Method Article

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych wewnętrznego prostownika

DOI:

10.3791/4209

⸱

January 27th, 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metody rozwoju i walidacji ilościowego testu fluorescencji do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostownika wewnętrznego (Kir) do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzni członkowie rodziny kanałów potasowych prostowników wewnętrznych (Kir) są postulowanymi celami leków dla różnych zaburzeń, w tym nadciśnienia, migotania przedsionków i bólu1,2. W większości jednak postęp w kierunku zrozumienia ich potencjału terapeutycznego, a nawet podstawowych funkcji fizjologicznych, został spowolniony przez brak dobrych narzędzi farmakologicznych. Rzeczywiście, farmakologia molekularna rodziny prostowników wewnętrznych pozostaje daleko w tyle za nadrodziną S4 kanałów potasowych bramkowanych napięciem (Kv), dla której odkryto szereg modulatorów powinowactwa nanomolowego i wysoce selektywnych modulatorów toksyny peptydowej3. Toksyna jadu pszczelego, tertiapina i jej pochodne, są silnymi inhibitorami kanałów Kir1.1 i Kir34,5, ale peptydy mają ograniczone zastosowanie terapeutyczne, jak również eksperymentalne ze względu na ich właściwości antygenowe i słabą biodostępność, stabilność metaboliczną i penetrację tkanek. Opracowanie silnych i selektywnych sond małocząsteczkowych o ulepszonych właściwościach farmakologicznych będzie kluczem do pełnego zrozumienia fizjologii i potencjału terapeutycznego kanałów Kir.

Sieć Centrów Produkcji Sond Bibliotek Molekularnych (MLPCN), wspierana przez Wspólny Fundusz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), stworzyła naukowcom akademickim możliwości inicjowania kampanii odkrywania sond dla celów molekularnych i szlaków sygnałowych wymagających lepszej farmakologii6. MLPCN zapewnia naukowcom dostęp do przemysłowych centrów badań przesiewowych oraz wsparcia w zakresie chemii medycznej i informatyki w celu opracowania sond małocząsteczkowych w celu wyjaśnienia funkcji genów i sieci genowych. Kluczowym krokiem na drodze do uzyskania dostępu do MLPCN jest opracowanie solidnego testu specyficznego dla celu lub szlaku, który można poddać wysokoprzepustowym badaniom przesiewowym (HTS).

Tutaj opisujemy, jak opracować oparty na fluorescencji test strumienia talu (Tl+) funkcji kanału Kir dla wysokoprzepustowego badania przesiewowego związków7,8,9,10. Test opiera się na przepuszczalności porów kanału K+ dla kongeneru K+ Tl+. Dostępny na rynku fluorescencyjny barwnik reporterowy Tl+ służy do wykrywania strumienia transbłonowego Tl+ przez pory. Istnieją co najmniej trzy dostępne na rynku barwniki, które nadają się do oznaczania strumienia Tl+: BTC, FluoZin-2 i FluxOR7,8. Protokół ten opisuje opracowywanie testu przy użyciu FluoZin-2. Chociaż pierwotnie opracowany i sprzedawany jako wskaźnik, FluoZin-2 wykazuje silny i zależny od dawki wzrost emisji fluorescencji po związaniu Tl+. Zaczęliśmy pracować z FluoZin-2 zanim FluxOR był dostępny7,8 i kontynuujemy to9,10. Jednak etapy opracowywania testu są zasadniczo identyczne dla wszystkich trzech barwników, a użytkownicy powinni określić, który barwnik jest najbardziej odpowiedni dla ich konkretnych potrzeb. Omawiamy również kryteria wydajności testu, które muszą zostać osiągnięte, aby można było wziąć pod uwagę możliwość przystąpienia do MLPCN. Ponieważ Tl+ łatwo przenika do większości kanałów K+, test powinien być dostosowany do większości celów kanału K+.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie stabilnych poliklonalnych linii komórkowych

  1. Stworzenie wysokiej jakości stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję kanału Kir jest ważnym pierwszym krokiem w kierunku opracowania solidnego, wysokoprzepustowego testu przesiewowego. Konstytutywna nadekspresja kanału K+ może prowadzić do aktywacji szlaków śmierci komórki, stabilnej degeneracji linii komórkowej i utraty wydajności testu. Aby uniknąć tych potencjalnych problemów i zapewnić wygodną kontrolę wewnętrzną przy opracowywaniu testu (patrz poniżej), zaleca się stosowanie systemu ekspresji indukowanego tetracykliną8.
  2. Hodowla rodzicielskich komórek ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie systemu ekspresji indukowanego tetracykliną zapewnia wygodną wewnętrzną kontrolę do rozróżniania strumienia Tl+ przez szlaki endogenne i kanał Kir będący przedmiotem zainteresowania. Rysunek 1 przedstawia kilka przykładów map posiewu komórek stosowanych w różnych typach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są oznaczone różnymi kolorami. Rysunek 2A przedstawia mapę źródłową używaną do określenia optymalnego stę.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetwarzanie danych: Po zebraniu danych częstym krokiem w analizie jest normalizacja odpowiedzi fluorescencyjnej każdego dołka, F, do jej początkowej wartości na początku eksperymentu, F0. Jest to powszechnie określane jako "stosunek statyczny" i symbolizowane jako "F/F0". W przypadkach, gdy F0 jest zdominowany przez barwnik wskaźnikowy, operacja współczynnika statycznego znacznie skoryguje wiele czynników, takich jak nierównomierności oświetlenia, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez fundusze z grantów National Institutes of Health 1R21NS073097-01 i 1R01DK082884 (J.S.D.) oraz grantu Fundacji dla Narodowych Instytutów PIER11VCTR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pcDNA5/TOInvitrogenV1033-20Wektor ekspresyjny indukowany tetracykliną
Komórki T-REx-HEK293InvitrogenR71007Linia komórkowa indukowana tetracykliną
Lipofectamina LTX/Plus OdczynnikInvitrogen15338100Transfekcja
FBSATLANTA BiologicalsS11550Pożywka do hodowli komórkowych
DMEMInvitrogen11965Pożywka do hodowli komórkowych
Higromycyna BInvitrogen10687-010Pożywka do hodowli komórkowych
Blasticidin SInvitrogenR210-01Pożywka do hodowli komórkowych
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140Pożywka do hodowli komórkowych
Wolne od HBSSMediatech21022CVMycie komórek
Trypsyna-0,25%Mediatech25053CIDysocjacja komórek
Tetracyklina-HClSigmaT9823Odczynnik indukcyjny
Dializowany FBSATLANTA BiologicalsS12650Media galwaniczne
FluoZin-2InvitrogenF24189Barwnik fluorescencyjny
Pluronic F-127InvitrogenP-3000MPŁadowanie barwnika
HBSSInvitrogen14175Bufor testowy
HEPESInvitrogen15630Bufor testowy
NaHCO3SigmaS6297Tl+ bufor bodźca
MgSO4SigmaM2643Tl+ bufor bodźca
CaSO4∙ 2H2OSigmaC3771Tl+ bufor bodźcowy
D-GlucoseSigmaG7528Tl+ bufor bodźcowy
Aldrich204625Tl+ bufor bodźca
HEPESSigmaH4034Tl+ bufor bodźca
DMSOSigmaD4540Solvent
Ośmiokanałowy pipet elektronicznyBiohitE300Powlekanie komórek na płytkach 384-dołkowych
BD PureCoat powlekane aminą płytki 384-dołkoweBD Biosciences356719Mikropłytki testowe
Kwalifikowana przez Echo 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa (384PP)LabcyteP-05525Mikropłytki ze źródłem związków
384-dołkowy polipropylen mikropłytkiGreiner Bio-One781280
Multidrop Dozownik odczynników CombiThermo Scientific5840300
ELx405 myjka do mikropłytekBioTekELx405HTAutomatyczne mycie komórek
Obsługa cieczy EchoLabcyte LabcyteEcho 550
Bravo zautomatyzowana platforma do obsługi cieczyAgilent TechnologiesModel standardowy
Hamamatsu FDSS 6000HamamatsuCzytnik płytek do obrazowania kinetycznego

Tabela 1. Wykaz materiałów i odczynników.

do transfekcji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrlich, J. R. Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy. J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).
  2. Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. Small-molecule modulato....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inward Rectifier Potassium ChannelsThallium Flux AssayHigh throughput ScreeningFluorescent Tl Reporter DyeFluoZin 2Tetracycline Inducible Cells384 Well PlateZ Prime CalculationFluorescence Plate ReaderSmall molecule Modulators

Related Articles