Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Podsumowanie

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Streszczenie

Równomierny rozdział chromosomów między dwie komórki potomne podczas podziału komórkowego jest warunkiem koniecznym dla zapewnienia stabilności genetycznej ¹. Błędy podczas segregacji chromosomów są cechą charakterystyczną dla procesów nowotworowych i wiążą się z progresją choroby ^2-4. Punkt kontrolny zgrupowania wrzeciona (SAC) jest mitotycznym mechanizmem nadzorczym, który wstrzymuje komórki w metafazie do momentu, aż każdy pojedynczy chromosom ustanowi stabilne dwubiegunowe połączenie z wrzecionem podziałowym¹. SAC pełni swoją funkcję poprzez interferencję z aktywującą podjednostką APC/C Cdc20, co blokuje proteolizę sekuryny i cykliny B, a tym samym uniemożliwia separację chromosomów i wyjście z mitozy. Nieprawidłowe przytwierdzenie chromosomów zapobiega wyciszeniu sygnalizacji SAC i powoduje ciągłe hamowanie APC/C^Cdc20 , aż do rozwiązania problemu, aby uniknąć błędnej segregacji chromosomów, aneuploidii i rozrostów nowotworowych¹.

Większość badań dotyczących wpływu nieprawidłowego przyczepienia chromosomów na proteolizę zależną od APC/C wykorzystywała zaburzenia wrzeciona za pomocą leków depolimeryzujących lub stabilizujących mikrotubule, aby zakłócić przyczepienie chromosomów do mikrotubul. Ponieważ ingerencja w kinetykę mikrotubul może wpływać na transport i lokalizację kluczowych regulatorów, procedury te niosą ryzyko wywołania efektów sztucznych ⁵.

Aby zbadać, w jaki sposób SAC zakłóca zależną od APC/C proteolizę cykliny B podczas mitozy w niezakłóconych populacjach komórek, opracowaliśmy system oparty na histonie H2-GFP, który umożliwił jednoczesne monitorowanie ustawienia chromosomów mitotycznych w metafazie oraz proteolizy cykliny B ⁶.

Aby zobrazować profile proteolityczne, stworzyliśmy chimeryczną cząsteczkę reporterową cykliny B z domeną SNAP na C-końcu ⁶ (Rysunek 1). W reakcji samoznakowania domena SNAP jest w stanie tworzyć wiązania kowalencyjne z nośnikami alkilguaniny (substratem SNAP) ^7,8 (Rysunek 1). Cząsteczki substratu SNAP są łatwo dostępne i niosą szerokie spektrum różnych fluorochromów. Chimeryczne cząsteczki cykliny B-SNAP zostają znakowane po dodaniu do medium wzrostowego przenikającego przez błony substratu SNAP ⁷ (Rysunek 1). Po reakcji znakowania intensywność fluorescencji cykliny B-SNAP spada w sposób przypominający reakcję typu pulse-chase, a intensywność fluorescencji odzwierciedla poziom degradacji cykliny B ⁶ (Rysunek 1). Nasz system ułatwia monitorowanie mitotycznej proteolizy zależnej od APC/C w dużej liczbie komórek (lub w kilku populacjach komórek) równolegle. W związku z tym system ten może być cennym narzędziem do identyfikacji czynników/małych cząsteczek zdolnych do zakłócania aktywności proteolitycznej podczas przejścia z metafazy do anafazy. Ponadto, ponieważ niedawno zasugerowano, że synteza cykliny B podczas mitozy jest istotnym mechanizmem sprzyjającym blokadzie mitotycznej u myszy i ludzi poprzez utrzymywanie stabilnych poziomów ekspresji cykliny B ^9,10, system ten umożliwił nam analizę proteolizy cykliny B jako jednego z elementów zrównoważonej równowagi ⁶.

Protokół

1. Wysiewanie komórek reporterowych Cyclin B-SNAP opartych na linii U2OS (komórki klonu 11 ⁶) na szkiełkach z komorą mikroskopową

1. Poddać trypsynizacji subkonfluencyjne komórki raportrowe SNAP, które rosły asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 hr.
2. Użyć komór mikroskopowych 8-dołkowych (w celu zapewnienia stałego rozkładu komórek).

W celu wysiania komórek do 8-dołkowych komór mikroskopowych przy zachowaniu stałego rozkładu na całej powierzchni komory, odwiruj 10 000 komórek i resuspenduj je w 350 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę/streptomycynę oraz pirogronian sodu). Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej (Rysunek 2).

Praca z 8-dołkowymi komorami mikroskopowymi (maksymalna gęstość komórek w centrum).

Aby wysiać komórki z większą gęstością w centrum komory mikroskopowej, należy wypełnić komorę 300 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Następnie ostrożnie dodać 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej (Rysunek 2).

Praca z specjalnymi płytkami optycznymi 96-dołkowymi (stały rozkład komórek).

W celu wysiania komórek na płytki 96-dołkowe przy zachowaniu stałego rozkładu na całej powierzchni dołka, odwiruj 5 000 komórek i resuspenduj je w 300 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 96-dołkową. W zależności od całkowitej liczby wymaganych dołków z komórkami, dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość pożywki do resuspensji (Rycina 2).

Praca z 96-dołkowymi płytkami do specjalnej optyki (maksymalna gęstość komórek w centrum).

W celu wysiewania komórek na płytki 96-dołkowe, ostrożnie nanieś 1 500 komórek w 15 μl zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli na środek każdego dołka, aby ograniczyć wzrost komórek do centralnej części dołka (Rycina 2).

3. Pozostawić wysiane komórki do wzrostu przez co najmniej 18 hr w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 100% wilgotności powietrza, 5% CO₂).

2. Barwienie komórek reporterowych substratem SNAP

1. Na 30 min przed rozpoczęciem procedury barwienia należy ogrzać alikwoty zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37 °C.
2. W celu ułatwienia pracy z substratem SNAP (w naszym przypadku TMR Star), rozpuścić TMR Star w DMSO, aby uzyskać w roztworze stokowym stężenie 400 μM; roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przed barwieniem rozcieńczyć 0,5 μl roztworu stokowego TMR Star w 200 μl zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby uzyskać końcowe stężenie znakowania 1 μM.
4. Usunąć zwykłą pożywkę wzrostową z komórek rosnących asynchronicznie i inkubować w pożywce do znakowania przez 25 min w standardowych warunkach hodowli.
5. Usunąć pożywkę do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie zwykłą pożywką wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C). Inkubować komórki w 300 μl zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C) przez 30 min. Przed transportem do mikroskopu zastąpić pożywkę świeżą zwykłą pożywką wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu SNAP.
6. Transportować komórki do mikroskopu w pudełku styropianowym na wstępnie ogrzanym (37 °C) bloku grzewczym, aby zminimalizować wahania temperatury.

3. Pomiar intensywności fluorescencji

1. Na dwie godziny przed analizą ustaw temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie osuszania, aby doprowadzić cały mikroskop wraz ze wszystkimi jego komponentami do pożądanej temperatury. Podgrzanie przed ustawieniem wilgotności jest istotne, aby uniknąć kondensacji i wynikającego z niej uszkodzenia mikroskopu.
2. Przed rozpoczęciem analizy ustaw wilgotność powietrza na 60% oraz stężenie CO₂ na 5%.
3. Uruchom oprogramowanie Scan^R Acquisition i zdefiniuj standardowe ustawienia (patrz Tabela 1).
4. Zdefiniuj pozycje studzienek przeznaczonych do analizy.
5. Zdefiniuj Δt (czas cyklu akwizycji) oraz całkowitą liczbę cykli akwizycji.
6. W przypadku chęci analizy większej liczby studzienek wybierz sprzętowy autofokus, w przeciwnym razie wystarczające jest użycie samego autofokusu programowego.
7. Rozpocznij akwizycję i nadzoruj proces przez pierwsze dwa cykle. Mikroskop ustawi ostrość na sygnał histony H2-GFP, a następnie wykona pierwsze zdjęcie w tym kanale przed zmianą filtra i wykonaniem odpowiadającego mu zdjęcia TMR Star (Rysunek 3). Operacja ta jest powtarzana dla wszystkich pozycji w obrębie studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek, przed ponownym rozpoczęciem kolejnego cyklu.

4. Analiza profili proteolitycznych przy użyciu Scan^R

1. Uruchom oprogramowanie Scan^R Analysis i przeanalizuj obrazy, definiując jądra komórkowe wizualizowane za pomocą histony H2-GFP jako obiekty główne, stosując próg oparty na intensywności sygnału oraz algorytm watershed w celu wspomagania separacji sąsiadujących komórek. Do analizy TMRstar należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. (Kluczowymi właściwościami obiektu głównego są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla obiektu głównego, a dla subobiektu TMRstar — całkowita intensywność podzielona przez pole powierzchni). Ze względu na duże ilości danych proces tej analizy może trwać kilka godzin.
2. Przejdź do trybu śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR Star subobiektu w czasie (ślady komórkowe) przypisaną do przeanalizowanych obiektów głównych (Ryc. 4). Liczbę komórek do badania można zawęzić poprzez bramkowanie (gating) pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością H2-GFP. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszego reprezentatywnego i obiektywnego obrazu (Ryc. 4).
3. Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histony H2-GFP i TMR Star na poziomie pojedynczej komórki (Ryc. 5A).
4. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybranej komórce i wygeneruj eksportowalną galerię zdjęć służącą do ilustracji histony H2-GFP oraz cykliny B-SNAP TMR Star dla każdego punktu czasowego.
5. Przejdź do trybu populacyjnego oprogramowania Scan^R Analysis i obramuj obszar, w którym wybrana komórka jest reprezentowana na wykresie punktowym X vs. Y (Ryc. 5B).
6. Zastosuj nowe okno wykresu punktowego do obramowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR Star w czasie (Ryc. 5C).
7. Wyeksportuj dane (czas i intensywność fluorescencji) do programu Microsoft Excel w celu dalszych obliczeń.

5. Reprezentatywne wyniki

Rycina 5D i 5E przedstawiają kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR Star, komórki przechodzącej prawidłową mitozę bez oznak błędnego ustawienia chromosomów (Rycina 5E). Po zagęszczeniu cytoplazmy następującym po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD, zaznaczony czerwonym trójkątem), intensywność fluorescencji TMR Star wykazuje gwałtowny wzrost aż do osiągnięcia okna izomorficznego (jaśniejszy obszar na wykresie), gdy komórka wchodzi w prometafazę ⁶. Intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie, dopóki komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna szybko spadać, gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową (Rycina 5D i 5E). Spadek ten poprzedza rozdzielenie chromosomów podczas anafazy (niebieska kropka na krzywej). W późnej fazie mitozy chromatyna zaczyna się dekondensować (niebieskie paski), a komórka przyjmuje morfologię interfazy, podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji zbliża się do plateau, które jest niższe niż plateau przed mitozą (Rycina 5D i 5E).

Ustawienia autofokusa	Histon H2-GFP (główne ustawienia akwizycji obiektów)	Cyklina B-SNAP znakowana TMR Star (ustawienia akwizycji)	Czas cyklu akwizycji Powtórzenia
Wstępny autofokus +/-39 μm 24 warstwy Precyzyjny autofokus +/-5.4 μm 14 warstw	Zestaw filtrów GFP: Czas ekspozycji: 100 msec Intensywność światła: 25%	Zestaw filtrów TRITC: Czas ekspozycji: 150 msec Intensywność światła: 33.3%	od 2 do 5 min.
Zestaw filtrów GFP: Czas ekspozycji: 12 msec Intensywność światła: 12.5%			Do 48 hr ciągłej analizy (ograniczone obniżoną wilgotnością powietrza do 60%)

Tabela 1. Standardowe ustawienia stosowane podczas analizy proteolizy cykliny B. Histona H2-GFP została wykorzystana jako struktura referencyjna do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania dla pomiaru intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP. Intensywność światła podczas procedury ogniskowania jest niższa w porównaniu do ustawień akwizycji obrazu, aby uniknąć kumulatywnej fototoksyczności.

Rysunek 1. Schemat pomiaru proteolizy cykliny B poprzez ekspresję chimerycznej pochodnej cykliny B o charakterystyce degradacji zbliżonej do białka endogennego. Spadek intensywności fluorescencji po znakowaniu metodą pulse-chase jest miarą aktywności APC/C.

Rysunek 2. Analiza komórek na szkiełkach z 8 dołkami lub płytkach 96-dołkowych. Równomierny rozkład komórek na powierzchni dołka uzyskuje się poprzez resuspensję w końcowej objętości 300 μl; metoda ta jest zalecana, jeśli do analizy definiuje się ręcznie tylko jedną lub kilka pozycji. Zagęszczenie komórek w regionie centralnym uzyskuje się poprzez dodanie komórek do centrum wypełnionych lub pustych dołków. Technika ta jest zalecana w przypadku zautomatyzowanej akwizycji obrazów w różnych dołkach.

Rycina 3. Sekwencja akwizycji danych. A) Detekcja histony H2-GFP służy do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania oraz monitorowania ustawienia chromosomów podczas mitozy. B) Intensywność fluorescencji barwnika TMR Star jest miarą bezwzględnej ilości cykliny B-SNAP znakowanej metodą pulse-chase.

Rycina 4. Przedstawienie średnich intensywności fluorescencji TMR Star (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez powierzchnię) w czasie, wygenerowane przez oprogramowanie Scan^R Analysis. Wybór reprezentatywnego śladu komórki (niebieski). Odpowiadające mu obrazy (po prawej stronie) umożliwiają jednoczesną wizualizację histony H2-GFP (zielony) i cykliny B-SNAP (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rysunek 5. A+B) Przykład wyznaczania bramki (gating) dla punktów reprezentujących komórkę zainteresowania na wykresie kropkowym XY. C) Wizualizacja średniej intensywności fluorescencji TMRstar (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez powierzchnię) w czasie za pomocą wykresu kropkowego. D+E) Reprezentatywna krzywa intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP z izomorficznym oknem (jaśniejszy obszar na wykresie) pomiędzy NEBD (rozpadem otoczki jądrowej) a dekondensacją chromatyny (niebieski pasek), wygenerowana w programie Microsoft Excel. Anafaza jest zaznaczona niebieskim punktem na krzywej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Film 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić dodatkowy film.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj podejście oparte na obrazowaniu żywych komórek, które umożliwia jednoczesne monitorowanie proteolizy cykliny B oraz ustawienia chromosomów. Metoda ta pozwala na badanie kontroli mitozy w niezakłóconych populacjach komórek na poziomie pojedynczej komórki. Krzywe degradacji cykliny B umożliwiają bezpośredni wgląd w aktywność APC/C, a tym samym pośrednio odzwierciedlają stan SAC ⁶.

To podejście, mimo że opracowane w oparciu o oprogramowanie Scan^R, można łatwo odtw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórek reporterowych	stworzona wewnętrznie zgodnie z opisem 6	komórki reporterowe klonu 11 (komórki oparte na linii U2Os ekspresujące cyclin B-SNAP)
Retrowirusowy wektor ekspresyjny cyclin B-SNAP	stworzony wewnętrznie zgodnie z opisem 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
DMEM bez czerwieni fenolowej	Gibco	21063-029	Wymagana suplementacja FCS, pirogronianem sodu oraz penicyliną/streptomycyną
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Roztwór zapasowy 400 μM w DMSO
Specjalna płytka Opstics, 96 dołków	Costar	3720
μ-Slide 8 dołków, ibiTreat	Ibidi	80826
Urządzenie mikroskopowe	Olympus	mikroskop odwrócony IX-81 z komorą klimatyczną
Obiektyw	Olympus	obiektyw UPLSAPO 20x (N.A. 0,75)
Oprogramowanie do akwizycji	Olympus	oprogramowanie do akwizycji Scan^R (v.2.2.09)
Oprogramowanie do analizy	Olympus	oprogramowanie do analizy Scan^R (v.1.2.0.6)