Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Podsumowanie

Opisujemy nową metodę izolacji DNA genomowego z krwi pełnej pobranej do badań osocza/serologii. Po pobraniu osocza zagęszczona krew jest zazwyczaj utylizowana. Nasza nowatorska metoda stanowi znaczną poprawę w stosunku do istniejących sposobów i umożliwia uzyskanie DNA oraz osocza z jednego pobrania, bez konieczności pobierania dodatkowej krwi.

Streszczenie

Badania laboratoryjne mogą być przeprowadzane na komórkowych lub płynnych składnikach krwi. Zastosowanie różnych probówek do pobierania krwi determinuje frakcję krwi, która może zostać poddana analizie (całokrwistą, plazmę lub surowicę). Laboratoria zajmujące się badaniem genetycznych podstaw schorzeń ludzi opierają się na krwi pełnej z antykoagulantem, pobranej do vacutainera zawierającego EDTA, jako źródle DNA do analiz genetycznych i genomowych. Ponieważ większość laboratoriów klinicznych wykonuje badania biochemiczne, serologiczne i wirusologiczne jako pierwszy krok w badaniu efektów fenotypowych, krew z antykoagulantem pobierana jest również do probówki z heparyną (probówki do plazmy). W związku z tym, gdy do jednoczesnych i równoległych analiz danych genomowych i proteomicznych wymagane są zarówno DNA, jak i plazma, zwyczajowo pobiera się krew do probówek z EDTA oraz z heparyną. Gdyby krew mogła być pobierana do jednej probówki i służyć jako źródło zarówno plazmy, jak i DNA, metoda ta zostałaby uznana za udoskonalenie istniejących procedur. Wykorzystanie zagęszczonej krwi po ekstrakcji plazmy stanowi alternatywne źródło genomowego DNA, co minimalizuje ilość przetwarzanych próbek krwi i zmniejsza liczbę próbek wymaganych od każdego pacjenta. Pozwoliłoby to w ostateczności zaoszczędzić czas i zasoby.

System do pobierania krwi BD P100 do konserwacji białek osocza został stworzony jako ulepszona metoda w porównaniu do poprzednich probówek do pobierania osocza lub surowicy¹, aby stabilizować zawartość białek w krwi, co umożliwia lepsze odkrywanie biomarkerów białkowych oraz prowadzenie eksperymentów proteomicznych z krwi ludzkiej. Probówki BD P100 zawierają 15,8 ml rozpylonego suszem K2EDTA oraz liofilizowany, zastrzeżony koktajl inhibitorów proteaz o szerokim spektrum działania w celu zapobiegania koagulacji i stabilizacji białek osocza. Zawierają one również separator mechaniczny, który stanowi fizyczną barierę między osoczem a osadem komórkowym po wirowaniu. Opracowano niewiele metod ekstrakcji DNA z próbek skrzepłej krwi pobranych do starych probówek z osoczem^2-4. Problemy związane z tymi metodami wiązały się głównie z rodzajem separatora wewnątrz probówek (separator żelowy) i obejmowały trudności w odzyskiwaniu skrzepłej krwi, niedogodności przy fragmentacji lub rozpraszaniu skrzepu oraz utrudnianie ekstrakcji skrzepu przez żel separacyjny.

Przedstawiamy pierwszą metodę ekstrakcji i oczyszczania genomowego DNA z krwi pobranej do nowych probówek BD P100. Porównujemy jakość próbki DNA z probówek P100 z jakością DNA z probówek EDTA. Nasze podejście jest proste i wydajne. Obejmuje ono cztery główne etapy: 1) zastosowanie probówki do osocza BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) z separatorem mechanicznym do pobrania krwi, 2) usunięcie separatora mechanicznego przy użyciu kombinacji sacharozy i sterylnego metalowego haczyka wykonanego z spinacza, 3) oddzielenie warstwy tzw. buffy coat zawierającej leukocyty oraz 4) izolację genomowego DNA z warstwy buffy coat przy użyciu standardowego komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA lub podobnego standardowego protokołu.

Protokół

1. Pobieranie próbek

1. Pobrać próbki krwi od osób po uzyskaniu odpowiedniej świadomej zgody. Od każdego uczestnika pobrać od 4 do 5 ml krwi do probówki P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). W celu porównawczym równolegle pobrać krew do probówki z EDTA.
2. Probówki BD P100 zawierają 15,8 ml rozpylonego K2EDTA oraz liofilizowany, zastrzeżony koktajl inhibitorów proteaz o szerokim spektrum działania, aby zapobiec krzepnięciu i stabilizować białka osocza. Zawierają one również separator mechaniczny. Po pobraniu krwi pełnej przechowywać obie probówki w temperaturze pokojowej od 60 min do całej nocy, aż do momentu przetworzenia.
3. Wirować probówki BD P100 z przyspieszeniem 2,500 g przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Przenieść osocze zgromadzone nad separatorem mechanicznym do probówek do mikrocentryfugi.
4. Przechowywać probówki P100 zawierające krew skompresowaną poniżej separatora w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia ekstrakcji DNA.

2.1 Z krwi z probówki P100 (P100_DNA)

1. Probówki P100 są przechowywane w temperaturze -80 °C po ekstrakcji plazmy. W ciągu 3 do 4 miesięcy należy wyjąć z zamrażarki probówkę P100 zawierającą skondensowaną krew i rozmrozić ją w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min (Rycina 1A). Usunąć resztki plazmy znajdujące się nad separatorem. Do probówek P100, powyżej separatora, dodać 2 ml 17% roztworu sacharozy (roztwór gradientu przetestowany wewnętrznie – dane niepublikowane) (Rycina 1B). Wirować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 min przy 2,500 g; proces ten przesuwa mechaniczny separator do góry probówki i tworzy trzy warstwy roztworu, w tym warstwę leukocytarną (Rycina 1C). Ręcznie wyciągnąć separator za pomocą wysterylizowanego, zagiętego metalowego spinacza do papieru (Rycina 1D).
2. Po wyjęciu mechanicznego separatora z każdej probówki (Rycina 1D), usunąć i odrzucić górną warstwę sacharozy. Przenieść środkową warstwę, reprezentującą warstwę leukocytarną (BC), do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Dodać bufor fosforanowo-solny (PBS), aby zwiększyć objętość warstwy leukocytarnej do 3 ml. Wyekstrahować DNA z warstwy leukocytarnej, używając odczynników z zestawu Qiagen Puregene Blood Kit zgodnie z zaleceniami producenta, z wyjątkiem prędkości wirowania 2,500 g (zamiast 2,000 g).
3. Aby zlizować i usunąć erytrocyty (RBC), dodać 9 ml buforu do lizy RBC do 3 ml warstwy leukocytarnej. Odwrócić każdą probówkę kilka razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, odwracając je sporadycznie podczas inkubacji. Odwirować każdą mieszaninę przy 2,500 g przez 5 min i odrzucić nadosad. Pozostały w każdej probówce osad potraktować 3 ml roztworu do lizy komórek i wymieszać na wirówce typu vortex przez 15 sec. Lizat potraktować 1 ml roztworu do precypitacji białek i wymieszać na vortexie przez 15 sec.
4. Wirować przy 2,500 g przez 5 min i przenieść nadosad do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 100% izopropanolu. Odwrócić nowe probówki 10 razy i wirować przy 2,500 g przez 3 min. Odrzucić nadosad i dodać 1 ml 70% etanolu. Kilka razy odwrócić probówki stożkowe, aby oderwać i wypłukać osad DNA. Wirować przy 2,500 g przez 1 min. Pozostawić osad do wyschnięcia przez 3 min (umieścić probówkę do góry dnem) w temperaturze pokojowej, a następnie zawiesić DNA w 250 ml roztworu rehydratacyjnego w temperaturze 37 °C przez 10 min i przenieść do wcześniej oznakowanej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2.2 Z krwi z probówki z EDTA (EDTA_DNA)

1. Krew pełną do rutynowych badań immunohematologicznych pobiera się do plastikowych probówek typu vaccutainer pokrytych rozpylonym K₂EDTA w ilości 10,8 mg i przechowuje w temperaturze -80 °C. Ponieważ probówki nie zawierają separatora mechanicznego, ekstrakcja DNA nie obejmuje etapów związanych z separatorem mechanicznym (2.1.1 i 2.1.2).
2. W ciągu 3 do 4 miesięcy przechowywania krwi DNA jest ekstrahowane przy użyciu systemu KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Jest to zautomatyzowany system ekstrakcji DNA oparty na technologii cząstek magnetycznych, składający się z lizy komórek i wiązania DNA, kilku etapów płukania oraz elucji DNA.
3. Zestawem używanym do ekstrakcji DNA jest KingFisher Flex 24 DNA Blood kit (Qiagen, Niemcy).

3. Ocena ilości i jakości DNA

Ilość, jakość i integralność genomowego DNA oceniono za pomocą kombinacji metod obejmującej barwnik PicoGreen, spektroskopię oraz elektroforezę.

1. Stężenie genomowego DNA określa się za pomocą pomiarów Nanodrop oraz kwantyfikacji picogreen.
2. Czystość określa się na podstawie pomiaru stosunku 260/280 za pomocą spektrofotometru Nanodrop.
3. Próbkę (500 ng) nanosi się również na 1% żel agarozowy w celu oceny integralności (stopnia degradacji) DNA.

4. Analizy genotypowania i kontrola jakości

1. Do dalszej analizy z wykorzystaniem specjalistycznego Immunochipa (Immuno DNA Analysis BeadChip) losowo wybrano pięć próbek P100_DNA oraz odpowiadające im próbki EDTA_DNA. Immunochip to genotypowy chip Infinium zawierający 196 524 polimorfizmy, zaprojektowany do badań immunogenetycznych⁵.
2. Dla każdej próbki 200 ng DNA zostaje poddanych amplifikacji, fragmentacji, wytrąceniu, a następnie resuspensji w odpowiednim buforze do hybrydyzacji.
3. Zdenaturowane próbki są hybrydyzowane na Immunochipach w temperaturze 48 °C przez minimum 16 h.
4. Po hybrydyzacji Immunochipy są poddawane reakcjom przedłużania pojedynczej zasady i barwieniu.
5. Następnie Immunochipy są obrazowane za pomocą czytnika Illumina Hiscan Bead array, a znormalizowane dane o intensywności sygnału z kulek są ładowane do oprogramowania Illumina GenomeStudio i konwertowane na genotypy. Genotypy są wyznaczane przy użyciu algorytmu automatycznego wywoływania (autocalling) programu GenomeStudio. Kontrola jakości obejmuje wykluczenie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNPs) z odsetkiem wywołań (call rate) <95%.
6. Odsetek wywołań SNP jest wykorzystywany jako miara wydajności analizy Immunochip. Oblicza się go jako procent całkowitej liczby analiz na chipie (196 524 SNPs zakodowanych na każdym chipie), które osiągnęły wystarczającą intensywność i jakość sygnału, aby otrzymać automatyjne przypisanie genotypu. Oczekuje się, że wysokiej jakości DNA (stosunek 260/280 wynoszący 1,8 lub wyższy oraz brak degradacji) osiągnie co najmniej taki sam odsetek wywołań, jak kontrolne DNA HapMap zawarte w analizie Immunochip. Kontrola jakości obejmuje wykluczenie SNPs z odsetkiem wywołań <95% w każdym zestawie danych.

Wyniki

Ocena jakości i pomiar stężenia DNA

Wydajność otrzymania P100_DNAs była znacznie niższa niż w przypadku EDTA_DNAs (Tabele 1 i 2). Czystość DNA, reprezentowana przez wartość stosunku 260/280, jest podobna dla obu zestawów próbek P100_DNA i EDTA_DNA (Tabele 1 i 2). Jakość DNA jest dość jednorodna w obrębie każdego zestawu próbek, choć w próbkach EDTA_DNA widoczna jest pewna degradacja, o czym świadczy lekki rozmycie (Rycina...

Dyskusja

Wiele ludzkich chorób ma podłoże genetyczne, a badanie podstaw genetycznych tych schorzeń wymaga coraz większej ilości wysokiej jakości DNA. Najczęstszym źródłem DNA wykorzystywanym w badaniach genetycznych jest krew pełna z dodatkiem przeciwkrzepliwego. Ponieważ większość laboratoriów klinicznych w pierwszym etapie badania wyników fenotypowych przeprowadza testy biochemiczne, serologiczne i wirusologiczne, krew jest często pobierana do probówek do osocza. Po pobraniu osocza skondensowana krew jest często utylizowana. W ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
probówki BD P100	BD Diagnostics	366448
probówki z EDTA	BD Diagnostics	367863
Sacharoza	Sigma	S9378
Spinacz do papieru	Produkt biurowy
probówka 15 ml	Corning	430052
Erytrocyty (RBC)	Qiagen	158389 (zestaw)
Bufor fosforanowo-solny (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
mikroprobówki 1.7 ml	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Czytnik tablic koralików	Illumina	NA
Oprogramowanie GenomeStudio	Illumina	N/A