$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A. Generacja myszy BLT
Pokolenie myszy BLT dzieli się na trzy (3) części: (1) przetwarzanie tkanek płodowych i przygotowanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34, (2) przeszczep tkanki ludzkiej i (3) wtórny przeszczep. Dla wszystkich protokołów dostarczyliśmy Tabelę 1 z informacjami o odczynnikach.
1. Przetwarzanie tkanek i izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34
Można użyć świeżej tkanki płodowej lub tkanki wysłanej w nocy na lodzie z różnych agencji zajmujących się pobieraniem narządów. Często tkanka płodowa nie jest sterylna, o czym świadczy produkcja 1000 kolonii bakteryjnych na agarze z krwią na mililitr otaczającej pożywki. Rutynowo myjemy chusteczkę dwukrotnie w 40 ml sterylnego PBS. Chociaż nie usuwa to wszystkich bakterii, może mieć znaczenie między udaną serią przeszczepów a wynikiem, w którym większość myszy biorców ulega infekcji bakteryjnej. Jako dodatkowy krok, aby jeszcze bardziej zdezynfekować tkankę, hodujemy zawiesinę komórkową w obecności antybiotyków.
1.1 Przetwarzanie tkanki grasicy płodu
- Umyj grasicę, wylewając pożywkę do zlewki z wybielaczem i używając skalpela, aby zapobiec ślizganiu się tkanki do wybielacza. Napełnij probówkę PBS. Zakręć i odwróć kilka razy, aby umyć grasicę. Zdekantować supernatant do wybielacza. Powtórzyć.
- Umieść tkankę grasicy w 8 ml RPMI + 10% Płodowej Surowicy Cielęcej w naczyniu o średnicy 60 mm i ścinaj na kawałki o średnicy od 1,5 do 2 mm za pomocą dwóch skalpeli. Strzyżenie skalpelami minimalizuje rozdzieranie i uszkadzanie kawałków tkanki. Uszkodzona tkanka ma tendencję do obrzękiwania, lepkości i trudności z wciągnięciem do igły implantu. Liczba uzyskanych bitów jest pierwszym górnym limitem dla myszy nadających się do przeszczepu.
- Przenieść zawieszone kawałki za pomocą pipety o pojemności 25 ml (w celu zminimalizowania uszkodzenia tkanek) do kolby T25. Dodać 70 μl piptazo (Zosyn) do kolby i hodować przez noc, w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . To znacznie zmniejsza ilość bakterii zanieczyszczających. Jeśli chcesz wykonać typowanie tkanek lub inne testy fenotypowania, wyjmij 1 ml komórek.
1.2 Przetwarzanie tkanki wątroby płodu
- Umyć wątrobę jak w kroku 1.1.1.
- Dodać 10 ml pożywki Iscove'a i wszystko przelać na 100-milimetrową szalkę Petriego.
- Za pomocą dwóch skalpeli pokrój wątrobę w kostkę na małe (~3 mm) kawałki. Jeśli natkniesz się na białą tkankę łączną, zeskrob z niej wątrobę i wyrzuć ją do wybielacza.
- Homogenizować tkankę, zasysając ją do strzykawki o pojemności 12 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 16 3 lub 4 razy i przenosząc do probówki o pojemności 50 ml.
- Przygotować enzymy do trawienia tkankowego w następujący sposób: Do 10 ml leku Iscove's w probówce o pojemności 50 ml dodać po 200 μl każdego: kolagenazy typu IV (1 mg/ml), hialuronidazy (1 mg/ml), DNazy I (2 U/ml).
- Pobrać enzymy do strzykawki o pojemności 12 ml i wyposażyć ją w filtr 0,22 μ. Przefiltrować enzym/pożywkę bezpośrednio do zawiesiny komórkowej.
- Zakryj i uszczelnij komórki Parafilmem. Obracać w temperaturze 37 °C przez 90 min.
- Ustaw probówkę o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 100 μ komórek. Pipetować trawienie komórek przez to sitko.
- Dodaj PBS do komórek, aby zwiększyć objętość do 50 ml. Podziel to na dwie probówki po 25 ml.
- Umieść komórki pod 10 ml Ficollu. Wiruj z prędkością 2 400 obr./min przez 20 minut bez hamulca.
- Interfejs powinien być gruby. Odessać pipetą o pojemności 5 ml i przenieść do innej probówki. Powinieneś mieć dwie rurki interfejsu. Do każdego z nich dodać 50 ml PBS i wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut.
- Połącz granulki w jednej tubie i przemyj jeszcze trzy razy PBS zawierającym 2% FCS.
- Na koniec zawiesić w 50 ml RPMI + 10% FCS i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego. W zależności od wielkości tkanki można uzyskać od 108 do 109 całkowitych hepatocytów.
- Przenieść komórki do kolby T150 i dodać 30 ml RPMI + 10% FCS i 0,8 ml piptazo.
- Inkubować przez 1 do 1,5 godziny w temperaturze 37 °C w celu usunięcia przylegających komórek.
1.3 Sortowanie i transdukcja hematopoetycznych komórek macierzystych CD34
- Po przyłączeniu komórek w kroku 1.2.15 delikatnie mieszać kolbę w przód i w tył przez minutę, aby usunąć luźne komórki. Będzie dużo fibroblastów i tym podobnych przyklejonych do powierzchni.
- Policz ponownie, używając rozcieńczenia od 1 do 20 i zapisz całkowitą liczbę komórek. Zachowaj kilka dziesiątych ml na późniejsze barwienie. Powinieneś mieć około 30% mniej komórek w stosunku do początkowej liczby komórek (krok 1.2.13).
- Odwirować i przemyć dwa razy 40 ml buforu MACS.
- Komórki CD34 są sortowane za pomocą zestawu CD34 Direct Kit firmy Miltenyi Biotech. Postępujemy dokładnie zgodnie z protokołem producenta, korzystając z kolumn LS dostarczonych przez tę samą firmę.
- Odzyskane komórki będą w 5 ml. Policz i oblicz całkowitą liczbę komórek. Twoja wydajność komórek CD34 + powinna wynosić 3-5% całkowitej liczby komórek. Różni się to w zależności od wieku wątroby płodu. Wątroba młodszego płodu ma tendencję do dawania wyższej wydajności komórek CD34 +.
- Podziel liczbę komórek przez 1x106. Daje to drugą górną granicę dla myszy nadających się do przeszczepu.
- Policz frakcję CD34- (przepływ i płukanie) i zarezerwuj 6 x 106na mysz do przeszczepienia. Hoduj te komórki przez noc w 50 do 80 ml RPMI + 10% Płodowa Surowica Cielęca + 1% piptazo.
- Transdukuj komórki CD34 + przez noc za pomocą wektora lentiwirusowego. Używamy retronektyny firmy Takara dokładnie zgodnie z instrukcjami producenta.
- Następnego dnia zbierz komórki CD34, transfekowane komórki CD34 + i policz.
- Podziel komórki CD34+ na pół: część A i część B.
- Odwiruj część A transdukowanych komórek CD34+ i zawieś w 4 do 6 ml pożywki zamrażającej (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterylnie przefiltrowane). Umieścić 1 ml porcji w fiolkach do zamrażania i oznaczyć etykietą "huFetalCD34", liczbą komórek w fiolce, datą i inicjałami.
- Dla każdej myszy wymieszaj 0,5x106części B transdukowanych komórek CD34+ i 4,5x106komórek CD34- w sterylnej probówce do mikrofuge z nakrętką, granulkę i trzymaj na lodzie. Rozmrozić również tubkę Matrigel (BD Biosciences) na lodzie. Wszystkie te probówki muszą być trzymane na lodzie do czasu użycia (przejdź do kroku 2.10).
2. Przeszczep tkanek
Celem tego kroku jest przeszczepienie ludzkiego organoidu grasicy/wątroby pod mysią kapsułkę nerkową NSG. Ten organoid lepiej naśladuje proces selekcji i dojrzewania ludzkich limfocytów T, ponieważ ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste będą wykorzystywać ludzką grasicę, a nie mysz, jako miejsce różnicowania się do różnych limfocytów T i innych linii limfoidalnych. Zastosowanie komórek CD34- w procesie transplantacji ma na celu regenerację zrębu wątroby płodu i pozwala na lepszy przeszczep i wzrost implantu. Wiek używanych myszy NSG wynosi 6-8 tygodni.
- Przygotowanie leków do zabiegu:
- Izofluran: Zwiń 2-calową gazikę i wlej ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wlać około 1 ml izofluranu bezpośrednio z butelki.
- Ketamina/zylazyna: Dodać 0,52 ml ketaminy (Ketaset) (100 mg/ml) i 0,52 ml ksylazyny (Anased) (100 mg/ml) do 20 ml fiolki z solą fizjologiczną do wstrzykiwań. Oznaczyć etykietą datę ważności najwcześniejszego składnika, którego termin ważności upływa, i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
- Karprofen (Rimadyl). Rozcieńczyć go tuż przed zabiegiem chirurgicznym. Rozcieńczyć w stosunku 1:100, pobierając 0,1 lub 0,2 ml z fiolki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G. Wstrzyknąć do 10 lub 20 ml soli fizjologicznej do wstrzykiwań. Etykieta i data. Przechowywać w lodówce tylko przez jeden dzień. Umieścić w strzykawkach o pojemności 3 ml z igłami 25G.
- Ustaw tabelę do operacji. Przykryj go sterylnymi niebieskimi podpaskami i sterylnym ręcznikiem dla każdego chirurga. Każdy chirurg dostaje ze swojego pudełka wysterylizowane narzędzia: 4-calowe nożyczki, zakrzywione kleszcze, kleszcze igłowo-nosowe, hemostat, stępiony trochar 16G i aplikator do spinania ran. Ponadto potrzebują szwu Vicryl z zakrzywioną igłą, stosu saszetek chusteczek z izopropanolem, szalki Petriego o średnicy 35 mm PBS oraz strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej PBS.
- Na środku stołu ustaw szklany słoik Coplin z 2 cm betadyną i 2 wacikami. Wsyp kawałki grasicy do szalki Petriego o średnicy 60 mm.
- Znieczulenie wykonywane jest na osobnym stole lub w kapturze pokrytym sterylnymi niebieskimi elektrodami. Ustaw dwa małe stojaki i wagę elektroniczną ze zlewką do przechowywania myszy. Użyj jednego stojaka do przechowywania strzykawek insulinowych o pojemności 0,5 ml x 28 G załadowanych ketaminą/ksylazyną, a drugiego do przechowywania strzykawek o pojemności 3 ml karprofenu. Przesuń również pojemnik na odpady biologiczne w pobliżu, aby pomieścić ogolone futro.
- Zważ wszystkie myszy (w wieku 6-8 tygodni) w klatce, aby uzyskać średnią wagę i załaduj strzykawki dawką 15 μl/g ketaminy/ksylazyny. Wstrzyknij wszystkie myszy do klatki.
- Po tym, jak myszy staną się ospałe, ogol ich lewą stronę od biodra do ramienia, między środkiem pleców a brzuchem, za pomocą maszynki do strzyżenia Oster z ostrzem nr 40. Zapisz ich wagę i uderz ich w uszy, aby ponumerować.
- Wstrzyknąć 0,3 ml karprofenu podskórnie w ramię.
- Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Jeśli mysz się wzdrygnie, podawaj izofluran z rurki przez około 12 sekund. Następnie spróbuj ponownie ścisnąć łapę. Podawaj krótkie zastrzyki z izofluranu, aż odruch łapy zniknie. Połóż mysz na prawym boku, skierowaną w lewo.
- Igła do implantu nowotworowego o rozmiarze 16, z okrągłą końcówką spiłowaną jest do wprowadzania tkanki. Wypłucz trochar kilka razy w naczyniu PBS. Trzymając go poziomo z prętem tuż wewnątrz szczytówki. Za pomocą kleszczyków do igieł dodaj kawałek grasicy i zassaj go.
- Osoba pomagająca dodaje 5 μl zimnego Matrigelu do jednej probówki z komórkami (krok 1.3.12) za pomocą pipety wyporowej Eppendorfa i miesza przez delikatne mieszanie. Chirurg trzyma trochar poziomo i powoli odciąga pręt do tyłu, podczas gdy pomocnik pipetuje mieszankę Matrigel do trocharu. Mieszanka żeluje w temperaturze pokojowej.
- Przetrzyj gołą skórę za pomocą Betadine. Następnie zetrzyj to chusteczką izopropanolową. Powtórzyć.
- Zlokalizuj śledzionę pod skórą. To najciemniejsze miejsce. Nerka myszy znajduje się około 5 mm grzbietowo do śledziony, co można zobaczyć przez ogoloną skórę.
- Podnieś skórę w tym miejscu kleszczami i wykonaj nacięcie równoległe do śledziony o długości około 15 mm. Wykonaj podobne cięcie w warstwie mięśni otrzewnej poniżej. U mężczyzn nerka powinna być bezpośrednio widoczna i wystarczy ścisnąć brzuch, aby ją wysunąć. U kobiet może być konieczne podniesienie jajnika za pomocą hemostatu i przeciągnięcie nerki. Może to pomóc w utrzymaniu nerki poza ciałem. W przypadku mężczyzn będziesz musiał wywierać pewien nacisk na brzuch lewą ręką, aby nerka była odsłonięta.
- Zerwij mały otwór w tylnym końcu torebki nerkowej. Może trochę krwawić.
- Wsuń trochar do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór trochar zostanie całkowicie pokryty przez torebkę nerkową. Następnie małym palcem prawej ręki wstrzyknij tkankę.
- Delikatnie wepchnij nerkę z powrotem za pomocą zamkniętego hemostatu. Umieść jeden szew w otrzewnej zawiązany podwójnym znakiem. Ściśnij skórę jak torebkę i włóż dwa klipsy do nawijania.
- Umieść kroplę PBS na każdym oku i połóż mysz na boku na ściółce klatki. Upewnij się, że wszystkie myszy wróciły do leżenia na brzuchu przed ich opuszczeniem.
- Następnego dnia daj każdej myszy kolejny zastrzyk karprofenu.
3. Wtórne przeszczepienie
Celem tego kroku w generowaniu myszy BLT jest zapełnienie szpiku kostnego ludzkimi krwiotwórczymi komórkami macierzystymi. Przeszczepiony implant po zabiegu (2) nie jest wystarczający do wsparcia pełnej rekonstytucji ludzkiego układu odpornościowego u tych myszy. Podczas wtórnego przeszczepu podletalnie napromieniamy myszy w celu zubożenia mysich komórek szpiku kostnego, tworząc w ten sposób "przestrzeń" do implantacji ludzkich komórek CD34 +.
- Cztery do sześciu tygodni później napromienij myszy 2,7 Gy. Myszom wstrzykuje się tego samego dnia komórki transdukowane częścią A CD34 +. Ramy czasowe opierają się na założeniu i wzroście implantu thy/liv przeszczepionego w kroku 2. Zazwyczaj w tym czasie implant znacznie urósł, co pozwala nam przejść do kolejnych kroków.
- Rozmrozić transdukowane komórki CD34+ w części A, przemyć i zawiesić w pożywce do stężenia 5x106/ml.
- Załaduj strzykawki insulinowe o pojemności 0,5 ml x 28 g z 0,1 ml komórek (105 do 5 x 105 komórek na 0,1 ml na mysz) dla jednej klatki myszy (każda klatka zawiera maksymalnie 5 myszy) i połóż je na stojaku skierowanym do tyłu.
- Znieczul mysz rurką izofluranową, potrząsając nią i przytrzymując nos w rurkach przez około 20 sekund. Policz, aby śledzić czas.
- Następnie skieruj go w prawo i mocno pociągnij skórę wokół szyi kciukiem i palcem wskazującym lewej ręki. Naciśnij pod jego szczęką trzecim szukaczem, aby jego prawe oko wybrzuszyło się. Trzymając strzykawkę równolegle do długiej osi głowy myszy, wsunąć igłę za oko i delikatnie przesuwać ją, aż się zatrzyma. Nie naciskaj dalej, ale wstrzyknij ładunek przez około 2 sekundy.
- Dwa do trzech miesięcy później myszy są wykrwawiane zadoczodołowo za pomocą szklanych pipet pokrytych EDTA. Na jedną mysz można pobrać maksymalnie 200 μl krwi miesięcznie. Do analizy FACS powinno wystarczyć 50-100 μl krwi. Alternatywne strategie krwawienia obejmują krwawienia z żył twarzowych i krwawienia z żył ogonowych. To ostatnie da ci bardzo małe objętości krwi, które mogą nie być wystarczające do wielu testów.
- Próbki krwi są barwione pod kątem ekspresji ludzkiego markera limfocytów CD45 w celu oceny rekonstytucji. Próbki krwi dodaje się do 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (160 mM NH4Cl, 100 mM KHCO3, 0,01 mM EDTA) i inkubuje przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj komórki w buforze do lizy, 5 minut przy 1,200 obr./min i powtórz w razie potrzeby.
- Odwirować komórki jak w ppkt 3.8 i przepłukać w PBS uzupełnionym 3% płodową surowicą cielęcą (FACS-PBS).
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 100 μl FACS-PBS.
- Dodaj przeciwciała, aby ocenić rekonstytucję ludzkich limfocytów. Zazwyczaj uwzględniamy następujące CD45 (ludzki marker limfocytów), CD8, CD4, CD14 i CD16 dla makrofagów i monocytów, CD19 dla komórek B i CD56 dla komórek NK.
- Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
- Umyj jak w kroku 3.9 i ponownie zawieś komórki w 2% paraformaldehydzie do analizy FACS.
- Jeśli myszy zostaną odtworzone, przystępujemy do iniekcji guza. Poziomy rekonstytucji ludzkich limfocytów są różne, od mniej niż 1% do 40% wszystkich komórek krwi. Poziomy i typy linii limfocytów są porównywalne do tego, czego można oczekiwać od zdrowych ludzkich dawców krwi. Należy jednak spodziewać się wahań liczby linii komórek innych niż T. Jeśli liczby nie są akceptowalne w ciągu 12 tygodni, można powtórzyć procedurę przeszczepu wtórnego od kroku 3.1.
- Linie komórek nowotworowych są hodowane zgodnie z zaleceniami producenta lub laboratorium. Komórki są zbierane, myte i ponownie zawieszane w matriżelu w stosunku 1:1 (50 μl komórek/50 μl matrigelu). Próbki są przez cały czas przechowywane na lodzie.
- Myszy są znieczulane i golone w miejscu wstrzyknięcia. Obszar jest sterylizowany za pomocą podkładki izopropanolowej. Pomocnik ładuje zawiesiny komórek do wstępnie schłodzonych strzykawek 23G 1 ml. Komórki nowotworowe wstrzykuje się podskórnie. Leczyć miejsce wstrzyknięcia maścią z antybiotykiem. Guzy powinny się ustalić i zacząć rosnąć w ciągu 4 tygodni.
B. Pozytonowa tomografia emisyjna in vivo (PET)
W naszych badaniach badamy wychwyt glukozy ([18F]-fluorodeoksyglukoza ([18F]FDG), dlatego myszy są poszczone 4-6 godzin przed obrazowaniem. Skany MicroPET/CT wykonywane są za pomocą skanera microPET Inveon (Siemens Preclinical Solutions) oraz tomografu komputerowego MicroCATII (Siemens PreclinicalSolutions). Analiza obrazu odbywa się za pomocą oprogramowania OsiriX (Pixmeo, Szwajcaria). Celem jest zmierzenie aktywności metabolicznej guza i ostatecznie wykorzystanie obrazowania PET jako alternatywy dla fizycznego pomiaru regresji guza. Jak widać na rycinie 2, napotkaliśmy guzy, które na podstawie wyglądu fizycznego i wielkości nie są celowane, ale obrazowanie PET na żywo ujawniło rozległą martwicę tkanek. Ta metodologia może służyć jako bardziej czuły i dokładny wskaźnik regresji guza.
- Wyznacz jedną komorę do znieczulania (2% izofluoranu) myszy i jedną komorę jako 60-minutowy wychwyt FDG przed skanowaniem PET ("komora oczekiwania"). Umieść niebieskie podkładki w obu komorach.
- Ponieważ zwierzęta są znieczulane przez długi czas, należy je utrzymywać w cieple w temperaturze 30 °C za pomocą rękawiczek wypełnionych wodą, które są podgrzewane w kuchence mikrofalowej i umieszczania klatek na poduszkach grzewczych.
- Włączyć przepływ izofluranu dla tej komory. Pozwól izofluranowi wypełnić komorę znieczulającą przez około 5-10 minut przed umieszczeniem myszy w komorze. Upewnij się, że pokrywka jest zablokowana i szczelnie zamknięta, aby uniknąć wycieku izofluranu.
- Umieść pierwszą mysz w komorze znieczulającej i szczelnie zablokuj pokrywę. Odczekaj 5-10 minut lub do momentu, gdy mysz straci przytomność.
- Wyjmij mysz z komory znieczulającej, oznacz ogon myszy (inny kolor dla każdej klatki) i wstrzyknij dootrzewnowo myszy za pomocą [18F]FDG (80 μCi). Zanotuj czas wstrzyknięcia myszy. Mysz zostanie ponownie znieczulona po 50 minutach od tego momentu, co pozwoli na 10 minut na przygotowanie się do skanowania PET (w sumie 60 minut [18F] wychwytu FDG przed skanowaniem PET).
- Umieść wstrzykniętą mysz w komorze oczekiwania, pozwalając [18F]FDG na wychwyt przez 1 godzinę przed skanowaniem PET. Nie blokuj pokrywy. Pozostaw pokrywę luźną, aby umożliwić przepływ powietrza.
- Natychmiast umieść następną mysz do wstrzyknięcia FDG w komorze anestezjologicznej. Kolejne wstrzyknięcia myszom powinny być oddalone od siebie o 10 minut, ponieważ proces skanowania PET trwa 10 minut. Natychmiast po zeskanowaniu jednej myszy, 60-minutowy pobór FDG dla następnej myszy do zeskanowania będzie gotowy dokładnie w odstępie 10 minut.
- Kontynuuj znieczulanie i wstrzykiwanie myszy, jak podano w krokach 7-9.
- Po upływie 50 minut od pierwszego wstrzyknięcia u myszy należy ponownie umieścić pierwszą wstrzykniętą mysz w komorze znieczulającej (kontynuując znieczulanie i wstrzykiwanie myszy).
- Podłącz łóżko myszy do przewodów tlenu i izofluranu i włącz przepływ izofluranu w łóżku. Połóż niebieską podkładkę na łóżku.
- Umieść mysz gotową do skanowania PET na łóżku, rozciągając ręce i nogi i utrzymując tę pozycję taśmą. Nałóż lubrykant na oczy. Ten krok jest najważniejszy, ponieważ ułożenie zwierzęcia może mieć wpływ na jakość obrazowania.
- Odłącz przewody izofluranu i tlenu i szybko zamontuj łóżko na maszynie skanującej PET. Umieścić przewody izofluranu i tlenu. Upewnij się, że przepływ izofluranu jest włączony w urządzeniu skanującym PET. Podłącz skanujący PET i rozpocznij skanowanie.
- Po zakończeniu skanowania PET przenieś zwierzę do tomografu komputerowego. Po tym skanowaniu przenieś zwierzę do odpowiedniej klatki.