Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Sunandan Saha; Yozo Nakazawa; Leslie E. Huye; Joseph E. Doherty; Daniel L. Galvan; Cliona M. Rooney; Matthew H. Wilson

doi:10.3791/4235

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

16.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4235

⸱

5 listopada 2012

Sunandan Saha¹^,² , Yozo Nakazawa³ , Leslie E. Huye⁴^,⁵ , Joseph E. Doherty²^,⁶ , Daniel L. Galvan² , Cliona M. Rooney⁴^,⁵^,⁷ , Matthew H. Wilson¹^,²^,⁴^,⁸

¹Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , ²Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , ³Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, ⁴Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , ⁵Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , ⁶Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , ⁷Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , ⁸Michael E. DeBakey VA Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Streszczenie

System transpozonowy piggyBac jest naturalnie aktywny i pochodzi pierwotnie od ciemnicy kapuśnianej^1,2. Ten niewirusowy system opiera się na plazmidach, najczęściej wykorzystując dwa plazmidy: jeden wykazujący ekspresję enzymu transpozazy piggyBac oraz plazmid transpozonowy zawierający interesujące geny pomiędzy elementami powtórzeń odwróconych, które są niezbędne do aktywności transferu genów. PiggyBac pośredniczy w transferze genów poprzez mechanizm „wycięcia i wklejenia”, w którym transpozaza integruje segment transpozonu z genomem docelowych komórek. PiggyBac wykazał wydajną aktywność dostarczania genów w szerokim spektrum komórek owadów^1,2, ssaków^3-5 oraz ludzi6, w tym w pierwotnych ludzkich limfocytach T^7,8. Niedawno opracowano hiperaktywną transpozazę piggyBac , która poprawiła wydajność transferu genów^9,10.

Ludzkie limfocyty T stanowią przedmiot zainteresowania klinicznego w kontekście adoptywnej immunoterapii nowotworów¹¹. Warto zauważyć, że zatwierdzono pierwsze badanie kliniczne obejmujące modyfikację ludzkich komórek T za pomocą systemu transpozonu Sleeping beauty¹². Wcześniej ocenialiśmy użyteczność piggyBac jako niewirusowej metody modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T. Stwierdziliśmy, że piggyBac jest efektywny w modyfikacji genetycznej ludzkich komórek T za pomocą genu reporterowego oraz nieimmunogennego indukowalnego genu samobójczego⁷. Analiza miejsc integracji genomowej wykazała brak preferencji dla integracji w obrębie lub w pobliżu znanych protoonkogenów¹³. Wykorzystaliśmy piggyBac do modyfikacji genetycznej cytotoksycznych limfocytów T w celu wprowadzenia chimerycznego receptora antygenowego skierowanego przeciwko antygenowi nowotworowemu HER2 i stwierdziliśmy, że zmodyfikowane genetycznie komórki T pośredniczą w ukierunkowanym zabijaniu komórek nowotworowych HER2-dodatnich in vitro oraz in vivo w ortotopowym modelu mysim¹⁴. Wykorzystaliśmy również piggyBac do generowania ludzkich komórek T opornych na rapamycynę, co powinno być użyteczne w terapiach przeciwnowotworowych, w których stosuje się rapamycynę¹⁵.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania piggyBac do modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T. Procedura obejmuje izolację monocytów krwi obwodowej (PBMC) z ludzkiej krwi, a następnie hodowlę, modyfikację genetyczną oraz aktywację limfocytów T. Na potrzeby niniejszego raportu limfocyty T zostały zmodyfikowane za pomocą genu reporterowego (eGFP) w celu analizy i kwantyfikacji ekspresji genów metodą cytometrii przepływowej.

PiggyBac można wykorzystać do modyfikacji ludzkich limfocytów T za pomocą różnych genów zainteresowania. Chociaż wykorzystaliśmy piggyBac do kierowania limfocytów T przeciwko antygenom nowotworowym¹⁴wykorzystaliśmy również piggyBac w celu wprowadzenia indukowalnego przełącznika bezpieczeństwa, pozwalającego na eliminację zmodyfikowanych genetycznie komórek w razie potrzeby⁷Duża pojemność ładunkowa piggyBac umożliwiło również transfer genu dużej cząsteczki mTOR (15 kb) opornej na rapamycynę¹⁵W związku z tym przedstawiamy niewirusową metodologię stabilnej modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T do szerokiego zakresu zastosowań.

Protokół

Dzień 0

1. Izolacja PBMC z ludzkiej krwi

Pobrać 20 ml świeżej krwi ludzkiej drogą nakłucia żyły do probówek vacutainer z heparyną sodową (Na-heparin).
Wymieszać krew z pożywką Advanced RPMI 1,640 w stosunku 1:1 (v/v).
Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml nalać 20 ml medium lymphoprep (25 °C). Powoli nanieść 25-30 ml mieszaniny krwi i RPMI 1,640 na powierzchnię lymphoprep.
Wirować przy 400 x g przez 40 min bez hamowania.
Zebrać obie warstwy (wyraźną oraz rozmytą) za pomocą jednorazowej pipety do 10 ml 1x PBS (25 °C), a następnie uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.
Wirować przy 450 x g przez 10 min.
Całkowicie odessać nadsącz i dodać 20 ml Advanced RPMI 1,640.
Wirować przy 400 x g przez 5 min.
Odessać nadsącz. Dodać 10 ml kompletnej pożywki do limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml rhIL-15, uprzednio ogrzanej do 37 °C.
Policzyć komórki i wysiać je do 24-dołkowej płytki hodowlanej w zagęszczeniu 2 x 10⁶ komórek/dołek w kompletnej pożywce do limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml rhIL-15. Do sąsiednich dołków dodać wodę sterylną. Inkubować przez noc w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

Dzień 1

2. Powlekanie płytek przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3 w celu stymulacji limfocytów T

Rozcieńczyć przeciwciała anty-CD28 i anty-CD3 w sterylnej wodzie do stężenia 1 μg/ml dla każdego z nich.
Dodać po 500 μl każdego roztworu przeciwciał do 5 oznaczonych studzienek niepowlekanej 24-dołkowej płytki hodowlanej.
Pozostałe studzienki uzupełnić sterylną wodą. Owinąć płytkę folią termokurczliwą i umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C.

3. Nuklefekcja niestymulowanych limfocytów T

Podgrzać pożywkę do limfocytów T do 37 °C i uzupełnić o 5 ng/ml rhIL-15. Przygotować pełny roztwór do nukleofekcji, dodając 500 μl Nucleofector Supplement 1 do 2,25 ml roztworu Nucleofector.
Odmiarkować po 5 μg transpozonu (Zeo-pT-CMV-eGFP) i transpozazy (pCMV-piggyBac) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uwaga: może być konieczna optymalizacja ilości DNA transpozazy i transpozonu w celu zapewnienia optymalnej dostawy genów i zminimalizowania toksyczności komórkowej. Plazmidy można uzyskać od autorów na prośbę.
Zebrać PBMC z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej do probówki 50 ml. Policzyć liczbę komórek. Odłożyć 2 x 10⁶ komórek do wykorzystania jako kontrola podczas cytometrii przepływowej.
Przenieść od 7 do 10 x 10⁶ komórek do probówki 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 min, odessać nadsącz i rozbić osad poprzez lekkie uderzanie palcem w dno probówki.
Dodać 100 μl pełnego roztworu do nukleofekcji limfocytów T do rozluźnionego osadu komórkowego.
Przenieść mieszaninę roztworu i komórek do probówki zawierającej plazmidy.
Przenieść mieszaninę roztworu, komórek i plazmidów na dno kuwety do nukleofekcji. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
Przeprowadzić nukleofekcję komórek, korzystając z programu U-014 (Unstimulated T cells, human, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/).
Natychmiast dodać do kuwety 500 μl podgrzanej pożywki z rhIL-15. Przenieść komórki do dołka płytki 24-dołkowej zawierającego 1,5 ml podgrzanej pożywki z rhIL15.
Inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂.

Dzień 2

4. Nieswoista stymulacja limfocytów T

Zebrać komórki i określić ich liczbę. Odstawić 0,5 x 10⁶ komórek do cytometrii przepływowej w celu określenia częstotliwości występowania komórek GFP-dodatnich. Jako kontrole wykorzystać nieprzestransfekowane PBMC.
Odssać roztwór przeciwciał CD3/28 z płytki niezakładanej do hodowli tkankowej i przepłukać każdą studzienkę pożywką do limfocytów T.
Resuspender nukleofektowane komórki w stężeniu 0,5 x 10⁶ komórek na ml w pełnej pożywce do CTL uzupełnionej o 5 ng/ml rhIL-15. Do 4 studzienek płytki niezakładanej do hodowli tkankowej dodać po 2,0 ml nukleofektowanych komórek. Do 5^th studzienki dodać 0,5 x 10⁶ komórek nienukleofektowanych.
Inkubować przez 3 dni w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

Dzień 5

Zebrać stymulowane limfocyty T z niepowlekanej płytki hodowlanej.
Policzyć i ponownie wysiać komórki na powlekaną płytkę hodowlaną z 24 dołkami w zagęszczeniu 0.7 x 10⁶ cells/ml w pożywce dla limfocytów T z dodatkiem 5 ng/ml IL-15.

Dzień 7

7. Analiza ekspresji genów

Zebrać komórki, barwić przeciwciałem anty-CD8 przeciwko ludzkim antygenom (można również zastosować anty-CD3 i anty-CD4), a następnie przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu oznaczenia % ekspresji GFP.

Dzień 8 (Opcjonalnie)

8. Ekspansja limfocytów T

W 8. dniu po transfekcji limfocyty T można przesiać do pożywki dla limfocytów T z dodatkiem IL-15 w zagęszczeniu 0.7 x 10⁶ komórek na dołek w celu ich dalszej ekspansji¹⁶.