Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Podsumowanie

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Streszczenie

Glejaki są jedną z najbardziej śmiertelnych postaci nowotworów u ludzi. Do dziś najskuteczniejsza terapia glejaków – operacja, po której następuje radioterapia – oferuje pacjentom jedynie niewielkie korzyści, ponieważ większość z nich nie przeżywa więcej niż pięć lat od momentu diagnozy z powodu nawrotu nowotworu ^1,2. Odkrycie nowotworowych komórek macierzystych w guzach mózgu u ludzi daje nadzieję na ogromny wpływ na opracowanie nowych strategii terapeutycznych w leczeniu glejaków ³. Nowotworowe komórki macierzyste definiuje ich zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i do różnicowania się; uważa się, że są one jedynymi komórkami w guzie zdolnymi do inicjacji nowych nowotworów ⁴. Przypuszcza się, że nawrotu glejaka po radioterapii wynika z oporności komórek macierzystych glejaka (GSCs) na terapię ^5-10. Wykazano, że in vivo GSCs bytują w niszy naczyniowej, która jest kluczowa dla utrzymania ich cech macierzystych ^11-14. Centralnymi elementami organizacji niszy GSCs są komórki śródbłonka naczyniowego ¹². Istniejące dowody sugerują, że GSCs oraz ich oddziaływanie z komórkami śródbłonka naczyniowego są istotne dla rozwoju guza, co wskazuje na GSCs i ich interakcje z komórkami śródbłonka jako ważne cele terapeutyczne w leczeniu glejaków. Obecność GSCs określa się eksperymentalnie na podstawie ich zdolności do inicjowania nowych guzów po transplantacji ortotopowej ¹⁵. Zazwyczaj osiąga się to poprzez wstrzyknięcie określonej liczby komórek GBM wyizolowanych z ludzkich guzów do mózgów myszy z ciężkim niedoborem odporności lub wstrzyknięcie mysich komórek GBM do mózgów myszy gospodarzy kongenicznych. Analizy wzrostu guza przeprowadza się po upływie czasu wystarczającego, aby GSCs spośród wstrzykniętych komórek GBM mogły doprowadzić do powstania nowych guzów – zazwyczaj po kilku tygodniach lub miesiącach. W związku z tym istniejące testy nie pozwalają na badanie istotnego procesu patologicznego, jakim jest inicjacja guza z pojedynczych GSCs in vivo. W rezultacie brakuje kluczowych informacji na temat specyficznych ról GSCs oraz ich oddziaływań z komórkami śródbłonka naczyniowego we wczesnych etapach inicjacji guza. Takie spostrzeżenia są krytyczne dla opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu glejaków i będą miały wielkie znaczenie dla zapobiegania nawrotom glejaków u pacjentów. W niniejszej pracy zaadaptowaliśmy procedurę okna czaszkowego PoRTS ¹⁶ oraz dwufotonową mikroskopię in vivo, aby umożliwić wizualizację inicjacji guza z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy. Nasza technika utoruje drogę do przyszłych starań mających na celu wyjaśnienie kluczowych mechanizmów sygnalizacyjnych między GSCs a komórkami śródbłonka naczyniowego podczas inicjacji glejaka.

Protokół

1. Protokół

1. Mysz poddaje się anestezji ketaminą i ksylazyną w dawce 0,1 mg ketaminy i 0,01 mg ksylazyny na 1 g masy ciała. W celu zapewnienia analgezji przedoperacyjnie podaje się karprofen (0,005 mg na 1 g masy ciała).
2. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym wiertło stomatologiczne, są sterylizowane parą w autoklawie. W przypadku przeprowadzania serii zabiegów, końcówki instrumentów chirurgicznych muszą być resterylizowane za pomocą sterylizatora koralikowego (Fine Science Tools FST 250) przed każdym kolejnym zabiegiem.
3. Gdy mysz osiągnie chirurgiczną płaszczyznę anestezji, ocenianą na podstawie braku reakcji na uciśnięcie palca u stopy, umieszcza się ją na waciku bawełnianym, który następnie kładzie się na podgrzewanej podkładce w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie ~37 °C. Głębokość anestezji jest często monitorowana podczas operacji.
4. Sierść usuwa się z grzbietowej części głowy w obszarze o kształcie zbliżonym do trójkąta, ok. 3 mm za nozdrzami, rozszerzając go ku dołowi w stronę kręgów szyjnych. Na oczy nakłada się maść oftalmologiczną, aby chronić je przed odwodnieniem i podrażnieniem.
5. Mysz ułożono w pozycji brzusznej, a skórę zdezynfekowano jodynem chirurgicznym, 70% etanolem i sterylnymi gazikami. Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuwa się płat skóry o wymiarach 0,8 x 1,0 cm, pokrywający grzbietową stronę kości czołowych i ciemieniowych czaszki.
6. Miejscowo na okostną oraz odsłonięte tkanki na obwodzie rany nakłada się środek przeciwbólowy, 0,5% lidokainę. Okostną usuwa się, delikatnie zeskrobując czaszkę ostrzem skalpela; ułatwi to przyleganie kleju cyjanoakrylowego do kości.
7. Interesujący obszar kory zaznacza się markerem na czaszce. Obszar ten nie powinien znajdować się nad liniami szwów czaszkowych, aby uniknąć uszkodzenia leżących pod nimi dużych naczyń.
8. Cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego nakłada się na brzegi rany, aby zapobiec przesiąkaniu wysięku surowiczo-krwistego, oraz na czaszkę, z wyjątkiem obszaru docelowego.
9. W naszym protokole do uszczelniania czaszki stosowany jest utwardzany światłem cement stomatologiczny. Przed nałożeniem cementu cały odsłonięty obszar czaszki, poza miejscem przeznaczonym do pocienienia, traktuje się primerami, a następnie preparatem wiążącym z zestawu cementu stomatologicznego utwardzanego światłem. Po wyschnięciu preparatu wiążącego nanosi się cement stomatologiczny, aby pokryć czaszkę. W celu stabilizacji głowy myszy podczas kolejnych etapów operacji i obrazowania, w cemencie stomatologicznym, w pewnej odległości od obszaru do pocienienia, osadza się sterylną nakrętkę sześciokątną #00-90. Zastosowanie cementu stomatologicznego utwardzanego światłem pozwala nam przygotować czaszkę bez konieczności pośpiechu przy całym zabiegu. Po zakończeniu przygotowania cementu na czaszce, utwardza się go światłem widzialnym.
10. Po utwardzeniu cementu stomatologicznego, uchwyt głowicy z urządzenia stereotaktycznego montuje się do nakrętki na głowie myszy za pomocą śruby #00-90.
11. Na obszar czaszki przeznaczony do pocienienia nakłada się kroplę sterylnej soli fizjologicznej 0,9% w temperaturze pokojowej. Przy użyciu stereomikroskopu i szybkowirującego mikro-wiertła pocienia się okrągły obszar czaszki (zazwyczaj o średnicy ~4-5 mm) nad regionem zainteresowania. Wiercenie oraz aplikowanie soli fizjologicznej na wiercony obszar wykonuje się przerywanie, aby uniknąć termicznego uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej. Sól fizjologiczna pochłania ciepło i pomaga zmiękczyć kość.
12. Czaszka myszy składa się z dwóch cienkich warstw kości zbitej, pomiędzy którymi znajduje się gruba warstwa kości gąbczastej. Zewnętrzna warstwa kości zbitej oraz większość kości gąbczastej są usuwane za pomocą wiertła.
13. Po usunięciu większości kości gąbczastej, pozostałe w niej pustki są widoczne pod mikroskopem dissectingowym, co wskazuje, że wiercenie zbliża się do wewnętrznej warstwy kości zbitej. Na tym etapie grubość czaszki powinna nadal wynosić więcej niż 50 μm. Pocienianie czaszki należy kontynuować ostrożnie, aby uzyskać bardzo cienki (~20 μm) i gładki preparat.
14. Po uzyskaniu pożądanej grubości czaszki (~20 μm), poleruje się ją najpierw za pomocą specjalnie wykonanego silikonowego wata z pastą diamentową (6-15 μm) przez około 10 min. Polerowanie pastą diamentową służy dwóm celom. Po pierwsze, dodatkowo pocienia czaszkę bez wywierania nacisku na jej cienką warstwę, unikając tym samym przypadkowego uszkodzenia tkanki mózgowej. Po drugie, stanowi wstępny etap polerowania przed użyciem drobnoziarnistego tlenku cyny do dalszego wygładzania.
15. Po polerowaniu pastą diamentową, pocienioną czaszkę poleruje się tlenkiem cyny przez około 10 min. Po polerowaniu tlenek cyny wypłukuje się solą fizjologiczną, aż pocieniona czaszka będzie wyglądać na czystą.
16. Na tym etapie, jeśli okno czaszkowe ma służyć do długoterminowego obrazowania in vivo, oczyszczony obszar cienkiej czaszki należy osuszyć. Nanoszona jest mała kropla przezroczystego kleju cyjanoakrylowego, aby uszczelnić okno czaszkowe. Warstwa kleju cyjanoakrylowego między pocienioną czaszką a szkiełkiem powinna być jak najcieńsza.
17. Jeśli po stworzeniu okna czaszkowego PoRTS ma zostać wykonana iniekcja, na tym etapie używa się igły 26G do wykonania niewielkiego otworu po jednej stronie wypolerowanego okna z cienkiej czaszki. Otwór ten służy do iniekcji komórek GBM.
18. Za pomocą wyciągacza do pipet przygotowuje się sterylną szklaną pipetę z otworem końcowym o średnicy około 50 μm. Pipeta ta zostanie użyta do iniekcji komórek GBM i zostaje zamontowana w mikromanipulatorze. Pipetę ustawia się pod kątem 30 stopni, aby miejsce iniekcji komórek GBM znajdowało się z dala od końcowego miejsca obrazowania. Końcówkę pipety usuwa się pod mikroskopem dissectingowym. Zawiesina komórek GBM jest wprowadzana do pipety od przodu poprzez zasysanie przy użyciu pompy strzykawkowej.
19. Po napełnieniu pipety komórkami GBM, mysz zostaje ponownie umieszczona pod mikroskopem. Pipetę iniekcyjną opuszcza się w stronę niewielkiego otworu w oknie czaszkowym i ostatecznie wprowadza do mózgu przez otwór za pomocą mikromanipulatora. 1 μl zawiesiny komórek GBM wstrzykuje się do mózgu w odległości 100-200 μm od powierzchni mózgu (prędkość: 0,1 μl/min, czas trwania: 10 min).
20. Czaszkę osusza się, nanosi małą kroplę przezroczystego kleju cyjanoakrylowego na osuszoną czaszkę, a do pocienionego i wypolerowanego obszaru przykleja się kawałek szkiełka kryjącego nr 1 o rozmiarze 3 mm. Przestrzeń między szkiełkiem a sąsiednim cementem stomatologicznym uszczelnia się klejem cyjanoakrylowym.
21. Po operacji myszy wstrzykuje się podskórnie 1 ml ciepłej sterylnej soli fizjologicznej i zapewnia się im dodatkowe ogrzewanie w celu utrzymania temperatury ciała do czasu pełnego wybudzenia z anestezji.
22. Do obrazowania myszy poddaje się anestezji ketaminą i ksylazyną w dawce 0,1 mg ketaminy i 0,01 mg ksylazyny na 1 g masy ciała. Myszy są unieruchamiane pod mikroskopem za pomocą specjalnej ramki stereotaktycznej. W przypadku codziennego, powtarzalnego obrazowania in vivo lepszą opcją będzie izofluran, ponieważ przy powtarzalnym stosowaniu ketaminy u myszy mogą pojawić się oznaki uzależnienia.

2. Reprezentatywne wyniki

Pomyślny zabieg chirurgiczny wszczepienia okna czaszkowego PoRTS pozwala na utrzymanie przejrzystości okna przez wiele tygodni lub miesięcy. Rysunek 1 przedstawia układ naczyniowy pod oknem czaszkowym PoRTS, wizualizowany za pomocą światła rozproszonego. Obrazy naczyń krwionośnych posłużyły jako punkty orientacyjne do lokalizacji tych samych obszarów mózgu podczas powtarzalnych badań obrazowych. Aby zwizualizować zarówno komórki śródbłonka naczyniowego, jak i komórki GBM, skrzyżowano myszy B6.Cg-Tg(Tek-cre)1Ywa/J, które znakują komórki śródbłonka naczyniowego, z myszami B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm9(CAG-tdTomato)Hze}/J, otrzymując myszy z komórkami śródbłonka naczyniowego znakowanymi czerwoną białkową fluorescencją tdTomato. Następnie przeprowadzono procedurę kraniotomii PoRTS u tych myszy i wstrzyknięto znakowane GFP komórki GBM do ich mózgów poprzez niewielki otwór z boku okna czaszkowego. W dalszej kolejności wykonano podłużne obrazowanie dwufotonowe in vivo u wstrzykniętych myszy. Długość fali wzbudzenia lasera ustawiono na 910 nm, co pozwoliło na wzbudzenie zarówno GFP, jak i tdTomato. Obrazowanie dwufotonowe przeprowadzono przy użyciu zbudowanego na zamówienie dwufotonowego mikroskopu skanującego z dwoma detektorami, umożliwiającymi jednoczesną detekcję fluorescencji zielonej i czerwonej. Rysunek 2 przedstawia przykład in vivo inicjacji glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w pobliżu naczyń krwionośnych. Okno czaszkowe PoRTS jest również doskonałym wyborem do chronicznego obrazowania in vivo w trybie time-lapse. Rysunek 3 przedstawia barwienie GFAP przekrojów kory mózgowej myszy bez zabiegu PoRTS, myszy 7 dni po zabiegu PoRTS oraz myszy 7 dni po zabiegu PoRTS i wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Z obrazów wynika, że u myszy bez zabiegu oraz u myszy po zabiegu PoRTS nie występuje gliuza, natomiast po wstrzyknięciu soli fizjologicznej w tkance mózgowej myszy obserwuje się gliozę, spowodowaną penetracją pipety i wstrzyknięciem soli fizjologicznej do mózgu. Wynik ten dowodzi, że pod oknem czaszkowym PoRTS nie dochodzi do gliozy, co stanowi niezależną walidację tezy, że opisane tutaj okno czaszkowe PoRTS nie prowadzi do gliozy typowo związanej z chronicznym oknem czaszkowym typu „open skull”. Rysunek 4 przedstawia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości kolców dendrytycznych tej samej myszy w dniu operacji (Dzień 0) oraz 32 dni po utworzeniu okna PoRTS (Dzień 32), co dowodzi, że okno PoRTS jest również doskonałym wyborem do obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości.

Rycina 1. Wizualizacja naczyń krwionośnych pod wypolerowanym i wzmocnionym cienkim oknem czaszkowym z wykorzystaniem światła rozproszonego wstecznie. Dni oznaczają liczbę dni po zabiegu; obrazy były pobierane począwszy od dnia operacji bezpośrednio po zakończeniu iniekcji komórek GBM. Pasek skali: 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Rycina 2. Wizualizacja wstrzykniętych komórek GBM oraz naczyń krwionośnych in vivo. Do wstrzykiwania komórek GBM wykorzystano myszy niosące zarówno Tek-Cre, jak i ROSA26 CAG-tdTomato. Komórki śródbłonka naczyniowego znakowano tdTomato (czerwony), a komórki GBM znakowano GFP (zielony). Obrazy pozyskiwano począwszy od 24 hr po wstrzyknięciu komórek GBM. Wykonano łącznie 10-12 sąsiednich pól widzenia, które zestawiono obok siebie, umieszczając zidentyfikowane wstrzyknięte komórki GBM w centrum całkowitego pola, aby uzyskać końcowe obrazy. Dni oznaczają liczbę dni po operacji. Pasek skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rysunek 3. Gliosis nie występuje po operacji okna czaszkowego PoRTS. Panele górne: Przekrój koronalny mózgu myszy przy mniejszym powiększeniu. Panel lewy: mysz bez operacji okna czaszkowego; w tkance mózgowej nie obserwuje się aktywacji GFAP. Panel środkowy: mysz z oknem czaszkowym PoRTS wykonanym po prawej stronie mózgu; w tkance mózgowej nie obserwuje się aktywacji GFAP. Panel prawy: mysz z oknem czaszkowym PoRTS i wstrzyknięciem soli fizjologicznej po stronie okna PoRTS. Aktywacja GFAP jest widoczna po stronie okna PoRTS, ale nie po stronie nienaruszonej tkanki mózgowej. Pasek skali: 1 mm. Panel dolny: obrazy tkanek mózgowych przy większym powiększeniu w obszarach wskazanych białymi ramkami na obrazach z paneli górnych. Pasek skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 4. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości kolców dendrytycznych u myszy Thy-1 YFP. Obrazy pozyskano w dniu zabiegu PoRTS oraz 32 dni po zabiegu PoRTS. Z obrazów wynika, że większość kolców obecnych w dniu 0 jest wyraźnie widoczna 32 dni po zabiegu PoRTS. Pasek skali: 2 μm.

Dyskusja

Kluczem do sukcesu w wykonaniu okna czaszkowego metodą PoRTS jest odpowiednie ścieńczenie i polerowanie. Choć wstępne ścieńczenie może zostać wykonane szybko, należy zadbać o to, aby ścieńczenie czaszki na dużym obszarze było jednorodne. Zazwyczaj nakładamy na czaszkę cienką warstwę soli fizjologicznej, a następnie ścieńczamy czaszkę przejście po przejściu, tak aby roztwór soli fizjologicznej odparował krótko po każdym przejeździe mikrowiertła. Pozwala nam to na powolne, ale jednorodne dalsze ścieńczenie czaszki. Kluczow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12(1:1) z pirogronianem sodu	Thermo Sci Hyclone	SH3026101
Suplement bezsurowiczy B-27 (50x)	Invitrogen	17504-044
Suplement GlutaMax-1	Invitrogen	35050061
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Thermo Sci Hyclone	SV30010
Accutase-enzymatyczne medium do odrywania komórek	eBioscience	00-4555-56
Kolby T25-z zielonym nakrętką wentylacyjną	Sarstedt Ltd	83.1810.502
70% alkohol	JAX LAHS
10% miejscowy roztwór powidon-jodu	JAX LAHS
Ketamina HCl	Butler Animal Health Supply	NDC# 11695-0550-1
Ksylazyna	Akorn, Inc.	NADA# 139-236
Karprofen	JAX LAHS
Maść okulistyczna	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
0.5% Lidokaina HCl	REGENT, Inc.	NDC 0517-0625-25
Klej cyjanoakrylowy	Henkel Corp	46551
Sterylne wymazy	Fisher Scientific	23-400-114
Pasta diamentowa	Widget Supply	BBE60
Tlenek cyny	LORTONE, Inc.	591-038
Liner Bond 2V	KURARAY Medical Inc.	1921-KA
Clearfil AP-X	KURARAY Medical Inc.	1721-KA
Sól fizjologiczna	JAX LAHS
Szkiełko przykrywowe	Warner Instruments	64-0720
Nakrętka sześciokątna	Small Parts, Inc.	HNX-0090-C
Pompa strzykawkowa	Syringepump.com	NE-1000
System obrazowania dwufotonowego	Budowa własna (można zastosować dowolny system komercyjny)