Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

18.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4181

⸱

18 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Streszczenie

Modele małych zwierząt, takie jak myszy, są szeroko wykorzystywane do badania chorób ludzkich oraz opracowywania nowych interwencji terapeutycznych. Pomimo bogactwa informacji uzyskanych z tych badań, specyficzne cechy odporności myszy, a także specyficzność gatunkowa chorób wirusowych, takich jak zakażenie wirusem niedoboru odporności u ludzi (HIV), doprowadziły do opracowania zhumanizowanych modeli mysich. Wcześniejsze modele opierały się na wykorzystaniu myszy C. B 17 scid/scid i transplantacji ludzkiego płodowego grasicy oraz płodowej wątroby, co określano mianem thy/liv (SCID-hu) 1, 2, lub na adoptywnym transferze leukocytów z ludzkiej krwi obwodowej (SCID-huPBL) 3. Oba modele były wykorzystywane głównie do badania zakażeń HIV.

Jednym z głównych ograniczeń obu tych modeli był brak stabilnej rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych w obwodzie, co utrudniało uczynienie z nich fizjologicznie istotniejszych modeli do badania choroby HIV. W tym celu opracowano humanizowany model myszy BLT. Skrót BLT oznacza szpik kostny/wątrobę/grasicę (bone marrow/liver/thymus). W tym modelu myszy z niedoborem odporności rasy NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) w wieku od 6 do 8 tygodni otrzymują implanty grasicy i wątroby, podobnie jak w modelu myszy SCID-hu, po czym następuje drugi przeszczep ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych 4. Zaletą tego systemu jest pełna rekonstytucja ludzkiego układu odpornościowego w obwodzie. Model ten był wykorzystywany do badania infekcji i latencji HIV 5-8.

Stworzyliśmy zmodyfikowaną wersję tego modelu, w której wykorzystaliśmy genetycznie zmodyfikowane ludzkie macierzyste komórki krwiotwórcze (hHSC) do skonstruowania implantu thy/liv, a następnie zastosowaliśmy wstrzyknięcie transdukowanych autologicznych hHSC 7, 9. Podejście to prowadzi do wygenerowania genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych. Co ważniejsze, dostosowaliśmy ten system do zbadania potencjału generowania funkcjonalnych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) wykazujących ekspresję receptora limfocytów T specyficznego dla czerniaka. Wykorzystując ten model, byliśmy w stanie ocenić funkcjonalność naszych transgenicznych CTL, stosując obrazowanie pozytonową tomografią emisyjną (PET) in vivo w celu określenia regresji guza (9).

Celem niniejszego protokołu jest opisanie procesu generowania tych myszy transgenicznych oraz ocena skuteczności in vivo z wykorzystaniem obrazowania PET na żywo. Należy zauważyć, że ze względu na wykorzystanie ludzkich tkanek oraz wektorów lentiwirusowych, nasze zaplecze spełnia wytyczne CDC NIH dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) ze specjalnymi środkami ostrożności (BSL2+). Ponadto myszy NSG są w ciężkim stanie immunokompromitacji, w związku z czym ich kwaterowanie i utrzymanie muszą być zgodne z najwyższymi standardami sanitarnymi (http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html).

Protokół

A. Generowanie myszy BLT

Generowanie myszy BLT jest podzielone na trzy (3) części: (1) przetwarzanie tkanki płodowej i przygotowanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34, (2) transplantacja tkanki ludzkiej oraz (3) transplantacja wtórna. Do wszystkich protokołów dołączyliśmy Tabelę 1 z informacjami o odczynnikach.

1. Obróbka tkanek i izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34

Można wykorzystać świeżą tkankę płodową lub tkankę dostarczoną w transporcie nocnym w lodzie z różnych agencji pozyskiwania organów. Tkanka płodowa często nie jest sterylna, co potwierdza powstanie 1 000 kolonii bakteryjnych na mililitr otaczającego medium na agarze krwi. Rutynowo przemywamy tkankę dwukrotnie w 40 ml sterylnego PBS. Choć nie usuwa to wszystkich bakterii, może to stanowić różnicę między udaną serią transplantacji a wynikiem, w którym większość myszy biorców ginie z powodu infekcji bakteryjnej. Jako dodatkowy krok, w celu dalszej dezynfekcji tkanki, hodujemy zawiesinę komórkową w obecności antybiotyków.

1.1 Przetwarzanie tkanki grasicy płodowej

  1. Przemyj grasicę, odlewając medium do zlewki z wybielaczem i używając skalpela, aby zapobiec wpadnięciu tkanki do wybielacza. Napełnij probówkę PBS. Zamknij i kilkakrotnie odwróć, aby przemyć grasicę. Odlej nadsącz do wybielacza. Powtórz czynność.
  2. Umieść tkankę grasicy w 8 ml RPMI + 10% Fetal Calf Serum w szalce 60-mm i posiekaj na kawałki o wielkości od 1,5 do 2 mm za pomocą dwóch skalpeli. Siekanie skalpelami minimalizuje rozdzieranie i uszkadzanie fragmentów tkanki. Uszkodzona tkanka ma tendencję do obrzęku, staje się lepka i trudna do zassania do igły implantacyjnej. Liczba uzyskanych fragmentów stanowi pierwszą górną granicę liczby myszy do transplantacji.
  3. Przenieś zawieszone fragmenty za pomocą pipety 25 ml (aby zminimalizować uszkodzenia tkanki) do kolby T25. Dodaj do kolby 70 μl piptazo (Zosyn) i inkubuj przez noc, w 37 °C, 5% CO2. Znacznie redukuje to zanieczyszczenia bakteryjne. Jeśli zamierzasz przeprowadzić typowanie tkankowe lub jakiekolwiek inne analizy fenotypowe, pobierz 1 ml komórek.

1.2 Obróbka tkanki wątroby płodowej

  1. Umyć wątrobę zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
  2. Dodać 10 ml pożywki Iscove'a i przelać całość do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
  3. Za pomocą dwóch skalpeli pokroić wątrobę na małe (~3 mm) kawałki. W przypadku napotkania białej tkanki łącznej, zeskrobać z niej wątrobę, a tkankę łączną usunąć do roztworu wybielacza.
  4. Zhomogenizować tkankę, zaciągając ją 3 lub 4 razy do strzykawki 12 ml wyposażonej w tępą igłę 16 gauge, a następnie przenieść do probówki 50 ml.
  5. Przygotować enzymy do trawienia tkanki w następujący sposób: do 10 ml pożywki Iscove'a w probówce 50 ml dodać po 200 μl każdego z następujących składników: kolagenazy typu IV (1 mg/ml), hialuronidazy (1 mg/ml) oraz DNazy I (2 U/ml).
  6. Nabrać enzymy do strzykawki 12 ml i założyć filtr 0,22 μ. Przefiltrować mieszaninę enzymów z pożywką bezpośrednio do zawiesiny komórkowej.
  7. Zakręcić probówkę i zabezpieczyć komórki Parafilmem. Inkubować w rotatorze w temperaturze 37 °C przez 90 min.
  8. Przygotować probówkę 50 ml z sitkiem komórkowym 100 μ. Przepompować trawioną zawiesinę komórkową przez to sitko.
  9. Dodać PBS do komórek, aby zwiększyć objętość do 50 ml. Rozdzielić zawiesinę do dwóch probówek po 25 ml.
  10. Podłożyć pod komórki 10 ml Ficollu. Wirować przy 2 400 rpm przez 20 min bez hamowania.
  11. Warstwa interfejsu powinna być gruba. Odessać ją pipetą 5 ml i przenieść do innej probówki. Powinny powstać dwie probówki z interfejsem. Do każdej dodać 50 ml PBS i wirować przy 1 200 rpm przez 10 min.
  12. Połączyć osady w jednej probówce i przemyć trzykrotnie PBS z dodatkiem 2% FCS.
  13. Na koniec zawiesić w 50 ml RPMI + 10% FCS i policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu. W zależności od wielkości tkanki można uzyskać od 108 do 109 hepatocytów łącznie.
  14. Przenieść komórki do kolby T150 i dodać 30 ml RPMI + 10% FCS oraz 0,8 ml piptazo.
  15. Inkubować od 1 do 1,5 h w temperaturze 37 °C w celu usunięcia komórek adherentnych.

1.3 Sortowanie i transdukcja CD34 krwiotwórczych komórek macierzystych

  1. Po przytwierdzeniu komórek w kroku 1.2.15, delikatnie potrząśnij kolbą w przód i w tył przez minutę, aby usunąć luźne komórki. Na powierzchni pozostanie wiele fibroblastów i innych komórek.
  2. Ponownie policz komórki, stosując rozcieńczenie od 1 do 20, i zapisz całkowitą liczbę komórek. Odstaw kilka dziesiątych mililitra do późniejszego barwienia. Liczba komórek powinna być o około 30% mniejsza od początkowego przeliczenia (krok 1.2.13).
  3. Odwiruj i przemyj dwukrotnie 40 ml buforu MACS.
  4. Komórki CD34 są sortowane przy użyciu zestawu CD34 Direct Kit firmy Miltenyi Biotech. Postępujemy ściśle według protokołu producenta, używając kolumn LS dostarczonych przez tę samą firmę.
  5. Odzyskane komórki znajdą się w 5 ml. Policz i oblicz całkowitą liczbę komórek. Wydajność komórek CD34+ powinna wynosić 3-5% całkowitej liczby komórek. Wartość ta różni się w zależności od wieku wątroby płodu. Młodsze wątroby płodowe zazwyczaj dają wyższą wydajność komórek CD34+.
  6. Podziel liczbę komórek przez 1x106. Pozwala to wyznaczyć drugą górną granicę liczby myszy do transplantacji.
  7. Policz frakcję CD34- (przepływ i przemycia) i odstaw 6 x 106 na jedną mysz do transplantacji. Hoduj te komórki przez noc w 50 do 80 ml medium RPMI + 10% płodowej surowicy cielęcej (Fetal Calf Serum) + 1% piptazo.
  8. Przeprowadź transdukcję komórek CD34+ przez noc za pomocą wektora lentiwirusowego. Stosujemy retronectin firmy Takara, ściśle według instrukcji producenta.
  9. Następnego dnia zbierz komórki CD34-, przetransfekowane komórki CD34+ i wykonaj pomiar.
  10. Podziel komórki CD34+ na dwie równe części: część A i część B.
  11. Odwiruj komórki CD34+ z części A po transdukcji i zawieś w 4 do 6 ml medium do mrożenia (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, filtrowane sterylnie przez filtr 0.22 μ). Przenieś aliquoty po 1 ml do fiolek do mrożenia i opisz je jako „huFetalCD34”, podając liczbę komórek w fiolce, datę oraz swoje inicjały.
  12. Dla każdej myszy wymieszaj 0,5x106 przetransdukowanych komórek CD34+ z części B oraz 4,5x106 komórek CD34- w sterylnej probówce do mikrocentryfugi z nakrętką, odwiruj i przechowuj w lodzie. Rozmroź również w lodzie probówkę z Matrigel (BD Biosciences). Wszystkie te probówki muszą być przechowywane w lodzie do momentu użycia (przejdź do kroku 2.10).

2. Transplantacja tkanek

Celem tego etapu jest przeszczepienie ludzkiego organoidu grasicy/wątroby płodowej pod torebkę nerki myszy NSG. Organoid ten lepiej naśladuje procesy selekcji i dojrzewania ludzkich limfocytów T, ponieważ ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste wykorzystają ludzką grasicę, a nie mysią, jako miejsce różnicowania się w różne linie limfocytów T oraz inne linie limfoidalne. Zastosowanie komórek CD34- w procesie transplantacji służy regeneracji zrębu płodowej wątroby, co pozwala na lepsze przeszczepienie i wzrost implantu. W badaniu wykorzystano myszy NSG w wieku 6-8 tygodni.

  1. Przygotowanie leków do zabiegu:
    1. Izofluran: Zwiń gazik o rozmiarze 2 cali i włóż go do 15 ml probówki wirówkowej z nakrętką. Wlej około 1 ml izofluranu bezpośrednio z butelki.
    2. Ketamina/ksylazyna: Dodaj 0,52 ml ketaminy (Ketaset) (100 mg/ml) i 0,52 ml ksylazyny (Anased) (100 mg/ml) do 20 ml fiolki z solą fizjologiczną do iniekcji. Oznacz datą ważności komponentu o najkrótszym terminie przydatności i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    3. Karprofen (Rimadyl). Rozcieńcz bezpośrednio przed zabiegiem chirurgicznym. Rozcieńcz 1:100, pobierając 0,1 lub 0,2 ml z fiolki za pomocą strzykawki 1 ml i igły 25G. Wstrzyknij do 10 lub 20 ml soli fizjologicznej do iniekcji. Oznacz etykietą i datą. Przechowuj w lodówce maksymalnie przez jeden dzień. Napełnij strzykawki 3 ml z igłami 25G.
  2. Przygotuj stół operacyjny. Przykryj go sterylnymi niebieskimi podkładami oraz sterylnym ręcznikiem dla każdego chirurga. Każdy chirurg otrzymuje ze swojego zestawu wysterylizowanych instrumentów: nożyczki 4", zakrzywione kleszczyki tępe, pęsetę anatomiczną, zacisk hemostatyczny, stępiony trokar 16G oraz aplikator do klipsów ranowych. Dodatkowo potrzebna jest nić chirurgiczna Vicryl z zakrzywioną igłą, zestaw opakowań z chusteczkami nasączonymi izopropanolem, szalka Petriego 35 mm z PBS oraz strzykawka 1 ml wypełniona PBS.
  3. Ustaw na środku stołu szklany słoik Coplina z 2 cm Betadinu i 2 patyczkami bawełnianymi. Przelej fragmenty grasicy do szalki Petriego 60 mm.
  4. Znieczulenie przeprowadza się na osobnym stole lub w komorze okapowej wyłożonej sterylnymi niebieskimi podkładami. Przygotuj dwa małe statywy oraz wagę elektroniczną z zlewkiem do trzymania myszy. W jednym statywie umieść strzykawki insulinowe 0,5 ml X 28G napełnione ketaminą/ksylazyną, a w drugim strzykawki 3 ml z karprofenem. Przenieś również pojemnik na odpady biologiczne w pobliże, aby zbierać w postaci ściętą sierść.
  5. Zważ wszystkie myszy (w wieku 6-8 tygodni) w klatce, aby uzyskać średnią wagę, a następnie napełnij strzykawki dawką 15 μl/g ketaminy/ksylazyny. Wykonaj iniekcje wszystkim myszom w klatce.
  6. Gdy myszy staną się apatyczne, wygol ich lewą stronę od biodra do barku, pomiędzy linią grzbietu a brzuchem, używając maszynki Oster z ostrzem nr 40. Zapisz ich wagę i ponumeruj je za pomocą dziurkacza do uszu.
  7. Wstrzyknij 0,3 ml karprofenu podskórnie w okolicy barku.
  8. Sprawdź poziom znieczulenia myszy, uciskając łapę. Jeśli mysz zareaguje, podaj izofluran z probówki przez około 12 s. Następnie ponownie spróbuj ucisnąć łapę. Podawaj krótkie dawki izofluranu, aż odruch łapy zniknie. Połóż mysz na prawym boku, skierowaną w lewo.
  9. Do wprowadzenia tkanki używa się igły do implantacji nowotworów o rozmiarze 16G z zaokrągloną końcówką. Przepłucz trokar kilka razy w szalce z PBS. Trzymaj go poziomo z prętem znajdującym się tuż za końcówką. Za pomocą pęsety anatomicznej dodaj fragment grasicy i zassij go.
  10. Pomocnik dodaje 5 μl zimnego Matrigelu do jednej probówki z komórkami (krok 1.3.12) za pomocą pipety wypierającej Eppendorf i miesza poprzez delikatne mieszanie. Chirurg trzyma trokar poziomo i powoli wycofuje pręt, podczas gdy pomocnik pipetuje mieszaninę Matrigelu do trokara. Mieszanina żeluje w temperaturze pokojowej.
  11. Przetrzyj odsłoniętą skórę Betadynem. Następnie usuń go chusteczką z izopropanolem. Powtórz czynność.
  12. Zlokalizuj śledzionę pod skórą. Jest to najciemniejszy punkt. Nerka myszy znajduje się około 5 mm grzbietowo względem śledziony i jest widoczna przez wygoloną skórę.
  13. Chwyć skórę nad tym miejscem tępymi kleszczykami i wykonaj cięcie równolegle do śledziony o długości około 15 mm. Wykonaj podobne cięcie w warstwie mięśniowej otrzewnej poniżej. U samców nerka powinna być bezpośrednio widoczna i wystarczy lekko ucisnąć brzuch, aby ją wypchnąć. U samic może być konieczne chwycenie jajnika zaciskiem hemostatycznym i wyciągnięcie nerki. Może to pomóc w utrzymaniu nerki na zewnątrz ciała. W przypadku samców należy utrzymywać lekki nacisk na brzuch lewą ręką, aby nerka pozostała odsłonięta.
  14. Wykonaj niewielki otwór w tylnej części torebki nerki. Może wystąpić niewielkie krwawienie.
  15. Wsuń trokar do tego otworu i wzdłuż nerki, aż wylot trokara zostanie całkowicie przykryty przez torebkę nerki. Następnie, używając małego palca prawej ręki, wstrzyknij tkankę.
  16. Delikatnie wsuń nerkę z powrotem za pomocą zamkniętego zacisku hemostatycznego. Nałóż jeden szew na otrzewną, wiążąc go podwójnym węzłem. Ściśnij skórę jak woreczek i załóż dwa klipsy ranowe.
  17. Nałóż kroplę PBS na każde oko i połóż mysz na boku na ściółce klatkowej. Przed opuszczeniem zwierząt upewnij się, że wszystkie myszy wróciły do pozycji leżącej na brzuchu.
  18. Następnego dnia podaj każdej myszy kolejną dawkę karprofenu.

3. Przeszczepienie wtórne

Celem tego etapu generowania myszy BLT jest zasiedlenie szpiku kostnego myszy ludzkimi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi. Przeszczep implantowany w procedurze (2) nie jest wystarczający do pełnej rekonstrukcji ludzkiego układu odpornościowego u tych myszy. Podczas wtórnego przeszczepu poddajemy myszy irradiation subletalnej w celu usunięcia komórek szpiku kostnego myszy, tworząc w ten sposób „miejsce” dla implantacji ludzkich komórek CD34+.

  1. Po czterech do sześciu tygodniach myszy należy napromieniować dawką 2,7 Gy. Tego samego dnia myszy otrzymują wstrzyknięcie komórek CD34+ przetransdukowanych zgodnie z Częścią A. Ramy czasowe opierają się na procesie tworzenia i wzrostu implantu thy/liv przeszczepionego w kroku 2. Zazwyczaj w tym czasie implant ulega znacznemu wzrostowi, co pozwala przejść do kolejnych etapów.
  2. rozmrozić komórki CD34+ przetransdukowane z części A, przemyć i zawiesić w medium do uzyskania stężenia 5x106/ ml.
  3. Napełnij strzykawki insulinowe 0,5 ml z igłami 28G objętością 0,1 ml zawiesiny komórek (105 do 5x105 komórek na 0,1 ml na mysz) dla jednej klatki myszy (każda klatka zawiera maksymalnie 5 myszy) i ułożyć je na stojaku tyłem do siebie.
  4. Zanurz nos myszy w tubie z izofluranem, trzymając zwierzę za kark, i utrzymuj tę pozycję przez około 20 s, aby je znieczulić. Odliczaj czas, aby go kontrolować.
  5. Następnie skieruj zwierzę twarzą w prawą stronę i naciągnij skórę wokół szyi kciukiem oraz palcem wskazującym lewej ręki. Naciśnij obszar pod żuchwą trzecim palcem w taki sposób, aby prawe oko myszy wysunęło się do przodu. Trzymając strzykawkę równolegle do długiej osi głowy myszy, wprowadź igłę za oko i przesuń ją delikatnie, aż napotka opór. Nie naciskaj dalej, lecz wstrzyknij zawartość w czasie około 2 s.
  6. Dwa do trzech miesięcy później u myszy pobiera się krew drogą zatruchową (z splotu zatrochowego) przy użyciu szklanych pipet powlekanych EDTA. Maksymalna ilość pobieranej krwi z jednej myszy nie może przekraczać 200 μl na miesiąc. Do analizy FACS wystarczająca powinna być objętość 50–100 μl krwi. Alternatywne metody pobierania krwi obejmują upust z żyły twarzowej oraz z żyły ogonowej. Ta druga metoda pozwala na uzyskanie bardzo małych objętości krwi, które mogą być niewystarczające do przeprowadzenia wielu analiz.
  7. Próbki krwi barwi się w celu wykazania ekspresji ludzkiego markera limfocytów CD45, aby ocenić stopień rekonstytucji. Próbki krwi dodaje się do 1 ml buforu do lizy erytrocytów (160 mM NH4Cl)4Cl, 100 mM KHCO₃3, 0,01 mM EDTA) i inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyć komórki w buforze do lizy, wirując przez 5 min przy 1200 obr./min; w razie potrzeby powtórzyć czynność.
  9. Odwirować komórki zgodnie z opisem w punkcie 3.8 i przemyć w PBS z dodatkiem 3% płodowego surowicy cielęcej (FACS-PBS).
  10. Usunąć nadsącz i zawiesić osad w 100 μl FACS-PBS.
  11. Należy dodać przeciwciała w celu oceny rekonstrukcji limfocytów ludzkich. Zazwyczaj stosujemy następujące markery: CD45 (marker limfocytów ludzkich), CD8, CD4, CD14 i CD16 dla makrofagów i monocytów, CD19 dla limfocytów B oraz CD56 dla komórek NK.
  12. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  13. Przemyć zgodnie z opisem w kroku 3.9 i resuspenderować komórki w 2% paraformaldehydzie do analizy FACS.
  14. Jeśli myszy uległy rekonstytucji, przechodzimy do iniekcji nowotworu. Poziomy rekonstytucji limfocytów ludzkich są zróżnicowane i wynoszą od mniej niż 1% do 40% całkowitej liczby komórek krwi. Poziomy i typy linii limfocytarnych są porównywalne z tymi, których można by oczekiwać u zdrowych ludzkich dawców krwi. Należy jednak spodziewać się wahań w liczbie linii innych niż limfocyty T. Jeśli liczby te nie będą satysfakcjonujące w ciągu 12 tygodni, można powtórzyć procedurę drugiego przeszczepu zgodnie z krokiem 3.1.
  15. Linie komórek nowotworowych są hodowane zgodnie z zaleceniami producenta lub laboratorium. Komórki są zbierane, płukane i resuspenderowane w Matrigelu w stosunku 1:1 (50 μl komórek/50 μl Matrigelu). Próbki przez cały czas przechowywane są w lodzie.
  16. Myszy poddaje się znieczuleniu i wygoleniu w miejscu wstrzyknięcia. Obszar ten sterylizuje się za pomocą gazika z izopropanolem. Pomocnik pobiera zawiesiny komórkowe do schłodzonych wcześniej strzykawek 1 ml z igłami 23G. Komórki nowotworowe wstrzykuje się podskórnie. Miejsce wstrzyknięcia należy pokryć maścią z antybiotykiem. Guzy powinny uformować się i zacząć rosnąć w ciągu 4 tygodni.

B. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) in vivo

W ramach naszych badań analizujemy wychwyt glukozy ([18F]-fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG)), dlatego myszy są głodzone przez 4-6 hr przed obrazowaniem. Skanowanie MicroPET/CT wykonuje się przy użyciu skanera microPET Inveon (Siemens Preclinical Solutions) oraz skanera MicroCATII CT (Siemens PreclinicalSolutions). Analizę obrazów przeprowadzono z wykorzystaniem oprogramowania OsiriX (Pixmeo, Szwajcaria). Celem jest pomiar aktywności metabolicznej guza, a w konsekwencji wykorzystanie obrazowania PET jako alternatywy dla fizycznego pomiaru regresji nowotworu. Jak pokazano na Rysunku 2, napotkaliśmy guzy, które na podstawie wyglądu i wielkości nie wydawały się objęte działaniem terapii, jednak obrazowanie PET w czasie rzeczywistym ujawniło rozległą martwicę tkanek. Metodologia ta może służyć jako bardziej czuły i dokładny wskaźnik regresji guza.

  1. Wyznacz jedną komorę do znieczulenia myszy (2% izofluranu) oraz drugą komorę do 60-minutowego okresu wychwytu FDG przed skanowaniem PET („komora oczekiwania”). W obu komorach umieść niebieskie podkłady.
  2. Ponieważ zwierzęta są poddawane znieczuleniu przez dłuższy czas, należy utrzymać je w cieple w temperaturze 30 °C, używając wypełnionych wodą rękawiczek ogrzanych w mikrofalówce oraz kładąc klatki na podkładkach grzewczych.
  3. Włącz przepływ izofluranu do tej komory. Pozostaw izofluran w komorze znieczulającej przez około 5-10 min przed umieszczeniem w niej myszy. Upewnij się, że pokrywa jest zablokowana i szczelnie zamknięta, aby uniknąć wycieku izofluranu.
  4. Umieść pierwszą mysz w komorze znieczulającej i szczelnie zamknij pokrywę. Odczekaj 5-10 min lub do momentu utraty przytomności przez mysz.
  5. Wyjmij mysz z komory znieczulającej, oznacz ogon myszy (różny kolor dla każdej klatki) i wykonaj domięśniowy wtrysk [18F]FDG (80 μCi). Zapisz godzinę wykonania wtrysku. Mysz zostanie ponownie znieczulona po 50 min od tego momentu, co pozwoli na 10 min przygotowań do skanowania PET (łącznie 60 min wychwytu [18F]FDG przed skanowaniem PET).
  6. Umieść wstrzykniętą mysz w komorze oczekiwania, aby umożliwić wychwyt [18F]FDG przez 1 h przed skanowaniem PET. Nie blokuj pokrywy. Pozostaw ją lekko uchyloną, aby zapewnić przepływ powietrza.
  7. Natychmiast umieść kolejną mysz przeznaczoną do wstrzyknięcia FDG w komorze znieczulającej. Kolejne wtryski u myszy powinny być przeprowadzane w odstępach 10 min, ponieważ proces skanowania PET trwa 10 min. Bezpośrednio po zeskanowaniu jednej myszy, 60-minutowy czas wychwytu FDG dla kolejnej myszy do skanowania upłynie dokładnie za 10 min.
  8. Kontynuuj znieczulanie i wstrzykiwanie myszy zgodnie z krokami 7-9.
  9. Po upływie 50 min od czasu wstrzyknięcia pierwszej myszy, umieść ją ponownie w komorze znieczulającej (kontynuując jednocześnie znieczulanie i wstrzykiwanie pozostałych myszy).
  10. Podłącz łóżko dla myszy do linii tlenowej i linii z izofluranem, a następnie włącz przepływ izofluranu do łóżka. Na łóżku umieść niebieski podkład.
  11. Umieść mysz przygotowaną do skanowania PET na łóżku, wyprostuj kończyny i utrwal tę pozycję za pomocą taśmy. Na oczy nałóż lubrykant. Ten krok jest kluczowy, ponieważ ułożenie zwierzęcia może wpłynąć na jakość obrazowania.
  12. Odłącz linie z izofluranem i tlenem, a następnie szybko zamontuj łóżko w urządzeniu do skanowania PET. Podłącz linie z izofluranem i tlenem. Upewnij się, że przepływ izofluranu w skanerze PET jest włączony. Podłącz kabel skanera PET i rozpocznij skanowanie.
  13. Po zakończeniu skanowania PET przenieś zwierzę do skanera CT. Po tym skanowaniu przenieś zwierzę do odpowiedniej klatki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat procesu transplantacji przedstawiono na Rysunku 1A. Zdjęcie implantu thy/liv przedstawiono na Rysunku 1B. Tkanka grasicy rozwija się prawidłowo i wykazuje fizjologiczny rozkład ludzkich limfocytów T CD4 i CD8. Po rekonstytucji zwierzęta posiadają ludzki układ odpornościowy z prawidłowym rozkładem limfocytów T CD4, CD8 oraz innych linii komórek odpornościowych.

Rozbieżność między wielkością guza a żywą tkanką przedstawiono na Rysunku 2....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmodyfikowany humanizowany model myszy BLT w połączeniu z obrazowaniem PET in vivo stanowi potężne narzędzie do badania przewlekłych ludzkich chorób. System ten bazuje na modelu mysim BLT i rozszerza jego zastosowanie poza ograniczony zakres badań nad HIV. Ponadto jest to doskonały układ do badania różnych protokołów terapii genowej, jak również technik diagnostycznych, zanim zostaną one wprowadzone do praktyki klinicznej. To ostatnie, w połączeniu z niskimi kosztami hodowli myszy w porównaniu z naczelnymi, czyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Alvinowi Welchowi i Larry'emu Pangowi za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana częściowo z grantu National Institutes of Health (NIH) P50 CA086306, grantów California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RC1-00149-1 i RS1-00203-1; CIRM New Faculty Award RN2-00902-1, Caltech-UCLA Joint Center for Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH/NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, CIRM Tools and Technology Award RT1-01126 oraz UC Multicampus Research Program and Initiatives z California Center for Antiviral Drug Discovery (numer MRPI-143226).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSInvitrogen10010049
RPMI 1640A1049101
Pożywka Iscove's12440061
Płodowa surowica cielęca16000085
Kolagenaza typu IVSigma AldrichC5138
HialuronidazaH3506
DNAza IRoche Diagnostics10104159001
Piptazo (Zosyn)Pfizer Kombinacja piperacyliny i tazobaktamu
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)Ge Healthcare Life Sciences17-1440-02
Bufor MACSMiltenyi BiotechPatrz uwagiBufor MACS: PBS uzupełniony o 0.5% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM cytrynianowo-dekstrozową formułę A
Zestaw mikrokulek CD34130-046-702
Kolumny LS130-042-401
RetronectinTakaraT100A
MatrigelBD Biosciences354263
IzofluranBaxterhttp://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Karprofen (Rimadyl)Pfizer Animal Healthhttps://www.rimadyl.com/default.aspx

Bibliografia

  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
  3. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
  4. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  5. Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16(2008).
  6. Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
  7. Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  8. V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
  9. Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystychimplantacja grasicy i wątrobygenetycznie modyfikowane limfocyty Tobrazowanie PET in vivoocena regresji guzamyszy NOD SCID Gammarekonstrukcja ludzkiego układu odpornościowegoTCR specyficzny dla czerniakafunkcjonalność cytotoksycznych limfocytów T
Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.