Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Równomierny rozdział chromosomów między dwie komórki potomne podczas podziału komórkowego jest warunkiem koniecznym dla zapewnienia stabilności genetycznej 1. Błędy podczas segregacji chromosomów są cechą charakterystyczną dla procesów nowotworowych i wiążą się z progresją choroby 2-4. Punkt kontrolny zgrupowania wrzeciona (SAC) jest mitotycznym mechanizmem nadzorczym, który wstrzymuje komórki w metafazie do momentu, aż każdy pojedynczy chromosom ustanowi stabilne dwubiegunowe połączenie z wrzecionem podziałowym1. SAC pełni swoją funkcję poprzez interferencję z aktywującą podjednostką APC/C Cdc20, co blokuje proteolizę sekuryny i cykliny B, a tym samym uniemożliwia separację chromosomów i wyjście z mitozy. Nieprawidłowe przytwierdzenie chromosomów zapobiega wyciszeniu sygnalizacji SAC i powoduje ciągłe hamowanie APC/CCdc20 , aż do rozwiązania problemu, aby uniknąć błędnej segregacji chromosomów, aneuploidii i rozrostów nowotworowych1.
Większość badań dotyczących wpływu nieprawidłowego przyczepienia chromosomów na proteolizę zależną od APC/C wykorzystywała zaburzenia wrzeciona za pomocą leków depolimeryzujących lub stabilizujących mikrotubule, aby zakłócić przyczepienie chromosomów do mikrotubul. Ponieważ ingerencja w kinetykę mikrotubul może wpływać na transport i lokalizację kluczowych regulatorów, procedury te niosą ryzyko wywołania efektów sztucznych 5.
Aby zbadać, w jaki sposób SAC zakłóca zależną od APC/C proteolizę cykliny B podczas mitozy w niezakłóconych populacjach komórek, opracowaliśmy system oparty na histonie H2-GFP, który umożliwił jednoczesne monitorowanie ustawienia chromosomów mitotycznych w metafazie oraz proteolizy cykliny B 6.
Aby zobrazować profile proteolityczne, stworzyliśmy chimeryczną cząsteczkę reporterową cykliny B z domeną SNAP na C-końcu 6 (Rysunek 1). W reakcji samoznakowania domena SNAP jest w stanie tworzyć wiązania kowalencyjne z nośnikami alkilguaniny (substratem SNAP) 7,8 (Rysunek 1). Cząsteczki substratu SNAP są łatwo dostępne i niosą szerokie spektrum różnych fluorochromów. Chimeryczne cząsteczki cykliny B-SNAP zostają znakowane po dodaniu do medium wzrostowego przenikającego przez błony substratu SNAP 7 (Rysunek 1). Po reakcji znakowania intensywność fluorescencji cykliny B-SNAP spada w sposób przypominający reakcję typu pulse-chase, a intensywność fluorescencji odzwierciedla poziom degradacji cykliny B 6 (Rysunek 1). Nasz system ułatwia monitorowanie mitotycznej proteolizy zależnej od APC/C w dużej liczbie komórek (lub w kilku populacjach komórek) równolegle. W związku z tym system ten może być cennym narzędziem do identyfikacji czynników/małych cząsteczek zdolnych do zakłócania aktywności proteolitycznej podczas przejścia z metafazy do anafazy. Ponadto, ponieważ niedawno zasugerowano, że synteza cykliny B podczas mitozy jest istotnym mechanizmem sprzyjającym blokadzie mitotycznej u myszy i ludzi poprzez utrzymywanie stabilnych poziomów ekspresji cykliny B 9,10, system ten umożliwił nam analizę proteolizy cykliny B jako jednego z elementów zrównoważonej równowagi 6.
Protokół
1. Wysiewanie komórek reporterowych Cyclin B-SNAP opartych na linii U2OS (komórki klonu 11 6) na szkiełkach przedmiotowych z komorą do mikroskopu
- Poddać trypsynizacji subkonfluentne komórki reporterowe SNAP, którym pozwolono rosnąć asynchronicznie w fazie logarytmicznej przez co najmniej 48 hr.
- Pracować z komorami mikroskopowymi z 8 dołkami (zapewnia to stały rozkład komórek).
Aby wysiać komórki do 8-dołkowych komór mikroskopowych przy zachowaniu stałego rozkładu na całej powierzchni komory, odwiruj 10 000 komórek i resuspenduj je w 350 μl zwykłej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę/streptomycynę i pirogronian sodu). Przenieś zawiesinę komórkową do komory mikroskopowej (Rysunek 2).
Praca z komorami mikroskopowymi z 8 dołkami (maksymalna gęstość komórek w centrum).
Aby wysiać komórki z większą gęstością w centrum komory mikroskopowej, napełnić komorę 300 μl normalnego pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Ostrożnie dodać 5 000 komórek do centrum komory mikroskopowej (Rysunek 2).
Praca z 96-dołkowymi płytkami do specjalnej optyki (stały rozkład komórek).
W celu wysiewania komórek na płytki 96-dołkowe z zapewnieniem stałego rozkładu na całej powierzchni dołka, odwiruj 5 000 komórek i resuspenderuj w 300 μl standardowej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej. Przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 96-dołkową. W zależności od wymaganej całkowitej liczby dołków z komórkami, dostosuj liczbę komórek oraz całkowitą objętość pożywki do resuspensji (Rycina 2).
Praca z 96-dołkowymi płytkami do specjalnej optyki (maksymalna gęstość komórek w centrum).
W celu wysiania komórek na płytki 96-dołkowe, należy ostrożnie dodać 1 500 komórek w 15 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej w postaci małej kropli do środka każdego dołka, aby ograniczyć wzrost komórek do centrum dołka (Rycina 2).
- Pozostawić zasiane komórki do wzrostu przez co najmniej 18 hr w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 100% wilgotności powietrza, 5% CO2).
2. Barwienie komórek reporterowych substratem SNAP
- Na 30 min przed rozpoczęciem procedury barwienia należy ogrzać alikwoty normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej do 37 °C.
- W celu łatwiejszego dozowania substratu SNAP (w naszym przypadku TMR Star), należy rozpuścić TMR Star w DMSO do uzyskania stężenia w roztworze stokowym wynoszącego 400 μM; roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przed barwieniem należy rozcieńczyć 0,5 μl roztworu stokowego TMR Star w 200 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby uzyskać końcowe stężenie znakowania wynoszące 1 μM.
- Z komórek rosnących asynchronicznie należy usunąć normalną pożywkę wzrostową i inkubować je w pożywce do znakowania przez 25 min w standardowych warunkach hodowli.
- Należy usunąć pożywkę do znakowania i przemyć komórki czterokrotnie normalną pożywką wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C). Komórki należy inkubować w 300 μl normalnej pożywki wzrostowej bez czerwieni fenolowej (37 °C) przez 30 min. Przed przeniesieniem do mikroskopu należy wymienić pożywkę na świeżą normalną pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej (37 °C), aby usunąć pozostałości niezwiązanego substratu SNAP.
- Komórki należy transportować do mikroskopu w pudełku styropianowym na wstępnie ogrzanym (37 °C) bloku grzejnym, aby zminimalizować wahania temperatury.
3. Pomiar intensywności fluorescencji
- Na dwie godziny przed analizą ustaw temperaturę powietrza w komorze klimatycznej na 37 °C w trybie suchego powietrza, aby doprowadzić cały mikroskop wraz ze wszystkimi jego komponentami do pożądanej temperatury. Wstępne podgrzanie przed ustawieniem wilgotności jest istotne, aby uniknąć kondensacji i w konsekwencji uszkodzenia mikroskopu.
- Przed rozpoczęciem analizy ustaw wilgotność powietrza na 60% oraz stężenie CO2 na 5%.
- Uruchom oprogramowanie Scan^R Acquisition i zdefiniuj standardowe ustawienia (patrz Tabela 1).
- Zdefiniuj pozycje studzienek przeznaczonych do analizy.
- Zdefiniuj Δt (czas cyklu akwizycji) oraz absolutną liczbę cykli akwizycji.
- Jeśli planowana jest analiza większej liczby studzienek, wybierz sprzętowy autofokus; w przeciwnym razie wystarczy zastosować sam autofokus programowy.
- Rozpocznij akwizycję i nadzoruj pierwsze dwa cykle. Mikroskop ustawi ostrość na sygnał histony H2-GFP, a następnie wykona pierwszy obraz w tym kanale przed zmianą filtra i zarejestrowaniem odpowiadającego mu obrazu TMR Star (Rycina 3). Procedura ta jest powtarzana dla wszystkich pozycji w obrębie studzienki oraz dla każdej z badanych studzienek, a następnie cały cykl zostaje powtórzony.
4. Analiza profili proteolitycznych przy użyciu Scan^R
- Uruchom oprogramowanie Scan^R Analysis i przeanalizuj obrazy, definiując jądra komórkowe widoczne dzięki histonie H2-GFP jako obiekty główne, stosując próg oparty na intensywności sygnału oraz algorytm watershed w celu oddzielenia sąsiadujących komórek. Do analizy TMRstar należy utworzyć subobiekt składający się z jądra wraz z cytoplazmą. (Kluczowymi właściwościami obiektu głównego są pozycje X i Y, czas oraz maksymalna i średnia intensywność GFP dla obiektu głównego, a także całkowita intensywność podzielona przez pole powierzchni dla subobiektu TMRstar). Ze względu na duże ilości danych proces analizy ten może potrwać kilka godzin.
- Przejdź do trybu śledzenia (trace mode), aby zwizualizować średnią intensywność fluorescencji TMR Star subobiektu w czasie (ślady komórkowe) przypisaną do analizowanych obiektów głównych (Rysunek 4). Liczbę badanych komórek można ograniczyć poprzez bramkowanie pomiarów trwających co najmniej 140 cykli i charakteryzujących się wysoką maksymalną intensywnością H2-GFP. Analiza większej liczby komórek pozwala na uzyskanie pierwszej reprezentatywnej i obiektywnej oceny (Rysunek 4).
- Wybierz interesujący ślad komórkowy, aby jednocześnie zwizualizować fluorescencję histony H2-GFP i TMR Star na poziomie pojedynczej komórki (Rysunek 5A).
- Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybranej komórce i wygeneruj eksportowalną galerię obrazów ilustrujących histon H2-GFP oraz cyklinę B-SNAP TMR Star dla każdego punktu czasowego.
- Przełącz oprogramowanie Scan^R Analysis w tryb populacyjny i obramuj obszar (gate), w którym wybrana komórka jest reprezentowana na wykresie kropkowym X vs. Y (Rysunek 5B).
- Zastosuj nowe okno wykresu kropkowego do obramowanego obszaru i zwizualizuj średnią intensywność fluorescencji TMR Star w czasie (Rysunek 5C).
- Wyeksportuj dane (czas i intensywność fluorescencji) do programu Microsoft Excel w celu dalszych obliczeń.
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunki 5D i 5E przedstawiają kinetykę cykliny B, reprezentowaną przez krzywą intensywności fluorescencji TMR Star, w komórce przechodzącej prawidłową mitozę bez oznak nieprawidłowego ustawienia chromosomów (Rysunek 5E). Po zagęszczeniu cytoplazmy następującym po rozpadzie otoczki jądrowej (NEBD, zaznaczonym czerwonym trójkątem), intensywność fluorescencji TMR Star wykazuje gwałtowny wzrost aż do osiągnięcia okna izomorficznego (jaśniejszy obszar na schemacie), gdy komórka wchodzi w prometafazę 6. Intensywność fluorescencji utrzymuje się na stabilnym poziomie tak długo, jak komórka przechodzi przez profazę i metafazę, a następnie zaczyna gwałtownie spadać, gdy wszystkie chromosomy utworzą stabilną płytkę metafazową (Rysunki 5D i 5E). Spadek ten poprzedza rozdzielenie chromosomów podczas anafazy (niebieska kropka na krzywej). W późnej fazie mitozy chromatyna zaczyna się rozpraszać (niebieskie paski), a komórka przyjmuje morfologię charakterystyczną dla interfazu, podczas gdy krzywa intensywności fluorescencji dąży do plateau, która jest niższa od plateau sprzed mitozy (Rysunki 5D i 5E).
| Ustawienia autofokusu | Histona H2-GFP (ustawienia akwizycji głównego obiektu) | Cyklina B-SNAP znakowana TMR Star (ustawienia akwizycji) | Czas cyklu akwizycji Powtórzenia |
| Wstępne ustawianie ostrości +/-39 μm 24 warstwy Precyzyjne ustawianie ostrości +/-5.4 μm 14 warstw | zestaw filtrów GFP: Czas ekspozycji: 100 msec Natężenie światła: 25% | zestaw filtrów TRITC: Czas naświetlania: 150 ms Intensywność światła: 33,3% | od 2 do 5 min. |
| zestaw filtrów GFP: Czas naświetlania: 12 ms Intensywność światła: 12,5% | Do 48 h ciągłej analizy (ograniczonej przez obniżoną wilgotność powietrza wynoszącą 60%) |
Tabela 1. Standardowe ustawienia stosowane do analizy proteolizy cykliny B. Histona H2-GFP została wykorzystana jako struktura referencyjna do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania dla pomiaru intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP. Intensywność światła podczas procedury ogniskowania jest niższa w porównaniu do ustawień akwizycji obrazu, aby uniknąć kumulatywnej fototoksyczności.
Rysunek 1. Schemat pomiaru proteolizy cykliny B poprzez ekspresję chimerycznej pochodnej cykliny B o charakterystyce degradacji zbliżonej do białka endogennego. Spadek intensywności fluorescencji po znakowaniu metodą pulse-chase jest miarą aktywności APC/C.
Rysunek 2. Analiza komórek na szkiełkach z 8 dołkami lub płytkach 96-dołkowych. Równomierny rozkład komórek na powierzchni dołka uzyskuje się poprzez resuspensję w końcowej objętości 300 μl; jest to zalecane w przypadku, gdy do analizy definiuje się ręcznie tylko jedną lub kilka pozycji. Zagęszczenie komórek w regionie centralnym uzyskuje się poprzez dodanie komórek do centrum wypełnionych lub pustych dołków. Technika ta jest zalecana w przypadku zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów z różnych dołków.
Rycina 3. Sekwencja akwizycji danych. A) Detekcja histone H2-GFP służy do zdefiniowania płaszczyzny ogniskowania oraz monitorowania ustawienia chromosomów podczas mitozy. B) Intensywność fluorescencji TMR Star jest miarą bezwzględnej ilości cyclin B-SNAP znakowanej metodą pulse-chase.
Rycina 4. Reprezentacyjny obraz średnich intensywności fluorescencji TMR Star (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez pole powierzchni) w czasie, wygenerowany przez oprogramowanie Scan^R Analysis. Wybór reprezentatywnego śladu komórki (kolor niebieski). Odpowiadające mu obrazy (po prawej) umożliwiają jednoczesną wizualizację histonu H2-GFP (kolor zielony) i cykliny B-SNAP (kolor czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 5. A+B) Przykład bramkowania punktów reprezentujących analizowaną komórkę na wykresie kropkowym XY. C) Wizualizacja średniej intensywności fluorescencji TMRstar (całkowita intensywność TMRstar podzielona przez pole powierzchni) w czasie z wykorzystaniem wykresu kropkowego. D+E) Reprezentatywna krzywa intensywności fluorescencji cykliny B-SNAP z izomorficznym oknem (jaśniejszy obszar na diagramie) pomiędzy NEBD (rozpadem otoczki jądrowej) a dekondensacją chromatyny (niebieski pasek), wygenerowana w programie Microsoft Excel. Anafaza jest zaznaczona niebieskim punktem na krzywej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy tutaj podejście oparte na obrazowaniu żywych komórek, które umożliwia jednoczesne monitorowanie proteolizy cykliny B oraz ustawienia chromosomów. Metoda ta pozwala na badanie kontroli mitozy w niezakłóconych populacjach komórek na poziomie pojedynczej komórki. Krzywe degradacji cykliny B umożliwiają bezpośredni wgląd w aktywność APC/C, a tym samym pośrednio odzwierciedlają stan SAC 6.
To podejście, mimo że opracowane w oparciu o oprogramowanie Scan^R, można łatwo odtw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni S. Taylor za udostępnienie plazmidu pLPCX-Histone H2-GFP. Dziękujemy R. Mertelsmann za nieustanne wsparcie. Praca ta była finansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Linia komórek reporterowych | stworzona wewnętrznie zgodnie z opisem 6 | komórki reporterowe klonu 11 (komórki oparte na linii U2Os ekspresujące cyclin B-SNAP) | |
| Retrowirusowy wektor ekspresyjny cyclin B-SNAP | stworzony wewnętrznie zgodnie z opisem 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| DMEM bez czerwieni fenolowej | Gibco | 21063-029 | Wymagana suplementacja FCS, pirogronianem sodu oraz penicyliną/streptomycyną |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Roztwór zapasowy 400 μM w DMSO |
| Specjalna płytka Opstics, 96 dołków | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 dołków, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Urządzenie mikroskopowe | Olympus | mikroskop odwrócony IX-81 z komorą klimatyczną | |
| Obiektyw | Olympus | obiektyw UPLSAPO 20x (N.A. 0,75) | |
| Oprogramowanie do akwizycji | Olympus | oprogramowanie do akwizycji Scan^R (v.2.2.09) | |
| Oprogramowanie do analizy | Olympus | oprogramowanie do analizy Scan^R (v.1.2.0.6) |
Bibliografia
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
