokie stężenie cząsteczek złota utrudnia ruch komórek, a tym samym dokładny pomiar ich ruchliwości, natomiast zbyt niskie stężenie ogranicza możliwość wyznaczenia dokładnego toru ruchu.

Ważna uwaga: Jeśli synteza nanocząsteczek złota jest problematyczna, nanocząsteczki złota są dostępne w sprzedaży komercyjnej w rozmiarach od 5 nm do 400 nm. Dodatkowo w badaniach nad ruchliwością komórek stosowano mikrosfery fluorescencyjne²⁹. Jednakże użycie tych mikrosfer wymaga zastosowania mikroskopu fluorescencyjnego do analizy migracji komórek.

Umieść płytkę 24-dołkową z szkiełkami podstawowymi pokrytymi koloidalnym złotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj od 1 h do całej nocy.
Po inkubacji wypłucz/usuń niezwiązane złoto, zanurzając szkiełka podstawowe (3x) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS; pH 7.4).
Przenieś te pokryte koloidalnym złotem szkiełka podstawowe do czystej płytki (płytek) 12-dołkowej zawierającej PBS.
Przechowuj te szkiełka podstawowe w temperaturze 4 °C do momentu użycia (przed włożeniem do lodówki zabezpiecz płytkę parafilmem).

Ważna uwaga: Szkiełka nakrywkowe powlekane złotem koloidalnym należy zawsze przechowywać w odpowiednim cieczy/medium, ponieważ cząsteczki złota mogą odpryskiwać od szkiełek w przypadku ich wyschnięcia. Szkiełka nakrywkowe ze złotem koloidalnym powinny zostać wykorzystane w ciągu 2-3 miesięcy od daty ich przygotowania.

Kontrola jakości: W pojedynczym badaniu ruchliwości metodą ścieżek fagokinetycznych krytyczne jest zastosowanie szkiełek podstawowych charakteryzujących się podobnym stężeniem cząsteczek złota. Ten prosty aspekt pozwoli zapewnić, że ilościowe różnice w ruchliwości komórkowej między próbkami będą wynikać wyłącznie z zastosowanej metody traktowania, a nie z właściwości fizycznych szkiełek pokrytych koloidalnym złotem. W pojedynczych eksperymentach preferujemy stosowanie wyłącznie szkiełek wykonanych w tym samym czasie, choć wykazaliśmy, że dopóki gęstość nanocząsteczek złota jest taka sama, użycie szkiełek z różnych preparatów jest dopuszczalne.

3. Analiza motywności komórkowej

Umieść szkiełka podstawowe pokryte koloidalnym złotem w odpowiednim medium hodowlanym dla badanych komórek.
Przenieś odpowiednio potraktowane komórki na szkiełka podstawowe pokryte koloidalnym złotem, umieszczone w płytce(ach) 24-dołkowej.

Uwaga: Liczba komórek przenoszonych do pojedynczej studni musi zostać określona dla każdego badanego typu komórek. W idealnym przypadku komórki powinny być równomiernie rozmieszczone na szkiełku podstawowym pokrytym koloidalnym złotem, co z kolei pozwoli na analizę statystyczną wyłącznie trajektorii utworzonych przez pojedynczą komórkę. Jeśli komórki zostaną wysiane w zbyt wysokim stężeniu, istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia nakładających się trajektorii wielu komórek. Nakładających się trajektorii nie można dokładnie skwantyfikować, w związku z czym nie mogą być one uwzględnione w końcowych analizach ruchu badanych komórek. Nakładające się trajektorie będące wynikiem udziału wielu komórek są zazwyczaj łatwo zauważalne jako trajektorie zlane lub krzyżujące się (w polu analizy), w których w tym samym przyległym, oczyszczonym obszarze można zaobserwować dwie lub więcej komórek.

Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 hr (lub przez inny odpowiedni czas; np. analizowano ruchliwość monocytów od 6 hr do 24 hr po opracowaniu oraz komórki śródbłonka w 12 hr po opracowaniu). Optymalny przedział czasowy dla określania i pomiaru ruchliwości komórkowej będzie różnić się w zależności od badanego typu komórek, a zatem powinien zostać wyznaczony eksperymentalnie dla każdego typu komórek (dobrym punktem wyjścia jest jednak okres od 6 - 12 hr po opracowaniu).

Uwaga: Jeśli eksperymentalne szkiełka podstawowe powlekane koloidalnym złotem muszą zostać zmagazynowane i/lub poddane analizie w późniejszym terminie, komórki i nanocząsteczki złota należy utrwalić na szkiełkach. Aby przeprowadzić ten etap utrwalania, po kroku 3.3 należy najpierw ostrożnie przemyć szkiełka 2 razy w 1x PBS (zaleca się zanurzanie szkiełek, aby uniknąć usunięcia nanocząsteczek złota z powierzchni), a następnie zastosować standardową metodę utrwalania komórek, np. inkubację z 3% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Po 15-minutowej inkubacji należy usunąć 3% paraformaldehyd i ostrożnie przemyć szkiełka 3 razy w 1x PBS. Utrwalone szkiełka można przechowywać w lodówce.

Za pomocą mikroskopu świetlnego należy zarejestrować obrazy śladów pozostawionych przez pojedynczą poruszającą się komórkę (Uwaga: powiększenie stosowane do fotografowania śladów komórkowych będzie zależeć od badanego typu komórek). Przykłady śladów komórkowych pozostawionych przez komórki nieruchome i ruchliwe na szkiełkach podstawowych pokrytych koloidalnym złotem przedstawiono na Rysunku 2.

Uwaga: Stwierdzono, że nanocząsteczki złota o rozmiarze zastosowanym w teście mobilności śladu fagokinetycznego są całkowicie nietoksyczne dla komórek³⁰. W razie potrzeby żywotność badanych komórek można ocenić poprzez barwienie błękitem trypanu lub badając inne markery żywotności komórkowej. Należy wziąć pod uwagę konieczność utrwalenia, rodzaj utrwalenia itp., jeśli ten krok musi zostać wykonany.

Za pomocą dostępnego bezpłatnie oprogramowania, takiego jak ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/), oba opracowane w National Institutes of Health, lub ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) opracowanego w University of Texas Health Science Center w San Antonio, na podstawie uzyskanych obrazów wyznacza się dla każdego ramienia eksperymentalnego średnią powierzchnię (w jednostkach dowolnych) złota koloidalnego usuniętego przez 10-20 lub więcej komórek (na próbkę). Następnie można przeprowadzić analizę statystyczną zebranych wyników. Na przykład wyniki można przedstawić jako średnie ± standardowe błędy średniej (SEM), stosując testy t Studenta, przyjmując wartość P <0,05 jako miarę istotności statystycznej między próbkami. Rysunki 3 i 4 przedstawiają etapy analizy powierzchni złota koloidalnego usuniętego przez komórkę.