Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Podsumowanie

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Streszczenie

Zakłada się, że określone członowie rodziny kanałów potasowych wewnątrzprostujących (Kir) są celami terapeutycznymi w leczeniu wielu schorzeń, w tym nadciśnienia tętniczego, migotania przedsionków oraz bólu^1,2. Jednak w większości przypadków postępy w rozumieniu ich potencjału terapeutycznego, a nawet podstawowych funkcji fizjologicznych, były spowolnione przez brak odpowiednich narzędzi farmakologicznych. W rzeczywistości farmakologia molekularna rodziny kanałów wewnątrzprostujących pozostaje daleko w tyle za superrodziną kanałów potasowych sterowanych napięciem (Kv) z domeną S4, dla których odkryto szereg modulatorów w postaci toksyn peptydowych o wysokiej selektywności i powinowactwie nanomolarnym³. Toksyna z jadu pszczół tertiapina oraz jej pochodne są silnymi inhibitorami kanałów Kir1.1 i Kir3^4,5, jednak peptydy mają ograniczone zastosowanie terapeutyczne i eksperymentalne ze względu na ich właściwości antygenowe oraz słabą biodostępność, stabilność metaboliczną i przenikanie do tkanek. Opracowanie silnych i selektywnych sond małocząsteczkowych o poprawionych właściwościach farmakologicznych będzie kluczem do pełnego zrozumienia fizjologii i potencjału terapeutycznego kanałów Kir.

Sieć Centrów Produkcji Sond Bibliotek Molekularnych (Molecular Libraries Probes Production Center Network, MLPCN), wspierana przez Common Fund Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), stworzyła możliwości dla naukowców akademickich w celu zainicjowania kampanii odkrywania sond dla celów molekularnych i szlaków sygnalizacyjnych wymagających lepszej farmakologii⁶. MLPCN zapewnia badaczom dostęp do przemysłowych centrów przesiewowych oraz wsparcie w zakresie chemii medycznej i informatyki w celu opracowania sond małocząsteczkowych służących do wyjaśnienia funkcji genów i sieci genowych. Kluczowym krokiem w celu uzyskania dostępu do MLPCN jest opracowanie solidnego testu specyficznego dla danego celu lub szlaku, który nadaje się do wysokoprzepustowych przesiewów (HTS).

W niniejszej pracy opisujemy sposób opracowania fluorescencyjnego testu przepływu talu (Tl⁺) do badania funkcji kanałów Kir w celu wysokoprzepustowego przesiewania związków^7,8,9,10. Test opiera się na przepuszczalności poru kanału K⁺ dla Tl⁺, będącego kongenerem K⁺. Do wykrywania transmembranowego przepływu Tl⁺ przez por wykorzystuje się komercyjnie dostępny fluorescencyjny barwnik reporterowy na Tl⁺. Istnieją co najmniej trzy komercyjnie dostępne barwniki odpowiednie do testów przepływu Tl⁺: BTC, FluoZin-2 oraz FluxOR^7,8. Niniejszy protokół opisuje opracowanie testu z wykorzystaniem FluoZin-2. Chociaż FluoZin-2 został pierwotnie opracowany i wprowadzony na rynek jako wskaźnik cynku, wykazuje on silny i zależny od dawki wzrost emisji fluorescencji po związaniu Tl⁺. Rozpoczęliśmy pracę z FluoZin-2 przed wprowadzeniem na rynek FluxOR^7,8 i nadal z niego korzystamy^9,10. Jednak etapy opracowywania testu są zasadniczo identyczne dla wszystkich trzech barwników, a użytkownicy powinni sami określić, który z nich jest najbardziej odpowiedni dla ich konkretnych potrzeb. Omówiono również wskaźniki wydajności testu, które muszą zostać osiągnięte, aby mógł on zostać rozważony do włączenia do MLPCN. Ponieważ Tl⁺ łatwo przenika przez większość kanałów K⁺, test ten powinien być możliwy do zaadaptowania do większości celów w postaci kanałów K⁺.

Protokół

1. Generowanie stabilnych poliklonalnych linii komórkowych

1. Utworzenie wysokiej jakości stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję badanego kanału Kir jest ważnym pierwszym krokiem w stronę opracowania wiarygodnego testu wysokoprzepustowego. Konstytutywna nadekspresja kanałów K⁺ może prowadzić do aktywacji szlaków śmierci komórkowej, degeneracji stabilnej linii komórkowej i utraty wydajności testu. Aby uniknąć tych potencjalnych problemów i zapewnić wygodną kontrolę wewnętrzną do rozwoju testu (patrz poniżej), zaleca się zastosowanie systemu ekspresji indukowalnej tetracykliną⁸.
2. Hodować rodzice komórki T-REx-HEK293 stosując standardowe techniki w medium B (podłoże wzrostowe DMEM zawierające 10% FBS, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 5 μg/ml blastycydyny S). Do transfekcji i selekcji stabilnych klonów należy używać komórek z wczesnych pasaży (np. 3-4 pasaż po rozmrożeniu z przechowywania w ciekłym azocie).
3. Wysiać 4 miliony komórek T-REx-HEK293 do kolby 75 cm² w taki sposób, aby następnego dnia kolba była w około 80% zrośnięta. Hodować przez noc w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
4. Przeprowadzić transfekcję komórek, używając 10-15 μg DNA pcDNA5/TO-Kir oraz odczynnika Lipofectamine LTX/Plus zgodnie z protokołem producenta. Po 5 godzinach zastąpić medium do transfekcji medium B.
5. 24 h po transfekcji zastąpić medium B medium B zawierającym 250 μg/ml hygromycyny (medium BH), aby rozpocząć selekcję stabilnych klonów. Dokarmiać komórki co 2-3 dni świeżym medium BH.
6. W ciągu kolejnych 7 dni powinno obumrzeć ponad 90% komórek, pozostawiając małe kolonie stabilnie transfektowanych komórek. Pozostawić kolonie do wzrostu przez kolejne 10-14 dni przed przeniesieniem do kolby 175 cm² w celu ekspansji.
7. Do krio konserwacji zamrozić 3 x 10⁶ komórek/ml w medium zawierającym 45% warunkowanego medium BH, 45% DMEM z surowicą, bez antybiotyków oraz 10% DMSO. Zamrozić komórki przez noc w -80 °C w pojemniku do zamrażania komórek, a następnie przenieść do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania. Rozmrażać komórki z ciekłego azotu zgodnie z protokołem zalecanym przez firmę Invitrogen. Należy pamiętać, że żywotność komórek będzie niższa, jeśli zostaną zamrożone z kolby, która w momencie przetwarzania była zrośnięta w ponad 75%.

2. Generowanie stabilnych monoklonalnych linii komórkowych

1. Przemyć pod-konfluencyjną kolbę 75 cm² ze stabilnymi komórkami poliklonalnymi za pomocą HBSS wolnego od jonów dwuwartościowych. Dodać 1 ml trypsyny i inkubować przez 3-5 min w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Do kolby dodać 5 ml pożywki BH, aby zahamować aktywność trypsyny, a następnie wielokrotnie triturować (np. 5 razy) do pełnej dysocjacji komórek. Uważnie sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że zawiesina składa się niemal w całości z pojedynczych komórek. Zwiększy to prawdopodobieństwo uzyskania monoklonalnych linii komórkowych.
2. Wyznaczyć gęstość komórek i rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 0,7 komórki na 20 μl. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka płytek 384-dołkowych BD PureCoat powlekanych aminami (lub równoważnie powlekanych poli-D-lizyną). W zasadzie przy takich warunkach wysiewu 70% dołków powinno otrzymać jedną komórkę. Zatem płytka 384-dołkowa powinna zawierać ponad 200 klonów do analizy. Kontynuować hodowlę komórek w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
3. Po tygodniu sprawdzić płytki pod mikroskopem w celu znalezienia dołków zawierających pojedyncze kolonie. Zaznaczyć ich położenie na pokrywce markerem permanentnym do późniejszego wykorzystania. Należy również odnotować i wykluczyć dołki zawierające wiele kolonii. Są one najłatwiej rozpoznawalne po wyglądzie kolonii rosnących z wielu stron dołka. Należy pamiętać, że parowanie zachodzi zazwyczaj szybciej w dołkach znajdujących się blisko krawędzi płytki. Do dołków, w których nastąpiło znaczne parowanie, dodać pożywkę BH. W pozostałych przypadkach dokarmianie komórek nie jest konieczne.
4. Monitorować dołki częściej w ciągu kolejnych 7-10 dni. Komórki będą gotowe do pasażowania, gdy w wybranych dołkach osiągną co najmniej 50% konfluencji.
5. Przenieść komórki na dwie dubletowe płytki 384-dołkowe; jedną do analizy strumienia Tl⁺, a drugą do dalszej hodowli linii monoklonalnych. Odessać pożywkę z dołków zawierających interesujące linie komórkowe. Przemyć komórki HBSS wolnym od jonów dwuwartościowych, dodać 20 μl trypsyny do każdego dołka i przenieść płytkę do inkubatora 37 °C na 15-20 min. Po przeniesieniu płytki z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza, dodać 20 μl pożywki BH do każdego dołka i kilkakrotnie triturować w celu dysocjacji komórek. Sprawdzić dołki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są w pełni zdysocjowane. Może to wymagać wielokrotnego pipetowania, ponieważ komórki będą silnie przylegać. Po zdysocjowaniu komórek przenieść 10 μl każdej zawiesiny komórkowej do dubletowych dołków nowej płytki 384-dołkowej BD PureCoat powlekanej aminami. Należy dokładnie odnotować powiązanie między dołkiem źródłowym a dubletowymi dołkami docelowymi, aby klony wykazujące silną aktywność kanałów Kir (patrz poniżej) można było powiązać z oryginalnym dołkiem. Do oryginalnego dołka źródłowego dodać 20 μl pożywki BH, aby dokarmić pozostałe komórki i kontynuować ich hodowlę w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
6. Pozostawić komórki na płytce docelowej do przywierania i wzrostu przez maksymalnie tydzień. Gdy większość klonów osiągnie co najmniej 50% konfluencji, można ocenić aktywność kanałów Kir za pomocą opisanego poniżej testu strumienia Tl⁺.
7. Dzień przed analizą odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją pożywką BH zawierającą 10% dializowanej FBS. Zapobiega to niezamierzonej ekspresji kanałów, która mogłaby wynikać z zanieczyszczenia surowicy tetracykliną. Indukować ekspresję kanałów Kir tylko w jednym z dubletowych dołków dla każdego klonu poprzez dodanie 1 μg/ml tetracykliny. Drugi, nieindukowany dołek będzie służył jako kontrola „tła”. Wykonać analizy strumienia Tl⁺ zgodnie z poniższym opisem.

3. Ogólna procedura analizy strumienia Tl⁺

1. Dzień przed eksperymentem z przepływem Tl⁺, zdysocjować komórki i określić gęstość zawiesiny komórkowej zgodnie z opisem w sekcjach 2.1 i 2.2. W każdym dołku płytki 384-dołkowej BD PureCoat pokrytej aminą nanieść 20 000 komórek monoklonalnych stabilnie ztransfekowanych genem interesującego kanału Kir, używając urządzenia Thermo Multidrop Combi lub pipety wielokanałowej. Do wysiewu użyć medium BH zawierającego 10% dializowanego FBS. Należy pamiętać, że część komórek będzie hodowana przez noc z dodatkiem 1 μg/ml tetracykliny w celu indukcji ekspresji kanału Kir, natomiast pozostałe nie. Rozmieszczenie komórek indukowanych i nieindukowanych będzie się różnić w zależności od typu eksperymentu i jest przedstawione na Rysunku 1.
2. Następnego dnia sprawdzić płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki przylgnęły i są równomiernie rozłożone na dnie dołków. Dołki powinny być w 80-90% konfluentne.
3. Użyć myjki do mikropłytek ELx405, aby zastąpić medium hodowlane 20 μl na dołek buforu do analizy HBSS zawierającego 20 mM HEPES, z pH dostrojonym do 7,3 za pomocą NaOH. Alternatywnie można zastosować metodę „flick and slam”, polegającą na odwróceniu płytki i gwałtownym uderzeniu nią w dół w celu wyrzucenia medium do pojemnika na odpady, a następnie osuszeniu jej na ułożonych ręcznikach papierowych w celu usunięcia resztek medium. Natychmiast dodać do płytki bufor do analizy HBSS, aby zapobiec wysychaniu komórek.
4. Przygotować roztwór ładujący barwnikiem FluoZin-2, AM. Po krótkim odwirowaniu probówki rozpuścić 50 μg proszku FluoZin-2 w 100 μl bezwodnego DMSO. Na tym etapie alikwoty 1 000-krotnego roztworu zapasowego można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. W momencie przygotowania do użycia, dodać 50 μl 20% (masowo-objętościowo) roztworu Pluronic F-127/DMSO do barwnika i wymieszać delikatnie pipetując. Nie zamrażać barwnika po dodaniu Pluronic F-127, ponieważ niska temperatura może spowodować wytrącenie się surfaktantu z roztworu. Dodać 150 μl FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 do 100 ml buforu do analizy HBSS i delikatnie wymieszać, aby przygotować bufor do ładownia barwnika. Używając Multidrop Combi lub pipety wielokanałowej, dodać 20 μl buforu do ładownia barwnika do każdego dołka zawierającego już 20 μl buforu do analizy HBSS. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez około 1 h (zazwyczaj inkubację przeprowadzano w ciemności, choć nie ma bezpośrednich dowodów na to, że jest to konieczne).
5. Podczas ładowania barwnika do komórek, przygotować płytkę ze bodźcem Tl⁺. Rozpuścić świeżo 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 ml 5-krotnego buforu bodźca Tl⁺ zawierającego 1 mM siarczanu magnezu, 1,8 mM siarczanu wapnia, 5 mM glukozy, 10 mM HEPES i 12 mM siarczanu Tl⁺. Alternatywnie wodorowęglan sodu można zastąpić glukonianem sodu, jeśli na przykład pH roztworu musi być utrzymane w bardzo wąskim zakresie, a utrata dwutlenku węgla jest problematyczna. Szczelnie zamknąć probówkę, aby ograniczyć ucieczkę dwutlenku węgla, i kilkukrotnie odwrócić do momentu rozpuszczenia wodorowęglanu sodu. Używając pipety wielokanałowej, dodać 50 μl roztworu do każdego dołka polipropylenowej płytki 384-dołkowej (Tabela 1).
6. Po załadowaniu komórek barwnikiem FluoZin-2, AM, wypłukać płytki za pomocą myjki do mikropłytek ELx405 lub metodą „flick and slam”, jak opisano wcześniej w sekcji 3.3. W zależności od rodzaju wykonywanego eksperymentu z przepływem Tl⁺, dodać do każdego dołka 20 μl lub 40 μl buforu do analizy HBSS. Płytki są teraz gotowe do eksperymentów.
7. Umieścić płytki z komórkami i Tl⁺ w systemie Hamamatsu Functional Drug Screening System (FDSS) lub równoważnym czytniku płytek do obrazowania kinetycznego z zintegrowaną funkcją dozowania cieczy. Użyć odpowiednich filtrów dla fluoresceiny lub barwników opartych na fluoresceinie, takich jak Fluo-4.
8. Skonfigurować protokół pojedynczego dodania (single-add), tak aby 10 μl serii 5x Tl⁺ zostało dodanych do odpowiadających im dołków płytki z komórkami zawierającej 40 μl buforu do analizy HBSS. Rejestrować fluorescencję bazową z częstotliwością próbkowania 1 Hz przez co najmniej 10 s. Fluorescencja między dołkami powinna być jednolita i stabilna w całej płytce po ustanowieniu optymalnych warunków wysiewu komórek, płukania i ładowania barwnika. Zintegrowana pipeta 384-kanałowa jest używana do jednoczesnego dodania buforu bodźca Tl⁺ do każdego dołka.
9. Rejestrować pomiary przez co najmniej 2 min, aby uchwycić szybkość i szczyt wzrostu fluorescencji indukowanego przez Tl⁺ do późniejszej analizy off-line.

4. Wyznaczenie optymalnego stężenia Tl+

1. Tl⁺ łatwo przenika przez większość kanałów K⁺ wewnętrznie prostujących. Aby upewnić się, że stężenia Tl⁺ nie przekraczają zakresu dynamicznego barwnika raportującego Tl⁺ FluoZin-2, należy empirycznie określić optymalne stężenie Tl⁺ do zastosowania w badaniu wysokoprzepustowym. Zalecamy stężenie Tl⁺, które wywołuje 80% maksymalnej odpowiedzi fluorescencyjnej (EC₈₀) w warunkach maksymalnej aktywacji kanału.
2. Wysiać komórki, załadować barwnik i przemyć komórki w płytkach 384-dołkowych BD PureCoat powlekanych aminą lub równoważnych płytkach powlekanych poli-D-lizyną, zgodnie z opisem w sekcji 3, pozostawiając 40 μl buforu testowego HBSS w każdym dołku. Jak pokazano na mapie płytki na Rysunku 1A, kolumna 1 oraz wiersze A1-A23 powinny zawierać komórki, które nie zostały indukowane tetracykliną, a zatem nie wykazują ekspresji badanego kanału Kir. Sygnały fluorescencji FluoZin-2 z nieindukowanych dołków zostaną wykorzystane do określenia poziomu przepływu Tl⁺ przez szlaki endogenne, takie jak pompa Na⁺- K⁺-ATPase i bramkowane napięciem kanały K⁺, które są normalnie ekspresjonowane w komórkach HEK-293.
3. Użyć zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Agilent Bravo lub pipetowania ręcznego, aby przygotować jedenastoczłonową serię rozcieńczeń stężeń Tl⁺ w buforze testowym HBSS. Typowo w teście ocenia się serię rozcieńczeń 3-krotnych w zakresie od 100% do 0,002% Tl⁺. Serię należy przygotować w stężeniu 5x, ponieważ roztwory Tl⁺ zostaną rozcieńczone w stosunku 1:5 w końcowym teście. Przygotować serię rozcieńczeń, rozcieńczając standardowy bufor 5x Tl⁺ opisany w sekcji 3 buforem 5x wolnym od Tl⁺, zawierającym 1 mM siarczanu magnezu, 1,8 mM siarczanu wapnia, 5 mM glukozy i 10 mM HEPES. Ponownie, bezpośrednio przed naniesieniem na polipropylenową płytkę 384-dołkową zgodnie z mapą płytki pokazaną na Rysunku 2A, rozpuścić na świeżo 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 ml końcowego buforu Tl⁺.
4. Włożyć płytki z komórkami i płytki ze stymulacją Tl⁺ do urządzenia FDSS. Skonfigurować protokół jednorazowego dodawania (single-add) tak, aby 10 μl serii 5x Tl⁺ zostało dodanych do odpowiadających im dołków płytki z komórkami zawierającej 40 μl buforu testowego HBSS. Rejestrować bazową fluorescencję FluoZin-2 przez 10 sec przed dodaniem Tl⁺ do płytki. Powtórzyć eksperyment w 3 oddzielnych dniach, aby ustanowić powtarzalność wyników.

5. Określenie czułości testu na DMSO

1. Małe cząsteczki badane w screeningu wysokoprzepustowym są rozpuszczone w organicznym rozpuszczalniku, którym jest dimetylosulfotlenek (DMSO), a który sam w sobie może wpływać na wyniki testu. Dlatego w pierwszej kolejności należy zbadać wrażliwość testu na DMSO, aby ustalić najwyższe dopuszczalne stężenie DMSO w screeningu.
2. Komórki należy wysiać, załadować barwnik i przemyć w płytkach 384-dołkowych BD PureCoat powlekanych aminą, zgodnie z opisem w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu testowego HBSS w każdym dołku. Cała płytka powinna zawierać komórki indukowane tetracykliną (Rysunek 3A).
3. Używając zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Bravo lub pipetowania ręcznego, należy przygotować jedenastoczłonową serię rozcieńczeń DMSO w buforze testowym HBSS. Zazwyczaj w celu oceny aktywności w teście analizuje się serię rozcieńczeń 2-krotnych w zakresie od 10% do 0,01% v/v DMSO. Serię należy przygotować w stężeniu 2x, ponieważ roztwory DMSO zostaną dwukrotnie rozcieńczone w końcowym teście. Serię rozcieńczeń należy nanieść na polipropylenową płytkę 384-dołkową zgodnie z mapą płytki przedstawioną na Rysunku 3A.
4. Należy przygotować płytkę ze stymulatorem Tl⁺ w stężeniu 5x, w oparciu o EC₈₀ lub optymalne stężenie Tl⁺ określone w sekcji 4.
5. Płytki z komórkami, DMSO i stymulatorem Tl⁺ należy załadować do systemu FDSS. Należy skonfigurować protokół dwuetapowego dodawania tak, aby 20 μl serii DMSO o stężeniu 2x zostało dodanych do odpowiadających im dołków płytki z komórkami zawierających 20 μl buforu testowego HBSS. DMSO należy pozostawić na komórkach przez taki sam czas, przez jaki komórki będą eksponowane na nośnik małych cząsteczek podczas screeningu. Należy zarejestrować podstawową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 sec przed dodaniem 10 μl buforu Tl⁺ 5x do każdego dołka płytki z komórkami. Eksperyment należy powtórzyć w 3 oddzielnych dniach, aby ustalić powtarzalność wyników.
6. Test powinien być tolerancyjny na stężenia DMSO wynoszące co najmniej 0,1% v/v dla typowego screeningu wysokoprzepustowego, w którym związki są testowane w stężeniu 10 μM.

6. Określenie czułości testu na znane modulatory farmakologiczne

1. Po określeniu optymalnego stężenia Tl⁺ oraz tolerancji DMSO w teście, należy zbadać wpływ znanych farmakologicznie czynnych substancji na strumień Tl⁺ pośredniczony przez kanały Kir. Ta seria eksperymentów pozwoli ocenić czułość testu, zdolność do szeregowania związków według ich siły działania, zdolność do kategoryzowania związków na podstawie mechanizmu skuteczności (np. aktywator, inhibitor) oraz zidentyfikować stabilne związki kontrolne do późniejszego wykorzystania w rozwoju testu i przesiewaniu.
2. Rozsieć komórki, załaduj barwnik i przemyj je w 384-dołkowych płytkach BD PureCoat powlekanych aminą zgodnie z opisem w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu testowego HBSS w każdym dołku. Kolumna 1 oraz rzędy A1-A23 powinny zawierać komórki, które nie zostały indukowane tetracykliną (Rysunek 4A).
3. Użyj zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Bravo lub pipetowania ręcznego, aby przygotować jedenastopunktową serię rozcieńczeń stężeń znanych modulatorów w buforze testowym HBSS. Zazwyczaj w celu oceny aktywności w teście analizuje się serię 3-krotnych rozcieńczeń w zakresie od 100 μM do 2 nM. Serię należy przygotować w stężeniu 2x, ponieważ roztwory DMSO zostaną dwukrotnie rozcieńczone w końcowym teście. Serię rozcieńczeń należy nanieść w trzech powtórzeniach na polipropylenową płytkę 384-dołkową, zgodnie z mapą płytki przedstawioną na Rysunku 4A. Należy upewnić się, że rozcieńczenia są wykonane w taki sposób, aby końcowe stężenia DMSO były jednakowe dla wszystkich traktowań lekiem i mniejsze lub równe maksymalnemu dopuszczalnemu stężeniu DMSO określonemu w sekcji 5.
4. Przygotuj płytkę z 5x bodźcem Tl⁺ w oparciu o optymalne stężenie Tl⁺ określone w sekcji 4.
5. Załaduj płytkę z komórkami, związkami i bodźcem Tl⁺ do urządzenia FDSS. Skonfiguruj protokół dwukrotnego dodawania w taki sposób, aby 20 μl serii związków o stężeniu 2x zostało dodanych do odpowiadających im dołków płytki z komórkami zawierających 20 μl buforu testowego HBSS. Dodaj związki do płytki z komórkami i inkubuj przez maksymalnie 20 min. Należy pamiętać, że optymalny czas inkubacji związków w celu uzyskania najlepszego stosunku sygnału do tła można określić, przeprowadzając serię eksperymentów z kilkoma różnymi czasami inkubacji. Zarejestruj bazową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 s przed dodaniem 10 μl 5x buforu Tl⁺ do każdego dołka płytki z komórkami. Powtórz eksperyment w 3 oddzielnych dniach, aby potwierdzić powtarzalność wyników.

7. Analiza szachownicowa

1. W kolejnej serii eksperymentów jednorodność i powtarzalność testu zostaną ocenione za pomocą analizy typu „szachownica”. Zazwyczaj inhibitor kontrolny nanosi się w co drugim dołku każdego słupka i rzędu płytki 384-dołkowej, jak pokazano na Rysunku 5A. Aby rygorystycznie ocenić szum w teście, należy zastosować stężenie inhibitora odpowiadające EC₈₀. Do pozostałych dołków dodaje się DMSO jako kontrolę nośnika. Strumień Tl⁺ w komórkach traktowanych DMSO oraz lekiem służy do obliczenia wartości Z prime, statystycznej miary zmienności między dołkami dla dwóch populacji dołków. Z prime oblicza się według wzoru:
   Z prime = 1- (3SD_p + 3SD_n)/|mean_p + mean_n |
   gdzie SD to odchylenie standardowe, p to wartości strumienia niehamowanego, a n to wartości strumienia w pełni zahamowanego. Test z wartościami Z′ większymi lub równymi 0,5 w 3 oddzielnych dniach jest uważany za odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
2. Komórki należy nanieść na płytki 384-dołkowe BD PureCoat powlekane aminą, załadować barwnik i przemyć zgodnie z opisem w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu testowego HBSS w każdym dołku. Należy pamiętać, że cała płytka powinna zostać indukowana tetracykliną.
3. Należy przygotować płytkę z związkiem/DMSO, pipetując do polipropylenowej płytki 384-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej 80 μl/dołek znanego inhibitora docelowego kanału Kir w stężeniu określonym w sekcji 6.5 oraz nośnik 0,1% v/v DMSO, jak pokazano na Rysunku 5A. Znany inhibitor należy dodawać zaczynając od dołka A1 za pomocą pipety wielokanałowej, naprzemiennie do dołka B2 i tak dalej, aż do dołka B24. Procedurę tę należy powtórzyć z DMSO, zaczynając od dołka B1 i tak dalej, aż do dołka A24. Końcowy układ płytki powinien odpowiadać szachownicy.
4. Należy przygotować płytkę ze stymulatorem 5x Tl⁺ na podstawie optymalnej wartości Tl⁺ określonej w sekcji 4.
5. Płytki z komórkami, związkami i stymulatorem Tl⁺ należy załadować do urządzenia FDSS. Należy ustawić protokół dwóch dodatków w taki sposób, aby 20 μl serii związków w stężeniu 2x zostało dodanych do odpowiadających im dołków płytki z komórkami zawierającej 20 μl buforu testowego HBSS. Związki należy dodać do płytki z komórkami i inkubować do 20 min w temperaturze pokojowej. Należy zarejestrować bazową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 s przed dodaniem 10 μl buforu 5x Tl⁺ do każdego dołka płytki z komórkami. Eksperyment należy powtórzyć w 3 oddzielnych dniach, aby ustalić powtarzalność wyników.

8. Przesiew pilotażowy

1. W końcowym etapie opracowywania testu przeprowadź przesiew pilotażowy kilku tysięcy związków, aby ocenić wydajność testu w warunkach, które zostaną ostatecznie zastosowane w wielkoskalowym przesiewie wysokoprzepustowym.
2. Rozsiej komórki, załaduj barwnik i przemyj je w płytkach BD PureCoat z powłoką aminową z 384 dołkami zgodnie z opisem w sekcji 3), pozostawiając 20 μl buforu testowego HBSS w każdym dołku. Należy pamiętać, że całą płytkę należy inkubować przez noc z tetracykliną, aby indukować ekspresję kanałów Kir.
3. Wybierz około 2000 do 3000 strukturalnie zróżnicowanych związków do przetestowania. Często odpowiednie i wygodne jest wykorzystanie kolekcji związków o znanej aktywności, potencjalnie wzbogaconych o modulatory kanałów jonowych. Takie kolekcje obejmują Spectrum Collection (MicroSource) oraz kolekcję LOPAC (Sigma). Ponadto w przesiewie pilotażowym warto uwzględnić znane modulatory badanego kanału Kir. Idealnie byłoby dodać te związki do dołków w sposób zaślepiony, aby umożliwić obiektywne przetestowanie metod wyboru hitów opisanych później. Przygotuj związki w polipropylenowych płytkach z 384 dołkami (płytki docelowe), używając systemu do dozowania cieczy Labcyte Echo lub odpowiedniego narzędzia typu pin tool, aby przenieść odpowiednią objętość wybranych związków w DMSO z kolekcji MLPCN (płytki źródłowe) do płytek docelowych. Należy pamiętać, że związki testowe znajdują się tylko w kolumnach 3-22; w co drugim dołku kolumn 1, 2, 23, 24 dodaj znany inhibitor w stężeniu, które w pełni hamuje Kir, zgodnie z ustaleniami z sekcji 7. W pozostałych dołkach kolumn 1, 2, 23 i 24 dodaj odpowiednią objętość DMSO, aby stworzyć kontrole nośnika o dopasowanym stężeniu DMSO. Rozcieńcz wszystkie dołki buforem testowym za pomocą Multidrop Combi. Zazwyczaj związki testowe będą miały stężenie 20 μM, czyli 2-krotnie wyższe niż docelowe stężenie przesiewowe.
4. Przygotuj płytki stymulujące Tl⁺ w oparciu o optymalne stężenie Tl⁺ określone w sekcji 4.
5. Przeprowadź przesiew pilotażowy. Należy zadbać o odpowiednie rozłożenie w czasie kroków protokołu, aby zachować spójne odstępy czasowe między płytkami w serii przesiewu pilotażowego.
6. Po zakończeniu przesiewu pilotażowego przeanalizuj dołki kontrolne (checkerboard) z kolumn 1, 2, 23 i 24, korzystając z równania Z-prime. Przejrzyj płytki, które wykazują wartości Z-prime mniejsze niż 0,5, aby ustalić przyczynę słabej separacji populacji kontrolnych. Hity można wybierać za pomocą kilku metod. W przesiewach pilotażowych powszechną praktyką jest obliczenie średniej i odchylenia standardowego dla populacji kontroli nośnika i wybór hitów na podstawie dołków dających wartości >/= 3 odchylenia standardowego od średniej kontroli nośnika.
7. Po wyborze hitów przetestuj ponownie wybrane hity w duplikacie w 2 zestawach płytek. Jeden zestaw płytek zawiera stabilną linię komórkową Kir w obecności tetracykliny, a drugi stabilną linię komórkową Kir w obecności tetracykliny. Hity, które w ponownym teście wykazują wynik dodatni w co najmniej jednej z dwóch płytek i nie wykazują istotnej aktywności w płytkach nieindukowanych, mogą być uznane za zweryfikowane hity. Przeanalizuj listę zweryfikowanych hitów, aby ustalić, ile „ukrytych” próbek kontrolnych zostało wykrytych. Brak wykrycia kontroli w przesiewie pilotażowym wskazuje na konieczność dalszej optymalizacji parametrów przesiewu lub wyboru hitów.

Wyniki

Zastosowanie systemu ekspresji indukowalnej tetracykliną zapewnia wygodną kontrolę wewnętrzną pozwalającą odróżnić strumień Tl⁺ przez szlaki endogenne od strumienia przez analizowany kanał Kir. Rysunek 1 przedstawia przykłady map wysiewu komórek stosowanych w różnych typach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są oznaczone różnymi kolorami. Rysunek 2A przedstawia mapę płyty źródłowej użytej do wyznaczenia optymalnego...

Dyskusja

Obróbka danych: Po zebraniu danych powszechnym krokiem w analizie jest normalizacja odpowiedzi fluorescencyjnej każdego dołka, F, do jego wartości początkowej na początku eksperymentu, F₀. Jest to powszechnie określane jako „stosunek statyczny” i symbolizowane jako „F/F₀^"_. W przypadkach, gdy w F₀ dominuje barwnik wskaźnikowy, operacja obliczenia stosunku statycznego w znacznym stopniu skoryguje wiele czynników, takich jak nierównomierność oświetlenia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Wektor ekspresyjny indukowany tetracykliną
komórki T-REx-HEK293	Invitrogen	R71007	Linia komórkowa indukowalna tetracykliną
Odczynnik Lipofectamine LTX/Plus	Invitrogen	15338100	Odczynnik do transfekcji
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Pożywki do hodowli komórkowych
DMEM	Invitrogen	11965	Pożywki do hodowli komórkowych
Higromycyna B	Invitrogen	10687-010	Pożywki do hodowli komórkowych
Blasticydyna S	Invitrogen	R210-01	Pożywki do hodowli komórkowych
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140	Pożywki do hodowli komórkowych
HBSS bez jonów dwuwartościowych	Mediatech	21022CV	Przemywanie komórek
Trypsyna-0,25%	Mediatech	25053CI	Dysocjacja komórek
Tetracyklina-HCl	Sigma	T9823	Odczynnik indukujący
Dializowana FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Pożywki do wysiewu
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Barwnik fluorescencyjny
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Ładowanie barwnika
HBSS	Invitrogen	14175	Bufor do analizy
HEPES	Invitrogen	15630	Bufor do analizy
NaHCO33	Sigma	S6297	Tl+ bufor stymulujący
MgSO₄4	Sigma	M2643	Tl+ bufor stymulujący
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ bufor stymulujący
D-glukoza	Sigma	G7528	Tl+ bufor stymulujący
Siarczan talu(I)	Aldrich	204625	Tl+ bufor stymulujący
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ bufor stymulujący
DMSO	Sigma	D4540	Rozpuszczalnik
Ośmiokanałowa pipeta elektroniczna	Biohit	E300	Wysiew komórek na płytki 384-dołkowe
płytki 384-dołkowe BD PureCoat pokryte aminami	BD Biosciences	356719	Mikropłytki analityczne
Certyfikowana do systemu Echo polipropylenowa mikropłytka 384-dołkowa (384PP)	Labcyte	P-05525	Złożone mikropłytki źródłowe
polipropylenowe mikropłytki 384-dołkowe	Greiner Bio-One	781280
Dozownik odczynników Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
myjka do mikropłytek ELx405	BioTek	ELx405HT	Zautomatyzowane przemywanie komórek
Automatyczny system dozujący Echo	Labcyte	Labcyte Echo 550
zautomatyzowana platforma do pipetowania Bravo	Agilent Technologies	Model standardowy
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetyczny czytnik płytek obrazowych
Tabela 1Lista materiałów i odczynników.