Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje regularną opiekę i konserwację laboratorium danio pręgowanych. Danio pręgowane zyskują obecnie na popularności w badaniach genetycznych, farmakologicznych i behawioralnych. Jako kręgowce, danio pręgowane wykazują znaczne podobieństwo sekwencji genetycznych do ludzi i są wykorzystywane jako model zwierzęcy dla różnych stanów chorobowych człowieka. Przewagi danio pręgowanych w porównaniu z innymi powszechnymi modelami kręgowców obejmują wysoką płodność, niskie koszty utrzymania, przezroczyste embriony oraz szybki rozwój. W związku ze wzrostem zainteresowania badaniami nad tym gatunkiem, rośnie również potrzeba tworzenia i utrzymywania wydajnych zapleczy do ich hodowli. Mimo dostępności literatury dotyczącej prowadzenia laboratorium danio pręgowanych, brakuje zwięzłego protokołu w formie wideo. Niniejszy film ilustruje protokół regularnego utrzymania, karmienia, rozrodu i hodowli larw danio pręgowanych. Proces ten pomoże badaczom zrozumieć naturalne zachowanie i optymalne warunki hodowli danio pręgowanych, a tym samym rozwiązywać problemy eksperymentalne wynikające z warunków utrzymania ryb. Protokół ten będzie niezwykle pomocny dla badaczy planujących założenie laboratorium danio pręgowanych, a także dla studentów studiów drugiego stopnia zamierzających wykorzystać danio pręgowane jako model zwierzęcy.

Protokół

1. Konserwacja systemu

1. Danio pręgowane są utrzymywane w systemie cyrkulacyjnym, który stale filtruje i napowietrza wodę w systemie, aby zachować jakość wody niezbędną dla zdrowego środowiska wodnego. System cyrkulacyjny pomaga również filtrować nadmiar pokarmu i odchody ryb. Różne firmy oferują systemy dla danio pręgowanych, lecz w naszym laboratorium korzystamy z systemów firmy Aquatic Habitats, USA. Temperatura w pomieszczeniu lub w zbiornikach jest zazwyczaj utrzymywana w zakresie 26-28.5 °C, a warunki oświetleniowe wynoszą 14:10 h (światło: ciemność). System dla danio pręgowanych od Aquatic Habitats (np. system nablatowy) kosztuje ok. 9 000 USD. Ten system nablatowy z dwiema półkami może pomieścić na każdej półce sześć zbiorników o pojemności 10 litrów, dwanaście zbiorników o pojemności 3 litrów lub dwadzieścia zbiorników o pojemności 1.5 litra. W tym samym systemie mogą być również utrzymywane wiele linii ryb (np. transgeniczne, mutanty, typ dziki).
2. W systemie stosowany jest zestaw różnych rodzajów filtrów. W naszym systemie woda ze wszystkich zbiorników przechodzi przez wkład filtrujący 120 µm, filtr kanistrowy 50 µm, filtr biologiczny, filtr absorpcyjny z węglem aktywnym oraz filtr do dezynfekcji UV, zanim zostanie ponownie wpompowana do zbiornika. W systemie dla danio pręgowanych stosuje się wodę odchlorowaną/odstaną. Wodę można odchlorować poprzez odstawienie jej na co najmniej 48 h. W idealnych warunkach woda powinna być przechowywana w zbiorniku z pompą cyrkulacyjną, aby utrzymać jej ciepłotę i przyspieszyć proces odchlorowania.
3. Wartość pH wody w systemie należy sprawdzać codziennie i utrzymywać w zakresie od 6.8 do 7.5. W razie potrzeby do podniesienia pH należy użyć wodorowęglanu sodu.
4. Zbiorniki z rybami należy regularnie czyścić. Aby wyczyścić zbiornik, należy zamknąć dopływ wody do tego zbiornika, spuścić nadmiar wody poprzez przechylenie zbiornika do tyłu i ostrożnie wyjąć go z systemu. Brud i narosty glonów będą widoczne na dnie i ściankach zbiornika.
5. Należy umieścić przegrodę w czystym zbiorniku i napełnić go wodą odchlorowaną (zwaną wodą systemową). Ryby należy ostrożnie przenieść do tego zbiornika za pomocą siatki. Następnie należy zamknąć pokrywę i przenieść etykietę z nazwą zbiornika. Czysty zbiornik należy ostrożnie umieścić w systemie i włączyć dopływ wody.
6. Aby zdekontaminować siatkę, należy spryskać ją 70% etanolem, wypłukać wodą i pozostawić do wyschnięcia przed ponownym użyciem. Należy wyjąć przegrodę z brudnego zbiornika i spryskać obie części 70% etanolem. Następnie należy je dokładnie wypłukać wodą z kranu i pozwolić zbiornikowi oraz przegrodzie całkowicie wyschnąć przed ponownym użyciem.
7. Filtry w systemie cyrkulacyjnym muszą być regularnie sprawdzane i wymieniane, aby zapewnić ich prawidłowe działanie. Filtry te należy wymieniać systematycznie, aby zapewnić odpowiednią i czystą dostawę wody do wszystkich zbiorników z rybami.
8. Wkład filtrujący 120 µm jest zazwyczaj codziennie przepozycjonowany lub wymieniany; należy go przesuwać zgodnie z kierunkiem przepływu wody, aby wykorzystać go w pełni przed wymianą na nowy.
9. Filtr kanistrowy należy wymieniać co tydzień. Aby wymienić filtr kanistrowy, należy wyjąć moduł filtra, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara za pomocą klucza lub dłoni. Pod spodem należy położyć arkusz plastiku lub ręcznik, aby zapobiec lub wchłonąć wyciek wody. Należy zastąpić filtr kanistrowy nowym i zamontować moduł filtra z powrotem w systemie, ostrożnie dokręcając go dłońmi, a w razie potrzeby kluczem.
10. Filtr węglowy należy wymieniać co dwa tygodnie. Aby wymienić filtr węglowy, należy ostrożnie wykręcić moduł filtra węglowego kluczem. Zużyty węgiel aktywny należy usunąć i zastąpić nowym węglem aktywnym. Należy ponownie zamontować uchwyt węglowy i umieścić go w module filtra. Moduł filtra należy zamontować z powrotem w systemie. Należy włączyć system i sprawdzić, czy woda przepływa do filtra. W razie potrzeby należy przepłukać rury wodą, aby usunąć z nich zanieczyszczenia przed zamontowaniem filtra w systemie.
11. Filtr biologiczny należy czyścić co sześć miesięcy. Filtr biologiczny znajduje się zazwyczaj między filtrem kanistrowym a węglowym w systemie cyrkulacyjnym. Aby wymienić filtr biologiczny, należy wyjąć moduł filtra z systemu. Należy zwolnić ciśnienie z filtra, naciskając przycisk spustowy. Filtr należy odkręcić kluczem. Na tym etapie zazwyczaj potrzebne są dwie osoby. Należy zdjąć pokrywę modułu filtra. Zawartość filtra należy opróżnić do naczynia z sitem, aby oddzielić siporax od wody. Uwaga: Siporax to materiał do biofiltracji o drobnych porach, który posiada zdolność do przeprowadzania zarówno nitryfikacji, jak i denitryfikacji.
12. Jeśli siporax jest bardzo brudny, należy go wymienić na nowy. Moduł filtra należy napełnić wodą systemową (wodą odchlorowaną), zamknąć pokrywę, zwrócić moduł filtra do systemu i włączyć dopływ wody. Uwaga: W aklimatyzowanym akwarium siporax będzie siedliskiem dla wielu bakterii nitryfikacyjnych. Mikroorganizmy te są kluczowe dla utrzymania cyklu azotowego w akwarium, a usunięcie głównego nośnika filtra biologicznego (brudnego siporaxu) może doprowadzić do gwałtownego wzrostu poziomu amoniaku, a następnie azotynów, podczas gdy nowy filtr biologiczny (z nowym siporaxem) będzie się ponownie zasiedlać. Oba te stany pośrednie cyklu azotowego mogą być toksyczne dla organizmów wodnych i mogą zabić danio pręgowane, jeśli nie zostaną odpowiednio zniwelowane. Dlatego ważne jest posiadanie wtórnego filtra biologicznego w innym miejscu systemu utrzymania danio pręgowanych (np. w zbiorniku zbiorczym w systemie Aquatic Habitats), aby umożliwić szybką repopulację tych ważnych mikroorganizmów na nowym siporaxie.
13. Filtry UV są stosowane do kontrolowania biologicznych zanieczyszczeń systemu (takich jak bakterie) i powinny być wymieniane co dziewięć-dziesięć miesięcy. Należy zauważyć, że dawka dezynfekcyjna filtra UV wynosi ~110 mJ/cm² na początku życia lampy, a dawka ta zmniejsza się z upływem czasu, dlatego konieczna jest wymiana żarówki, nawet jeśli wydaje się ona nadal funkcjonalna.

2. Karmienie

1. Danio pręgowane mogą być karmione pokarmem suchym (rozmiar pokarmu od 100 µm dla larw do 300/400 µm dla dorosłych ryb) lub pokarmem żywym (solniczkami). Jaja solniczek (Artemia sp.) są dostępne w lokalnych sklepach zoologicznych i mogą być wylęgane w laboratorium zgodnie z prostymi krokami opisanymi poniżej.
   1. Rozpuścić czerwoną sól morską w odstanej wodzie, umieszczając zlewkę z solą na mieszadle magnetycznym w celu lepszego rozpuszczenia. Alternatywnie sól można rozpuścić w wodzie poprzez napowietrzanie rurką napowietrzającą. Jeśli czerwona sól morska jest niedostępna, jako roztwór do wylęgu można zastosować sól Instant Ocean. Solniczki tolerują szeroki zakres zasolenia; jednak nasze solniczki (10-15 g) wylęgamy w wodzie z czerwonej soli morskiej o stężeniu 30-35 g/L. Uwaga: W przypadku braku łatwo dostępnych jaj solniczek w lokalnych sklepach zoologicznych można użyć solniczków kapsułkowanych po ich uprzednim „odkapsułkowaniu” partiami przed dodaniem do inkubatora. Może to również pozwolić uniknąć częstych wizyt w sklepie zoologicznym.
   2. Napełnić inkubator solniczek wodą zasoloną i dodać jaja solniczek w stężeniu 1,2 łyżki stołowej/litr. Intensywnie napowietrzać inkubator za pomocą pompy powietrznej i pozostawić jaja solniczek do wylęgu na ok. 48 hr.
      Uwaga: Należy zauważyć, że niewzbogacone solniczki tracą wartość odżywczą z każdą godziną po wylęgu. Dlatego w celu uzyskania maksymalnej wartości odżywczej z solniczek może być odpowiednie wylęganie przez 24 hr lub wzbogacanie przez 48 hr.
   3. Woda odpadowa z systemu wylęgu jest dodawana do odpadów z kwarantanny, aby zostać zdezynfekowana wybielaczem i później zutylizowana.
2. Aby zebrać solniczki, należy odłączyć rurkę powietrzną i pozwolić kulturze opaść przez 4-5 min, ale nie dłużej niż 10 min. Wylęgłe solniczki gromadzą się na dnie inkubatora.
   1. Zebrać solniczki za pomocą kranu na dnie inkubatora. Odrzucić początkowy przepływ, który składa się z niewylęgłych jaj solniczek.
   2. Po odrzuceniu niewylęgłych solniczek, zebrać wylęgłe solniczki, które posłużą jako pokarm dla danio pręgowanych.
   3. Oddzielić solniczki od słonej wody, używając sieci do zbierania solniczek (nylonowa siatka o oczkach ok. 350 µm). Wypłukać solniczki z sieci do pojemnika, używając wody systemowej.
3. Zebrane solniczki występują zazwyczaj w wysokim stężeniu na dnie pojemnika, co nadaje mu pomarańczowy kolor.
4. Podawać solniczki danio pręgowanym za pomocą pipety lub zakraplacza/butelki wyciskanej. Ilość podawanego pokarmu zależy od liczebności populacji w poszczególnych zbiornikach. Powszechnie przyjęta dawka dla danio pręgowanych to 4% masy ciała w pokarmie na dobę. Nie należy przekarmiać danio pręgowanych, ponieważ może to zwiększyć poziom azotanów w wodzie, co potencjalnie wpływa na ich rozród lub żywotność, a niektóre ryby mogą paść w wyniku przejedzenia.
   1. Po wstrzyknięciu pokarmu do wody, głodne ryby podpływają, aby schwytać solniczki.
5. Karmienie suchym pokarmem może być wykonywane przy użyciu prostego dozownika pokarmu dla ryb na sprężynę firmy Aquatic Eco-System/Aquatic Habitats. Alternatywnie, karmienie suche można przeprowadzić za pomocą zwykłej łyżeczki lub przecinając plastikowy zakraplacz przekątnie nożyczkami, aby nadać mu kształt małej łyżeczki.

3. Rozmnażanie

1. Danio prążkowane rozpoczynają tarło wraz z pojawieniem się światła. Zapłodnione jaja można pozyskać albo poprzez tarło w zbiorniku, albo poprzez dobieranie par. Choć tarło w zbiorniku jest bardziej wydajne pod względem pracy i jest stosowane do regularnego zbierania embrionów w naszym laboratorium, dobieranie par jest preferowane w przypadku konieczności przesiewania genów lub mutacji u poszczególnych ryb.
2. W przypadku tarła w zbiorniku, należy złożyć urządzenie do tarła i powoli opuścić je do akwarium po pojawieniu się światła. Alternatywnie, zestaw do tarła można pozostawić w akwarium na noc.
3. Urządzenie do tarła pozostawia się przez około 15 min, aby umożliwić rybom kopulację, przed wyjęciem urządzenia ze zbiornika i zebraniem jaj.
4. Dobieranie par zazwyczaj przygotowuje się późnym popołudniem, po karmieniu.
5. Złożyć zbiornik do tarła i napełnić go odstaną wodą systemową.
6. Przenieść jedną samicę i jednego samca na przeciwległe strony zbiornika do tarła. Samice można odróżnić od samców po większym brzuchu. Samce można również odróżnić od samic tym, że są szczuplejsze i mają ciemniejszy kolor. Ponadto samce wykazują silniejsze żółte zabarwienie płetwy odbytowej w porównaniu do samic (patrz Rysunek 1). W razie wątpliwości należy szukać znadmienia u samic danio prążkowanych (patrz Rysunek 4).
7. Usunąć przegrodę następnego ranka, krótko po pojawieniu się światła. Pozwolić na niezakłóconą kopulację przez 20 min lub do momentu, aż na dnie zbiornika zostanie złożona wystarczająca liczba embrionów.
8. Po tarle ryby należy zwrócić do ich zbiorników. Jaja zbiera się za pomocą sitka.
9. Embriony należy dokładnie wypłukać wodą systemową.
10. Przenieść embriony do szalki Petriego, płucząc sitko pożywką do embrionów, znaną jako EM3 (NaCl, 13.7 mM; KCl, 0.54 mM; MgSO₄, 1.0 mM; CaCl₂, 1.3 mM; Na₂HPO₄, 0.025 mM; KH₂PO₄, 0.044 mM; NaHCO₃, 4.2 mM).
11. Embriony można obserwować pod mikroskopem. Następnie jaja zapłodnione oddziela się od niezapłodnionych za pomocą igły i pipety (patrz Rysunek 3).

4. Hodowla larw

1. Zapłodnione jaja utrzymuje się w inkubatorze (~28.5 °C) przez 72 hr aż do wyklucia się larw.
2. Gdy larwy opuszczą chorion i zaczną swobodnie pływać, są gotowe do przeniesienia do głównego zbiornika z rybami. Larwy wymagają karmienia od 5 dni po zapłodnieniu (dpf) i są utrzymywane w medium embrionalnym (skład opisany w części 3, 10) lub wodzie systemowej. Larwy można trzymać w okrągłych naczyniach, wymieniając codziennie ~50% lub więcej zawartej w nich wody. Wymiana wody powinna obejmować usuwanie martwych lub chorych larw oraz wszelkich innych zanieczyszczeń.
3. Przenieś delikatnie larwy do zbiornika zawierającego niewielki sitkowy filtr (o rozmiarze około 300-400 µm). Martwe i chore larwy należy usuwać, a codziennie powoli dolewać kilka mililitrów wody.
4. Po 14 dniach zbiorniki z larwami można umieścić w systemie i zasilić niewielkim strumieniem wody cyrkulującej (1-2 krople na sekundę). Wraz ze wzrostem larw można zwiększać przepływ wody. W zależności od wielkości larw można stosować filtry o różnych rozmiarach oczek (np. 300-400, 500, 700-750 i 1000 µm), a dla dorosłych ryb należy stosować standardowy plastikowy filtr.
5. Rozwój embrionów do stadium płciowo dojrzałych osobników trwa zazwyczaj 3 miesiące.

Wyniki

Utrzymanie i hodowla danio pręgowanych jest łatwiejsze i tańsze niż w przypadku tradycyjnych modeli gryzoni. W niewielnym laboratorium można zmieścić kilka tysięcy osobników danio pręgowanych. Dzięki temu protokołowi badacze będą w stanie zarządzać zapleczem hodowlanym, zapewniając danio pręgowanym zdrowe warunki bytowania. Ponadto poniższe ilustracje pomogą w identyfikacji zapłodnionych jaj, dorosłych osobników oraz ich pokarmu. Przedstawiono ilustrację samca (Rysunek 1A) oraz samicy (Rysunek 1B i 1C) danio pręgowanych, aby pomóc badaczom w rozróżnianiu płci w celach hodowlanych. Rysunek 2 przedstawia widok mikroskopowy: artemii przy powiększeniu 12X (Rysunek 2A), pojedynczej artemii przy powiększeniu 90X (Rysunek 2B) oraz niezapłodnionego jaja artemii przy powiększeniu 90X (Rysunek 2C). Pomoże to w zrozumieniu różnicy między niezapłodnionymi a zapłodnionymi artemiami w celu zapewnienia prawidłowego karmienia. Jaja zapłodnione i niezapłodnione pokazano na Rysunku 3. Rysunek 3A ilustruje mikroskopowy widok zapłodnionych i niezapłodnionych embrionów. Embriony niezapłodnione są zazwyczaj nieprzezroczyste i/lub mają pęknięte komórki wewnątrz chorionu (czarna strzałka), podczas gdy embriony zapłodnione wydają się nienaruszone i rozwijają się do kolejnego etapu podziału komórkowego (szczegółowe informacje na temat różnych stadiów embrionów danio pręgowanych znajdują się w materiale ¹). Widok przy większym powiększeniu jaja zapłodnionego i niezapłodnionego pokazano odpowiednio na Rysunku 3B i 3C. Rysunek 4 ilustruje ovipozytor samicy danio pręgowanych, co ma pomóc badaczom w rozróżnieniu samca od samicy.

Do kilku krytycznych problemów, które mogą wystąpić w laboratorium rybek danio-zebry, należą: zablokowanie dopływu wody do poszczególnych lub wszystkich zbiorników w systemie hodowlanym, słaba jakość wody oraz wycieki w rurach lub zbiorniku systemu cyrkulacyjnego. Ponadto problemem może być trudność w pozyskiwaniu zarodków z hodowli. Rozwiązywanie tych problemów omówiono poniżej.

Rycina 1. Ilustracja samca danio pręgowanego (A) oraz samicy danio pręgowanego (B, C).

Rysunek 2. Widok mikroskopowy solniczków przy powiększeniu 12X (A), pojedynczy solniczek przy powiększeniu 90X (B) oraz niezapłodnione jajo solniczka przy powiększeniu 90X (C).

Rycina 3. Widok mikroskopowy (16X) zapłodnionych i niezapłodnionych jaj, z których tylko dwa są niezapłodnione; jaja niezapłodnione zaznaczono czarnymi strzałkami (A). Widok przy większym powiększeniu (90X) jaja zapłodnionego (B) oraz jaja niezapłodnionego (C).

Rycina 4. Ilustracja wykluwacza samicy rybki zebrafish (wskazanego czarną strzałką).

Parametr	Zakres optymalny
Alkaliczność	50-150 mg/L CaCO33
pH	6,8-7,5 (tolerancja 6,0-8,5)
Temperatura	26-28.5 °C
Twardość	50–100 mg/L CaCO₃3
Amoniak niezjonizowany	<0,02 mg/L
Azotan (NO₃⁻)3-)	<50 mg/L
Azotyny (NO2-)2-)	<0,1 mg/L
Tlen rozpuszczony	>6,0 mg/L
Zasolenie	0,5-1 g/L
Przewodność	300 -1,500 μS

Tabela 2. Parametry jakości wody. Parametry jakości wody. Optymalny zakres parametrów środowiskowych w akwarium dla danio pręgowanego¹¹.

Dyskusja

Danio pręgowany pochodzi z rzeki Ganges w północnych Indiach i staje się popularnym obiektem badań zarówno w stadium dorosłym, jak i larwalnym², co omówiono w przeglądzie Spence et al.³. Danio pręgowany posiada szereg zalet w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, takich jak wysoka płodność, łatwość utrzymania, przejrzystość optyczna embrionów, szybki rozwój embrionalny oraz niskie koszty utrzymania. Są one podatne na manipulacje genetyczne⁶ i odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu leków^4,5. Zapłodnienie u tych ryb odbywa się zewnętrznie, co jest korzystne z punktu widzenia biologów rozwoju. Ze względu na te sprzyjające cechy, danio pręgowany zyskuje na popularności w badaniach genetycznych⁷, farmakologicznych⁸ i behawioralnych^9,10. Utrzymanie zaplecza dla danio pręgowanego oraz hodowla w celu pozyskania embrionów wiążą się z wieloma wyzwaniami. W niniejszej pracy opisujemy nasze doświadczenia i zalecenia w rozwiązywaniu tych problemów oraz przedstawiamy protokół konserwacji systemu, karmienia, rozrodu i hodowli larw.

Konserwacja systemu

Aby utrzymać rybki danio w dobrym stanie zdrowotnym, ważne jest zapewnienie im czystego środowiska w prawidłowo funkcjonującym systemie akwariowym. Istotną częścią tych działań jest regularna wymiana filtrów systemowych, aby wszystkie zbiorniki otrzymywały odpowiedni przepływ i czystą wodę. Niezbędne jest uniknięcie awarii obiegu wody do każdego zbiornika spowodowanej zablokowaniem rur systemowych. W przypadku wystąpienia zatoru rury można wyczyścić, stosując wyższe niż zwykle ciśnienie i przepływ wody. Idealnie około 10% wody w systemie powinno być wymieniane codziennie w celu utrzymania dobrej jakości wody. Alternatywnie wodę można wymieniać podczas wymiany filtra kubełkowego lub filtra węglowego. Zapewnia to usunięcie zanieczyszczeń osadzonych w rurach łączących te filtry. Jakość wody należy sprawdzać regularnie. Parametry takie jak zasadowość, pH, temperatura, twardość, zawartość amoniaku, tlen rozpuszczony, zasolenie i przewodność powinny być traktowane jako istotne czynniki odzwierciedlające jakość wody w systemie (szczegóły w Tabeli 2). Przynajmniej poziom azotanów, pH i temperatura powinny być monitorowane regularnie, aby zapewnić dobrą jakość wody do hodowli rybek danio. Idealne poziomy azotanów (NO^3-) wynoszą <50 mg/L¹¹; w przypadku wysokich wartości poziomy te można obniżyć, zastępując wodę w obiegu świeżą wodą systemową. Czasami filtry nie przylegają szczelnie i przeciekają, dlatego zaleca się sprawdzenie szczelności po każdej wymianie filtra. Jeśli przepływ wody z głównego zbiornika zostanie zablokowany po wymianie pompy wodnej lub wymianie filtra, przepływ można przywrócić, poluzowując lub wyjmując filtr na kilka sekund, aby rozproszyć podciśnienie powstające w rurach. Czas wymagany na wymianę filtrów może się różnić w zależności od wielu czynników, takich jak całkowite obciążenie biologiczne systemu, czystość innych filtrów oraz ilość zanieczyszczeń osadzonych w rurach. W związku z tym filtry należy wymienić natychmiast, jeśli wydają się brudne lub jeśli wszystkie zbiorniki nie otrzymują prawidłowej dostawy wody. Zaleca się również, aby siatkę do ryb czyścić 70% etanolem, płukać w wodzie w celu dekontaminacji i pozostawić do wyschnięcia przed ponownym użyciem. Suszenie zapewnia odparowanie etanolu, który w przeciwnym razie jest toksyczny dla ryb.

Większość systemów dla danio pręgowanych wykorzystuje odchlorowaną wodę z kranu, jednak niektóre systemy wykorzystują wodę dejonizowaną. Ważne jest, aby utrzymywać przewodność wody w systemie w przedziale od 300 do ~1,500 μS, ponieważ zmniejsza to nakład energii potrzebny rybom do utrzymania równowagi soli w organizmie. W związku z tym danio pręgowanych nie można utrzymywać w wodzie dejonizowanej, chyba że dodano do niej sole w celu utrzymania optymalnego poziomu przewodności. W przypadku stosowania wody z kranu istnieje ryzyko wystąpienia wysokich stężeń miedzi w wodzie systemowej, ponieważ filtr węglowy nie usuwa miedzi. Dlatego użytkownicy powinni kontrolować stężenia miedzi i w miarę możliwości unikać stosowania miedzianych rur.

Karmienie

Danio pręgowanych nie należy przekarmiać, ponieważ może to zwiększyć poziom azotanów w wodzie, co potencjalnie wpływa na ich rozród¹¹ lub żywotność, gdyż niektóre ryby mogą zginąć z powodu przejedzenia. Zaleca się podawanie podczas jednego karmienia takiej ilości pokarmu, jaką grupa ryb w zbiorniku jest w stanie spożyć w ciągu 10 min. Bardzo ważne jest usunięcie soli z artemii przed podaniem ich danio pręgowanym, ponieważ nadmierne stężenie soli prowadzi do śmierci. Jeśli wymagana jest większa liczba ikry, ryby można karmić trzy razy dziennie. Codzienne czyszczenie zbiorników z ryb hodowlanych zwiększa również poziom produkcji ikry.

Podczas karmienia ryb w systemach siedlisk wodnych zazwyczaj wyłączamy pompę wody i pompę powietrza na 10 min, aby umożliwić rybom zjedzenie pokarmu. Zmniejsza to ilość pokarmu wypłukiwanego do filtrów. Użytkownicy muszą jednak pamiętać o ponownym włączeniu tych pomp po zakończeniu karmienia.

Hodowla

Danio pręgowane zazwyczaj znajdują się w optymalnej kondycji rozrodczej między 3. a 18. miesiącem życia. Rozrodu par nie należy przeprowadzać przez dwa kolejne dni¹¹; jednak rozród w zbiorniku może być wykonywany codziennie, ponieważ zbiornik może pomieścić wiele ryb, co zmniejsza prawdopodobieństwo rozrodu tej samej pary przez dwa dni z rzędu. Rozród powinien być przeprowadzany w regularnych odstępach czasu, nawet jeśli jaja nie są potrzebne. Proces ten zapewni utrzymanie cyklu rozrodczego ryb. W układzie rozrodczym zaleca się stosowanie większej liczby samic niż samców. Samce danio pręgowanych zmieniają partnerki każdego dnia¹², co dodatkowo uzasadnia tę rekomendację. Co więcej, w naszym laboratorium początkowo wystąpiły problemy z rozmnażaniem, jednak zastosowanie większej liczby samic niż samców w układzie rozrodczym pomogło rozwiązać ten problem. Ponadto produkcję jaj dodatkowo poprawiło: karmienie dietą o wysokiej zawartości białka oraz artemią dwa-trzy razy dziennie, mieszanie ryb z różnych zbiorników (od różnych rodziców), utrzymywanie temperatury w układzie rozrodczym między 27 a 28 °C oraz delikatny masaż brzuchów samic z zablokowanymi jajowodami. Zalecamy prowadzenie rejestru linii/pochodzenia ryb, aby uniknąć chowu wsobnego między rodzeństwem. Pozwala to na dalszą poprawę produkcji embrionów. Zaleca się również prowadzenie ewidencji liczby embrionów złożonych przez ryby z każdego zbiornika. Pomaga to w monitorowaniu zbiorników z najlepszymi rybami hodowlanymi oraz w podejmowaniu działań mających na celu poprawę rozrodu u ryb, które nie składają jaj.

Hodowla larw

Karmienie larw należy rozpocząć od 5 dpf (dni po zapłodnieniu). Młode larwy można karmić pokarmem suchym o rozmiarze ~100 mikronów (np. ZM100) lub pokarmem żywym, takim jak paramecja i wrotki (co stymuluje wzrost). Rozmiar pokarmu można stopniowo zwiększać do 200 mikronów (np. ZM200) lub 300/400 mikronów (np. ZM300). Populacja dorosłych ryb powinna wynosić około 6-7 ryb na litr wody. Praktyka ta jest zalecana w celu lepszego utrzymania BZT (biochemicznego zapotrzebowania na tlen) w zbiornikach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System cyrkulacyjny dla danio-ostrobramowych	Aquatic Habitats, USA	samodzielne, niskoprofilowe systemy AHAB
Węglan sodu	Sigma Aldrich	S6297
Dozownik karmy dla ryb/Podajnik karmy suchej	Aquatic Habitats, USA	AH19
Mikroskop	Olympus	SZX12
Pokarm suchy	Karmidła dla ryb ZM, UK	ZM100, ZM200, ZM300
Jaja solankowca	Salt Creek, Inc., USA	Klasa Premium
Hodowle w zbiornikach	Aquatic Habitats, USA	ITSTS-A
Węgiel aktywny	Penn-Plax Pro-crab, USA	PBC3MF
Zbiorniki do rozmnażania	Aquatic Habitats, USA	SBTANK (1L) Zbiornik dla osobników hodowlanych 2 (2 l)
Sól morska Red Sea	Sól morska Red Sea, USA	Lokalny sklep zoologiczny/ www.redseafish.com
Filtry (zewnętrzne, wkłady filtracyjne i UV)	Aquatic Habitats, USA	aquatichabitats.com
Podłoże Siporax	Aquatic Habitats, USA	BF 820
Siatka do solnych krewetek	Aquatic Habitats, USA	BSN 1
Inkubator do wylęgu solankowców	Aquatic Habitats, USA	BS252
Przegrody	Aquatic Habitats, USA	aquatichabitats.com
Tabela 1. Tabela specyficznych odczynników i sprzętu użytych w tym protokole.