Wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla małocząsteczkowych modulatorów kanałów potasowych wewnętrznego prostownika

Summary

Przedstawiono metody rozwoju i walidacji ilościowego testu fluorescencji do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostownika wewnętrznego (Kir) do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków.

Abstract

Specyficzni członkowie rodziny kanałów potasowych prostowników wewnętrznych (Kir) są postulowanymi celami leków dla różnych zaburzeń, w tym nadciśnienia, migotania przedsionków i bólu^1,2. W większości jednak postęp w kierunku zrozumienia ich potencjału terapeutycznego, a nawet podstawowych funkcji fizjologicznych, został spowolniony przez brak dobrych narzędzi farmakologicznych. Rzeczywiście, farmakologia molekularna rodziny prostowników wewnętrznych pozostaje daleko w tyle za nadrodziną S4 kanałów potasowych bramkowanych napięciem (Kv), dla której odkryto szereg modulatorów powinowactwa nanomolowego i wysoce selektywnych modulatorów toksyny peptydowej³. Toksyna jadu pszczelego, tertiapina i jej pochodne, są silnymi inhibitorami kanałów Kir1.1 i Kir3^4,5, ale peptydy mają ograniczone zastosowanie terapeutyczne, jak również eksperymentalne ze względu na ich właściwości antygenowe i słabą biodostępność, stabilność metaboliczną i penetrację tkanek. Opracowanie silnych i selektywnych sond małocząsteczkowych o ulepszonych właściwościach farmakologicznych będzie kluczem do pełnego zrozumienia fizjologii i potencjału terapeutycznego kanałów Kir.

Sieć Centrów Produkcji Sond Bibliotek Molekularnych (MLPCN), wspierana przez Wspólny Fundusz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), stworzyła naukowcom akademickim możliwości inicjowania kampanii odkrywania sond dla celów molekularnych i szlaków sygnałowych wymagających lepszej farmakologii⁶. MLPCN zapewnia naukowcom dostęp do przemysłowych centrów badań przesiewowych oraz wsparcia w zakresie chemii medycznej i informatyki w celu opracowania sond małocząsteczkowych w celu wyjaśnienia funkcji genów i sieci genowych. Kluczowym krokiem na drodze do uzyskania dostępu do MLPCN jest opracowanie solidnego testu specyficznego dla celu lub szlaku, który można poddać wysokoprzepustowym badaniom przesiewowym (HTS).

Tutaj opisujemy, jak opracować oparty na fluorescencji test strumienia talu (Tl⁺) funkcji kanału Kir dla wysokoprzepustowego badania przesiewowego związków^7,8,9,10. Test opiera się na przepuszczalności porów kanału K⁺ dla kongeneru K⁺ Tl⁺. Dostępny na rynku fluorescencyjny barwnik reporterowy Tl⁺ służy do wykrywania strumienia transbłonowego Tl⁺ przez pory. Istnieją co najmniej trzy dostępne na rynku barwniki, które nadają się do oznaczania strumienia Tl⁺: BTC, FluoZin-2 i FluxOR^7,8. Protokół ten opisuje opracowywanie testu przy użyciu FluoZin-2. Chociaż pierwotnie opracowany i sprzedawany jako wskaźnik, FluoZin-2 wykazuje silny i zależny od dawki wzrost emisji fluorescencji po związaniu Tl⁺. Zaczęliśmy pracować z FluoZin-2 zanim FluxOR był dostępny^7,8 i kontynuujemy to^9,10. Jednak etapy opracowywania testu są zasadniczo identyczne dla wszystkich trzech barwników, a użytkownicy powinni określić, który barwnik jest najbardziej odpowiedni dla ich konkretnych potrzeb. Omawiamy również kryteria wydajności testu, które muszą zostać osiągnięte, aby można było wziąć pod uwagę możliwość przystąpienia do MLPCN. Ponieważ Tl⁺ łatwo przenika do większości kanałów K⁺, test powinien być dostosowany do większości celów kanału K⁺.

Protocol

1. Generowanie stabilnych poliklonalnych linii komórkowych

1. Stworzenie wysokiej jakości stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję kanału Kir jest ważnym pierwszym krokiem w kierunku opracowania solidnego, wysokoprzepustowego testu przesiewowego. Konstytutywna nadekspresja kanału K⁺ może prowadzić do aktywacji szlaków śmierci komórki, stabilnej degeneracji linii komórkowej i utraty wydajności testu. Aby uniknąć tych potencjalnych problemów i zapewnić wygodną kontrolę wewnętrzną przy opracowywaniu testu (patrz poniżej), zaleca się stosowanie systemu ekspresji indukowanego tetracykliną⁸.
2. Hodowla rodzicielskich komórek T-REx-HEK293 przy użyciu standardowych technik w pożywce B (pożywka wzrostowa DMEM zawierająca 10% FBS, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 5 μg/ml blasticydyny S). Do transfekcji i stabilnej selekcji klonów należy użyć komórek wczesnego pasażu (np. 3-4 pasaże od rozmrożenia z magazynu ciekłego azotu).
3. Umieść 4 miliony komórek T-REx-HEK293 w kolbie o średnicy 75^cm2 tak, aby kolba zlewała się w około 80% następnego dnia. Hodowla przez noc w inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C.
4. Przetaczaj komórki za pomocą 10-15 μg pcDNA5/TO-Kir DNA i odczynnika Lipofectamine LTX/Plus zgodnie z protokołem producenta. Po 5 godzinach zastąp pożywkę transfekcyjną pożywką B.
5. 24 godziny po transfekcji zastąp pożywkę B pożywką B zawierającą 250 μg/ml higromycyny (pożywka BH), aby rozpocząć stabilną selekcję klonów. Karmić komórki co 2-3 dni świeżą pożywką BH.
6. Ponad 90% komórek powinno umrzeć w ciągu najbliższych 7 dni, pozostawiając małe kolonie stabilnie transfekowanych komórek. Pozwól koloniom rosnąć przez dodatkowe 10-14 dni przed podzieleniem do kolby o długości 175^cm2 w celu ekspansji.
7. W celu kriokonserwacji zamrozić 3 x 10⁶ komórek/ml w pożywce zawierającej 45% kondycjonowanej pożywki BH, 45% wolnej od antybiotyków, DMEM zawierającej surowicę i 10% DMSO. Zamrozić komórki przez noc w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania komórek, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Rozmrozić komórki z ciekłego azotu zgodnie z zalecanym protokołem Invitrogen. Należy zauważyć, że żywotność komórek będzie niższa, jeśli zostaną one zamrożone z kolby, która w czasie przetwarzania jest większa niż 75% zlewania się.

2. Generowanie stabilnych linii komórkowych monoklonalnych

1. Przemyć zlewającą się kolbę o długości 75^cm2 stabilnych komórek poliklonalnych wolnym od dwuwartościowych HBSS. Dodać 1 ml trypsyny i inkubować przez 3-5 minut w inkubatorze z 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki BH do kolby w celu zahamowania aktywności trypsyny i wielokrotnie (np. 5 razy) w celu pełnej dysocjacji komórek. Dokładnie sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że zawiesina składa się prawie wyłącznie z pojedynczych komórek. Zwiększy to prawdopodobieństwo uzyskania monoklonalnych linii komórkowych
.
2. Oznaczyć gęstość komórek i rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 0,7 komórek na 20 μl. Za pomocą pipetora wielokanałowego odpipetować pipetą 20 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na płytkach 384-dołkowych BD PureCoat pokrytych aminą (lub równoważną poli-D-lizyną). Zasadniczo 70% studni powinno otrzymać jedną komórkę w tych warunkach poszycia. Tak więc płytka 384-dołkowa powinna zawierać ponad 200 klonów do analizy. Kontynuować hodowlę komórek w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
3. Po tygodniu sprawdź płytki pod mikroskopem pod kątem studzienek zawierających pojedyncze kolonie. Zanotuj ich położenie na wieczku za pomocą trwałego markera do wykorzystania w przyszłości. Pamiętaj również, aby zanotować i wykluczyć studnie zawierające wiele kolonii. Najłatwiej je rozpoznać po pojawieniu się kolonii wyrastających z wielu stron studni. Należy pamiętać, że parowanie ma tendencję do szybszego zachodzenia ze studzienek w pobliżu krawędzi płyty. Dodać pożywkę BH do studzienek, w których nastąpiło znaczne parowanie. W przeciwnym razie nie ma potrzeby karmienia komórek.
4. Monitoruj studnie częściej w ciągu najbliższych 7-10 dni. Komórki będą gotowe do podziału, gdy interesujące je studnie będą zlewać się w co najmniej 50%.
5. Podziel komórki, aby zduplikować płytki 384-dołkowe; jedną płytkę do oznaczania strumieniem Tl ⁺, a drugą do kontynuacji linii monoklonalnych w hodowli. Odessać pożywkę z dołków zawierających interesujące nas linie komórkowe. Umyj komórki bezdwuwartościowym HBSS, dodaj 20 μl trypsyny do każdej studzienki i przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na 15-20 minut. Po przeniesieniu płytki z powrotem do okapu do hodowli komórkowej, dodaj 20 μl pożywki BH do każdej studzienki i kilkakrotnie rozcieraj w celu dysocjacji komórek. Sprawdź studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są w pełni zdysocjowane. Może to wymagać wielu rund pipetowania, ponieważ komórki będą ściśle przylegać. Po dysocjacji komórek przenieś 10 μl każdej zawiesiny komórkowej do zduplikowanych studzienek nowej 384-dołkowej płytki BD PureCoat pokrytej aminami. Pamiętaj, aby zwrócić uwagę na związek między studnią źródłową a zduplikowanymi studniami docelowymi, tak aby klony wykazujące silną aktywność kanału Kir (patrz poniżej) mogły być prześledzone z powrotem do oryginalnego dołka. Dodać 20 μl pożywki BH do pierwotnego dołka źródłowego, aby nakarmić pozostałe komórki i kontynuować je w hodowli w inkubatorze 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
6. Pozwól komórkom na płytce docelowej przylegać i rosnąć przez okres do tygodnia. Gdy większość klonów osiągnie co najmniej 50% konfluencji, można je ocenić pod kątem aktywności kanału Kir za pomocą testu strumienia Tl⁺ opisanego poniżej.
7. Dzień przed testem odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją pożywką BH zawierającą 10% dializowanego FBS. Zapobiega to niezamierzonej ekspresji kanału, która mogłaby powstać z surowicy zanieczyszczonej tetracykliną. Indukować ekspresję kanału Kir tylko w jednym ze zduplikowanych studzienek dla każdego klonu, włączając 1 μg/ml tetracykliny. Zduplikowana nieindukowana studnia będzie służyć jako kontrola "w tle". Wykonaj testy strumienia Tl⁺ zgodnie z opisem poniżej.

3. Ogólna procedura oznaczania strumienia Tl⁺

1. Dzień przed eksperymentem ze strumieniem Tl⁺ należy rozdzielić komórki i określić ilościowo gęstość zawiesiny komórkowej, jak opisano w sekcjach 2.1 i 2.2. Płytka 20 000 komórek monoklonalnych stabilnie transfekowanych genem kanału Kir w każdym dołku 384-dołkowej płytki BD PureCoat pokrytej aminą za pomocą pipetara Thermo Multidrop Combi lub pipetora wielokanałowego. Do posiewu należy użyć pożywki BH zawierającej 10% dializowanego FBS. Należy pamiętać, że niektóre komórki będą hodowane przez noc z 1 μg / ml tetracykliny w celu wywołania ekspresji kanału Kir, podczas gdy inne nie. Lokalizacja komórek indukowanych i nieindukowanych będzie się różnić dla każdego rodzaju eksperymentu i jest pokazana na rysunku 1.
2. Następnego dnia sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki przylegają i są równomiernie rozmieszczone na dnie studzienek. Studzienki powinny być zlewające się w 80-90%.
3. Użyj myjki do mikropłytek ELx405, aby zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej 20 μl na studzienkę buforu testowego HBSS zawierającego 20 mM HEPES i zbuforowanego do pH 7,3 za pomocą NaOH. Alternatywnie można użyć metody "flick and slam", w której płyta jest odwracana i ostro zatrzaskiwana w dół, aby wyrzucić medium do pojemnika na odpady, a następnie wklepywana w ułożone ręczniki papierowe w celu usunięcia pozostałego nośnika. Natychmiast dodać z powrotem bufor testowy HBSS do płytki, aby zapobiec wysuszeniu komórek.
4. Przygotuj roztwór do ładowania barwnikiem FluoZin-2, AM. Po krótkim odwirowaniu probówki rozpuścić 50 μg proszku FluoZin-2 w 100 μl bezwodnego DMSO. W tym momencie podwielokrotności 1000-krotnego roztworu podstawowego mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Gotowy do użycia roztwór Pluronic F-127/DMSO o stężeniu 20% wagowym do objętości należy dodać do barwnika i delikatnie odpipetować. Nie zamrażaj barwnika po dodaniu Pluronic F-127, ponieważ niska temperatura może spowodować wytrącenie się środka powierzchniowo czynnego z roztworu. Dodać 150 μl objętości FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 do 100 ml buforu do oznaczania HBSS i delikatnie wymieszać, aby uzyskać bufor ładujący barwnik. Używając pipetora Multidrop Combi lub pipetora wielokanałowego, dodaj 20 μl buforu ładującego barwnik do każdej studzienki zawierającej już 20 μl buforu do oznaczania HBSS. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę (zazwyczaj inkubacja odbywa się w ciemności, chociaż nie ma bezpośrednich dowodów na to, że jest to konieczne).
5. Podczas gdy komórki ładują się barwnikiem, przygotuj płytkę stymulacyjną Tl ⁺. Świeżo rozpuść 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 ml 5x Tl⁺ bufor stymulacyjny zawierający 1 mM siarczanu magnezu, 1,8 mM siarczanu wapnia, 5 mM glukozy, 10 mM HEPES i 12 mM siarczanu Tl⁺. Alternatywnie wodorowęglan sodu można zastąpić glukonianem sodu, jeśli na przykład pH roztworu musi być utrzymywane w bardzo wąskim zakresie, a utrata dwutlenku węgla jest problemem. Zamknij szczelnie probówkę, aby ograniczyć ulatnianie się dwutlenku węgla i odwróć kilka razy, aż wodorowęglan sodu przejdzie do roztworu. Za pomocą pipetora wielokanałowego dodać 50 μl roztworu do każdego dołka 384-dołkowej płytki polipropylenowej (Tabela 1).
6. Po załadowaniu komórek FluoZin-2, AM, umyć płytki myjką do mikropłytek ELx405 lub metodą "pstryknięcia i trzaskania", jak opisano powyżej w sekcji 3.3. W zależności od rodzaju eksperymentu ze strumieniem Tl⁺, który ma być przeprowadzony, dodać z powrotem 20 μl lub 40 μl buforu testowego HBSS do każdej studzienki. Płytki są teraz gotowe do eksperymentów.
7. Komórka i Tl⁺ są umieszczane w Hamamatsu Functional Drug Screening System (FDSS) lub równoważnym czytniku płytek do obrazowania kinetycznego ze zintegrowanymi możliwościami dozowania cieczy. Używaj odpowiednich filtrów do fluoresceiny/barwników na bazie fluoresceiny, takich jak Fluo-4.
8. Ustaw protokół pojedynczego dodania, tak aby 10 μl serii 5x Tl⁺ zostało dodane do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 40 μl buforu testowego HBSS. Rejestrować fluorescencję wyjściową przy częstotliwości próbkowania 1 Hz przez co najmniej 10 sekund. Fluorescencja od studni do studni powinna być jednolita i stabilna na całej płytce po ustaleniu optymalnych warunków powlekania komórek, mycia i obciążenia barwnikiem. Zintegrowany 384-kanałowy pipetor służy do jednoczesnego dodawania bufora bodźcowego Tl⁺ do każdej studzienki.
9. Rejestrować przez co najmniej 2 minuty, aby uchwycić szybkość i szczyt wzrostu fluorescencji wywołanego przez Tl⁺ do analizy off-line.

4. Określenie optymalnego stężenia Tl+

1. Tl⁺ łatwo przenika większość kanałów prostownika wewnętrznego K⁺. Aby upewnić się, że stężenia Tl⁺ nie przekraczają zakresu dynamicznego barwnika reporterowego Tl⁺ FluoZin-2, należy empirycznie określić optymalne stężenie Tl⁺, które ma być stosowane w wysokoprzepustowym sitodruku. Zalecamy stężenie Tl⁺, które wywołuje 80% maksymalnej odpowiedzi fluorescencyjnej (EC₈₀) w warunkach, w których kanał jest maksymalnie aktywowany.
2. Płytki, barwnik załadować i umyć komórki na 384-dołkowych płytkach BD PureCoat pokrytych aminą lub równoważną poli-D-lizyną, jak opisano powyżej w sekcji 3, pozostawiając 40 μl buforu do oznaczania HBSS w każdym basenie. Jak pokazano na mapie talerza na rysunku 1A, kolumna 1 i wiersze A1-A23 powinny zawierać komórki, które nie zostały indukowane tetracykliną, a zatem nie wyrażają kanału Kir będącego przedmiotem zainteresowania. Sygnały fluorescencyjne FluoZin-2 z nieindukowanych studni zostaną wykorzystane do określenia poziomu strumienia Tl ⁺ przez szlaki endogenne, takie jak pompa Na⁺- K⁺ -ATPaza i kanały K ⁺ bramkowane napięciem, które normalnie ulegają ekspresji w komórkach HEK-293.
3. Użyj zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Agilent Bravo lub pipetowania ręcznego, aby przygotować jedenastopunktową serię rozcieńczeń stężenia Tl⁺ w buforze testowym HBSS. Zazwyczaj w teście ocenia się 3-krotną serię seryjnych rozcieńczeń w zakresie od 100% do 0,002% Tl⁺. Serię należy przygotować w stężeniu 5x, ponieważ roztwory Tl⁺ zostaną rozcieńczone w stosunku 1:5 w końcowym teście. Przygotować serię rozcieńczeń, rozcieńczając wzorcowy bufor 5x Tl⁺ opisany w sekcji 3 buforem 5x wolnym od Tl⁺ zawierającym 1 mM siarczan magnezu, 1,8 mM siarczan wapnia, 5 mM glukozy i 10 mM HEPES. Ponownie, świeżo rozpuść 0,5 g wodorowęglanu sodu w 50 ml końcowego buforu Tl⁺ bezpośrednio przed posiewem na polipropylenowej płytce 384-dołkowej, zgodnie z mapą płytki pokazaną na rysunku 2A.
4. Załaduj komórkę i płytki stymulacyjne Tl ⁺ do FDSS. Ustaw protokół pojedynczego dodania, tak aby 10 μl serii 5x Tl⁺ zostało dodane do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 40 μl buforu testowego HBSS. Rejestruj podstawową fluorescencję FluoZin-2 przez 10 sekund przed dodaniem Tl⁺ do płytki. Powtórz eksperyment przez 3 oddzielne dni, aby ustalić odtwarzalność wyników.

5. Określanie wrażliwości testu na DMSO

1. Małe cząsteczki badane w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym są rozpuszczane w rozpuszczalniku organicznym dimetylosulfotlenku (DMSO), który sam w sobie może wpływać na wydajność testu. W związku z tym należy najpierw zbadać czułość testu na DMSO, aby ustalić najwyższe dopuszczalne stężenie DMSO w badaniu przesiewowym.
2. Płytki, barwnik załadować i umyć komórki na 384-dołkowych płytkach pokrytych aminami BD PureCoat, jak opisano powyżej w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu do oznaczania HBSS w każdym dołku. Cała płytka powinna zawierać komórki, które zostały indukowane tetracykliną (ryc. 3A).
3. Użyj zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Bravo lub pipetowania ręcznego, aby przygotować jedenastopunktową serię rozcieńczeń stężenia DMSO w buforze testowym HBSS. Zazwyczaj 2-krotna seria rozcieńczeń w zakresie od 10% do 0,01% v/v DMSO jest oceniana pod kątem aktywności w teście. Serię należy przygotować w stężeniu 2x, ponieważ roztwory DMSO zostaną rozcieńczone o połowę w końcowym teście. Serie rozcieńczeń należy posiać na 384-dołkowej płytce polipropylenowej, zgodnie z mapą płytek pokazaną na rysunku 3A.
4. Przygotować płytkę stymulającą 5x Tl⁺ w oparciu o EC₈₀ lub optymalne stężenie Tl⁺ określone w punkcie 4.
5. Załaduj płytki stymulacyjne komórki, DMSO i Tl ⁺ do FDSS. Ustaw protokół dwóch dodań, tak aby 20 μl serii DMSO o stężeniu 2x zostało dodane do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 20 μl buforu do oznaczania HBSS. Pozostaw DMSO na komórkach na ten sam czas, w którym komórki będą wystawione na działanie nośnika małych cząsteczek podczas badania przesiewowego. Rejestruj podstawową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 sekund przed dodaniem 10 μl 5x buforu Tl ⁺ do każdego dołka płytki komórkowej. Powtórz eksperyment przez 3 oddzielne dni, aby ustalić odtwarzalność wyników.
6. Test powinien być tolerancyjny na stężenia DMSO wynoszące co najmniej 0,1% v/v dla typowego wysokoprzepustowego badania przesiewowego, w którym bada się związki w stężeniu 10 μM.

6. Określanie czułości testu na znane modulatory farmakologiczne

1. Po określeniu optymalnego stężenia Tl⁺ i tolerancji DMSO testu, należy zbadać wpływ znanych środków farmakologicznie czynnych na strumień Tl⁺ za pośrednictwem kanału Kir. Ta seria eksperymentów oceni czułość testu, zdolność do szeregowania związków na podstawie ich siły działania, zdolność do kategoryzacji związków na podstawie ich sposobu działania (np. aktywator, inhibitor) oraz zidentyfikuje dobrze zachowujące się związki kontrolne, które zostaną wykorzystane w późniejszym etapie opracowywania i badania przesiewowego.
2. Płytki, barwnik załadować i umyć komórki na 384-dołkowych płytkach pokrytych aminami BD PureCoat, jak opisano powyżej w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu do oznaczania HBSS w każdym dołku. Kolumna 1 i wiersze A1-A23 powinny zawierać komórki, które nie zostały indukowane tetracykliną (ryc. 4A).
3. Użyj zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy Bravo lub pipetowania ręcznego, aby przygotować jedenastopunktową serię rozcieńczeń stężenia znanych modulatorów w buforze testowym HBSS. Zazwyczaj 3-krotna seria rozcieńczeń w zakresie od 100 μM do 2 nM jest oceniana pod kątem aktywności w teście. Serię należy przygotować w stężeniu 2x, ponieważ roztwory DMSO zostaną rozcieńczone o połowę w końcowym teście. Serię rozcieńczeń należy posiać trzykrotnie na 384-dołkowej płytce polipropylenowej, zgodnie z mapą płytek pokazaną na rysunku 4A. Należy upewnić się, że rozcieńczenia są wykonane w taki sposób, aby końcowe stężenia DMSO były takie same między terapiami lekowymi i mniejsze lub równe maksymalnemu dopuszczalnemu stężeniu DMSO określonemu w sekcji 5.
4. Przygotować płytkę stymulającą 5x Tl⁺ w oparciu o optymalne stężenie Tl⁺ określone w punkcie 4.
5. Załaduj płytki stymulacyjne komórki, związku i Tl ⁺ do FDSS. Ustaw protokół dwóch dodań, tak aby 20 μl serii związków o stężeniu 2x zostało dodane do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 20 μl buforu do oznaczania HBSS. Dodaj związki do płytki komórkowej i inkubuj do 20 minut. Należy zauważyć, że optymalny czas inkubacji związków w celu wykrycia najlepszego stosunku sygnału do tła można określić, przeprowadzając serię eksperymentów, w których wybiera się kilka różnych czasów inkubacji. Rejestruj podstawową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 sekund przed dodaniem 10 μl 5x buforu Tl ⁺ do każdego dołka płytki komórkowej. Powtórz eksperyment przez 3 oddzielne dni, aby ustalić odtwarzalność wyników.

7. Analiza szachownicy

1. W następnej serii eksperymentów jednorodność i odtwarzalność testu zostanie oceniona za pomocą analizy "szachownicy". Zazwyczaj inhibitor kontrolny jest powlekany w co drugiej studzience każdej kolumny i rzędu płytki 384-dołkowej, jak pokazano na rysunku 5A. Aby rygorystycznie ocenić hałas w teście, należy zastosować stężenie inhibitora EC₈₀. DMSO jest dodawany do innych studni jako sterowanie pojazdem. Strumień Tl⁺ w komórkach traktowanych DMSO i lekami służy do obliczenia wartości Z prime, statystycznej miary zmienności między studniami między dwiema populacjami studzienek. Z liczba pierwsza oblicza się według wzoru:
   Z liczba pierwsza = 1- (3SD_p + 3SD_n)/|średnia_p + średnia_n |
   gdzie SD jest odchyleniem standardowym, p jest strumieniem niehamowanym, a n jest wartościami strumienia w pełni inhibitowanego. Test z wartościami Z′ większymi lub równymi 0,5 przez 3 oddzielne dni jest uważany za odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
2. Płytki, barwnik załadować i umyć komórki na 384-dołkowych płytkach pokrytych aminami BD PureCoat, jak opisano powyżej w sekcji 3, pozostawiając 20 μl buforu do oznaczania HBSS w każdym dołku. Należy pamiętać, że cała płytka powinna być indukowana tetracykliną.
3. Sporządzić płytkę związek/DMSO przez pipetowanie do 384-dołkowej płytki polipropylenowej za pomocą pipetora wielokanałowego, 80 μl/basenik znanego inhibitora docelowego kanału Kir w stężeniu określonym w sekcji 6.5 i 0,1% v/v nośnika DMSO, jak pokazano na rysunku 5A. Dodać znany inhibitor, zaczynając od dołka A1 za pomocą pipetora wielokanałowego i naprzemiennie do dołka B2 i tak dalej, aż do dołka B24. Powtórz tę procedurę z DMSO, zaczynając w studzience B1 i tak dalej, aż do dołka A24. Ostateczny układ płyty powinien pasować do szachownicy.
4. Przygotuj płytkę stymulacyjną 5x Tl⁺ w oparciu o optymalną Tl⁺ określoną w sekcji 4.
5. Załaduj płytki stymulacyjne komórki, związku i Tl ⁺ do FDSS. Ustaw protokół dwóch dodań, tak aby 20 μl serii związków o stężeniu 2x zostało dodane do odpowiednich dołków płytki komórkowej zawierającej 20 μl buforu do oznaczania HBSS. Dodaj związki do płytki komórkowej i inkubuj do 20 minut w temperaturze pokojowej. Rejestruj podstawową fluorescencję FluoZin-2 przez co najmniej 10 sekund przed dodaniem 10 μl 5x buforu Tl ⁺ do każdego dołka płytki komórkowej. Powtórz eksperyment przez 3 oddzielne dni, aby ustalić odtwarzalność wyników.

8. Ekran pilota

1. W końcowym etapie opracowywania testu należy przeprowadzić pilotażowe badanie przesiewowe kilku tysięcy związków, aby ocenić działanie testu w warunkach, które ostatecznie zostaną wykorzystane w wielkoskalowym badaniu przesiewowym o wysokiej przepustowości.
2. Płytki, barwnik załadować i umyć komórki na 384-dołkowych płytkach BD PureCoat pokrytych aminami, jak opisano powyżej w sekcji 3), pozostawiając 20 μl buforu do oznaczania HBSS w każdym dołku. Należy pamiętać, że cała płytka powinna być hodowana przez noc z tetracykliną, aby wywołać ekspresję kanału Kir
.
3. Wybierz około 2 000 do 3 000 strukturalnie zróżnicowanych związków do testowania. Często właściwe i wygodne jest stosowanie zbiorów związków o znanej aktywności, potencjalnie wzbogaconych o modulatory kanałów jonowych. Do takich kolekcji należą Spectrum Collection (MicroSource) i LOPAC (Sigma). Ponadto rozsądnie jest uwzględnić na ekranie pilotażowym znane modulatory interesującego nas Kir. Idealnie byłoby, gdyby związki te były dodawane do studni w sposób zaślepiony, aby umożliwić bezstronne testowanie metod wybierania trafień opisanych później. Przygotować związki w 384-dołkowych płytkach polipropylenowych (płytkich docelowych) za pomocą Labcyte Echo Liquid Handler lub odpowiedniego narzędzia do szpilek, aby przenieść odpowiednią objętość wybranych związków w DMSO z kolekcji MLPCN (płytki źródłowe) na płytki docelowe Należy zauważyć, że badane związki znajdują się tylko w kolumnach 3-22; Do każdej innej studzienki w kolumnach 1, 2, 23, 24 dodać znany inhibitor o stężeniu, o którym wiadomo, że całkowicie hamuje Kir, jak określono w sekcji 7. W pozostałych studzienkach kolumn 1, 2, 23 i 24 dodać odpowiednią objętość DMSO, aby wytworzyć kontrole nośnika dopasowane do stężenia DMSO. Rozcieńczyć wszystkie studzienki buforem testowym za pomocą Multidrop Combi. Zazwyczaj badane związki będą miały 20 μM, 2-krotnie więcej niż ich docelowe stężenie przesiewowe.
4. Wykonaj płytki stymulacyjne Tl⁺ w oparciu o optymalne stężenie Tl⁺ określone w sekcji 4.
5. Uruchom ekran pilota. Należy zwrócić uwagę na rozłożenie etapów wykonywania protokołu, aby utrzymać stały czas między płytami w pilotażowym przebiegu przesiewowym.
6. Po zakończeniu ekranu pilotażowego przeanalizuj dołki szachownicy z kolumn 1, 2, 23 i 24 przy użyciu równania Z-prime. Sprawdź tabliczki, które pokazują wartości Z-prime mniejsze niż 0,5, aby określić źródło słabej separacji populacji kontrolnych. Trafienia można wybierać na wiele sposobów. W przypadku ekranów pilotażowych powszechne jest obliczanie średniej i odchylenia standardowego populacji kontrolnej pojazdu i wybieranie trafień na podstawie studzienek dających wartości >/= 3 odchylenia standardowe od średniej z elementów sterujących pojazdu.
7. Po wybraniu trafień przetestuj ponownie wybrane trafienia w dwóch egzemplarzach w 2 zestawach płyt. Jeden zestaw płytek zawiera stabilną komórkę Kir pod nieobecność tetracykliny, a drugi zawiera stabilną linię komórkową Kir w obecności tetracykliny. Trafienia, które dają wynik pozytywny na co najmniej jednej z dwóch płytek do ponownego testu i nie wykazują znaczącej aktywności na niewywołanych płytkach, mogą być uznane za zweryfikowane trafienia. Sprawdź zweryfikowaną listę trafień, aby określić, ile "ukrytych" próbek kontrolnych zostało wykrytych. Niewykrycie elementów sterujących na ekranie pilota wskazuje na potrzebę dalszej optymalizacji parametrów przesiewania lub wybierania trafień.

Results

Użycie systemu ekspresji indukowanego tetracykliną zapewnia wygodną wewnętrzną kontrolę do rozróżniania strumienia Tl⁺ przez szlaki endogenne i kanał Kir będący przedmiotem zainteresowania. Rysunek 1 przedstawia kilka przykładów map posiewu komórek stosowanych w różnych typach eksperymentów. Pozycje studzienek zawierających komórki nieindukowane lub indukowane tetracykliną są oznaczone różnymi kolorami. Rysunek 2A przedstawia mapę źródłową używaną do określenia optymalnego stę...

Discussion

Przetwarzanie danych: Po zebraniu danych częstym krokiem w analizie jest normalizacja odpowiedzi fluorescencyjnej każdego dołka, F, do jej początkowej wartości na początku eksperymentu, F₀. Jest to powszechnie określane jako "stosunek statyczny" i symbolizowane jako "F/F₀^". W przypadkach, gdy F₀ jest zdominowany przez barwnik wskaźnikowy, operacja współczynnika statycznego znacznie skoryguje wiele czynników, takich jak nierównomierności oświetlenia, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Wektor ekspresyjny indukowany tetracykliną
Komórki T-REx-HEK293	Invitrogen	R71007	Linia komórkowa indukowana tetracykliną
Lipofectamina LTX/Plus Odczynnik	Invitrogen	15338100	Transfekcja
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Pożywka do hodowli komórkowych
DMEM	Invitrogen	11965	Pożywka do hodowli komórkowych
Higromycyna B	Invitrogen	10687-010	Pożywka do hodowli komórkowych
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Pożywka do hodowli komórkowych
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140	Pożywka do hodowli komórkowych
Wolne od HBSS	Mediatech	21022CV	Mycie komórek
Trypsyna-0,25%	Mediatech	25053CI	Dysocjacja komórek
Tetracyklina-HCl	Sigma	T9823	Odczynnik indukcyjny
Dializowany FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Media galwaniczne
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Barwnik fluorescencyjny
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Ładowanie barwnika
HBSS	Invitrogen	14175	Bufor testowy
HEPES	Invitrogen	15630	Bufor testowy
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ bufor bodźca
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ bufor bodźca
CaSO4∙ 2H2O	Sigma	C3771	Tl+ bufor bodźcowy
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ bufor bodźcowy
	Aldrich	204625	Tl+ bufor bodźca
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ bufor bodźca
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Ośmiokanałowy pipet elektroniczny	Biohit	E300	Powlekanie komórek na płytkach 384-dołkowych
BD PureCoat powlekane aminą płytki 384-dołkowe	BD Biosciences	356719	Mikropłytki testowe
Kwalifikowana przez Echo 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa (384PP)	Labcyte	P-05525	Mikropłytki ze źródłem związków
384-dołkowy polipropylen mikropłytki	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Dozownik odczynników Combi	Thermo Scientific	5840300
ELx405 myjka do mikropłytek	BioTek	ELx405HT	Automatyczne mycie komórek
Obsługa cieczy Echo	Labcyte Labcyte	Echo 550
Bravo zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy	Agilent Technologies	Model standardowy
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Czytnik płytek do obrazowania kinetycznego
Tabela 1. Wykaz materiałów i odczynników.