Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru przepuszczalności mózgu zarodkowego rybki zebrafish u żywego zwierzęcia. Technika ta analizuje zdolność do zatrzymywania płynu mózgowo-rdzeniowego oraz cząsteczek o różnej masie cząsteczkowej w świetle rurki nerwowej i ilościowo określa ich przemieszczanie się poza komory mózgu. Metoda ta jest przydatna do określania różnic w przepuszczalności i dojrzewaniu nabłonka podczas rozwoju oraz w przebiegu chorób.

Streszczenie

Układ komorowy mózgu jest konserwowany u kręgowców i składa się z serii połączonych ze sobą jam zwanych komorami mózgu, które powstają w najwcześniejszych etapach rozwoju mózgu i utrzymują się przez całe życie zwierzęcia. Układ komorowy mózgu występuje u kręgowców, a komory rozwijają się po sformowaniu rurki nerwowej, gdy centralny światło wypełnia się płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) ^1,2. CSF to bogata w białka ciecz, która jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu^3-6.

U danio pręgowanegoy rozszerzanie komór mózgu rozpoczyna się około 18 godziny po zapłodnieniu (hpf), po zamknięciu rurki nerwowej. Z tworzeniem komór mózgu wiąże się wiele procesów, w tym formowanie neuroepithelium oraz tworzenie połączeń ścisłych, które regulują przepuszczalność i produkcję płynu mózgo-rdzeniowego. Wykazaliśmy, że Na,K-ATPase jest niezbędna do rozszerzania komór mózgu, wpływając na wszystkie te procesy ^7,8, podczas gdy claudin 5a jest konieczna do tworzenia połączeń ścisłych ⁹. Dodatkowo wykazaliśmy, że „rozluźnienie” embrionowego neuroepithelium, poprzez inhibicję miozyny, wiąże się z rozszerzaniem komór mózgu.

Aby zbadać regulację przepuszczalności podczas pęcznienia komór mózgu u danio pręgowanego, opracowaliśmy test retencji barwnika w komorach. Metoda ta wykorzystuje wstrzykiwanie barwnika do komór mózgu żywego zarodka danio pręgowanego — technikę opracowaną wcześniej w naszym laboratorium¹⁰ — w celu fluorescencyjnego oznakowania płynu mózgowo-rdzeniowego. Następnie obrazowano zarodki w czasie, obserwując przemieszczanie się fluorescencyjnego barwnika przez komory mózgu i neuroepithelium. Ilościowo określono odległość, na jaką czoło barwnika przemieściło się od strony podstawnej (nieluminalnej) neuroepithelium w czasie, co stanowi miarę przepuszczalności neuroepithelium (Rysunek 1). Zaobserwowaliśmy, że barwniki o masie 70 kDa i mniejszej przenikają przez neuroepithelium i mogą być wykryte poza embrionalnym mózgiem danio pręgowanego w 24 hpf (Rysunek 2).

Ten test retencji barwnika może być wykorzystany do analizy przepuszczalności neuroepithelium w różnych konfiguracjach genetycznych, w różnych etapach rozwoju oraz po oddziaływaniach środowiskowych. Może być on również przydatny w badaniu patologicznego gromadzenia się płynu mózgowo-rdzeniowego. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta pozwala badaczom analizować rolę i regulację przepuszczalności podczas rozwoju i w przebiegu chorób.

Protokół

1. Przygotowanie do mikroiniekcji

1. Przygotować igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie rurek kapilarnych za pomocą wyciągacza igieł firmy Sutter instruments.
2. Napełnić igłę do mikroiniekcji barwnikiem fluorescencyjnym (FITC-Dextran).
3. Zamocować igłę w mikromanipulatorze oraz aparaturze do mikroiniekcji.
4. Ostrożnie złamać igłę do mikroiniekcji za pomocą pęsety tak, aby jej szerokość wynosiła około 2 μm; wartość ta może się jednak różnić w zależności od konfiguracji mikroinjektora. W przypadku naszych igieł do mikroiniekcji odpowiada to pierwszemu obszarowi igły od strony końcówki, który nie ulega zgięciu.
5. Zmierzyć rozmiar kropli w oleju, dostosowując czas i ciśnienie iniekcji tak, aby każda iniekcja dostarczała 1 nl. Przykładowe ustawienia dla mikroinjektora Harvard Apparatus to: P balance = 1.4 psi, P out = 1.4 psi, P inject = 22.9 psi, P clear = 67.8 psi przy czasie iniekcji od .4 do .7 sec. Średnica naszej igły przy tych ustawieniach wynosi około 2 μm. Należy jednak pamiętać, że ustawienia są zależne od konkretnego mikroinjektora i różnią się w zależności od średnicy igły.

2. Przygotowanie embrionów

1. Pokryj 2 płytki dla każdego stanu 1% agaroza w wodzie, wykonaj otwory w agarozie za pomocą końcówki pipety 1-200 μl i usuń korki z agarozy. Wypełnij płytki medium dla embrionów.
2. Używając pęsety, usuń chorion z embrionów w wieku 18 hpf lub starszych pod stereomikroskopem. Etapy rozwoju embrionów określono zgodnie z metodą Kimmel et al.¹¹ .
3. Przenieś embriony po usunięciu chorionu do pierwszej płytki pokrytej agarozą.
4. Aby znieczulić embriony, dodaj do płytki trikainę (0.1 mg/ml), aż embriony przestaną się poruszać (przygotowaną zgodnie z metodą Westerfield¹²).

3. Iniekcja do komór mózgu

1. Zorientuj zarodki tak, aby widoczna była ich strona grzbietowa, umieszczając ogon zarodka w otworze. Jeśli mikromanipulator znajduje się po prawej stronie, przesuń zarodek tak, aby przedmózgowie było po lewej stronie, a rądmózgowie po prawej.
2. Ustaw igłę w najszerszym punkcie komory rądmózgowia.
3. Ostrożnie przebij płytkę dachową komory rądmózgowia, upewniając się, że igła nie przechodzi przez całą grubość mózgu do żółtka (Rycina 1A).
4. Wstrzyknij 1-2 nl barwnika fluorescencyjnego do komór, upewniając się, że barwnik wypełnia całą długość komór mózgu.
5. Przenieś zarodki do drugiej płytki powlekanej agaroza wypełnionej pożywką do zarodków i ponownie poddaj anestezji zgodnie z opisem w punkcie 2.4.
6. NATYCHMIAST rozpocznij obrazowanie, zgodnie z opisem w sekcji 4, aby uzyskać obraz z czasu zero.

4. Obrazowanie

1. Zorientuj zarodki tak, aby ich ogony znajdowały się w otworze, zgodnie z opisem w punkcie 3.1.
2. Użyj mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem przechodzącym i fluorescencyjnym, aby wykonać obraz grzbietowy w polu jasnym. Zachowaj stałe powiększenie podczas obrazowania różnych zarodków. Pozwala to na bezpośrednie porównanie analiz przeprowadzonych w programie Image J (5.2-6).
3. BEZ PRZESUWANIA zarodka, mikroskopu lub szalki wykonaj odpowiadający mu obraz fluorescencyjny.
4. Powtórz czynność dla każdego zarodka w wybranych punktach czasowych.

5. Ilościowe określanie przemieszczania się barwnika

1. Połącz obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne w programie Photoshop zgodnie z wcześniejszym opisem Gutzmana i Sive¹⁰.
2. Zmień dystans, o jaki przemieścił się front barwnika, w programie Image J dostępnym pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/.
3. Otwórz połączony plik w programie Image J i użyj narzędzia linii, aby narysować linię od punktu zgięcia przedmózgu do frontu barwnika pod kątem 10-20 ° względem neuroepitelium (Rycina 1A). Wybrano ten obszar, ponieważ jest to pierwsze i najbardziej zauważalne miejsce wycieku barwnika z neuroepitelium typu dzikiego.
4. Wybierz narzędzie pomiarowe, aby obliczyć długość linii.
5. Powtórz czynność dla każdego punktu czasowego.
6. Oblicz wypadkowy dystans przemieszczenia się frontu barwnika w czasie, odejmując dystans w t=0 od pozostałych punktów czasowych.
7. Przedstaw wyniki na wykresie.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład wyników uzyskanych w teście przepuszczalności neuroepithelium z użyciem embrionów typu dzikiego przedstawiono na Rysunku 1B-D. Aby dokładnie zróżnicować przepuszczalność, warto przetestować barwniki o różnych masach cząsteczkowych, aby zidentyfikować taką wielkość, która wykazuje jedynie niewielki wyciek w embrionach typu dzikiego lub kontrolnych (Rysunek 2). Pozwala to na identyfikację mutantów genetycznych lub warunków środowiskowych, które zwiększają lub zmniejszają przepuszczalność (Rysunek 1D, odpowiednio linie zielona i czerwona). W przypadku neuroepithelium danio przełomycznego w 24 hpf, dekstran FITC 70 kDa wycieka powoli w ciągu 2 hr, podczas gdy 2 000 kDa nie wycieka, a 10 kDa wycieka niemal natychmiast. Dlatego 70 kDa jest idealną masą cząsteczkową do identyfikacji warunków, które zarówno zwiększają, jak i zmniejszają przepuszczalność neuroepithelium.

Jeśli igła nie trafi w światło komory mózgu, w czasie t=0 fluorescencja pojawi się poza obszarem mózgu (przykład znajduje się w pracy Gutzman and Sive, 2009¹⁰). Takie embriony należy odrzucić, ponieważ wstrzyknięty barwnik nie znajdował się początkowo wewnątrz mózgu, co uniemożliwia wyciągnięcie jasnych wniosków dotyczących przemieszczania się barwnika i przepuszczalności neuroepithelium.

W końcu, jeśli embriony mają małe lub niepod koniec wypełnione komory mózgu, przed wstrzyknięciem barwnika fluorescencyjnego można przeprowadzić wstępne wypełnienie komór roztworem soli fizjologicznej. Powoduje to rozszerzenie komór, co ułatwia ich późniejszą wizualizację podczas wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego. Należy przeprowadzić odpowiednie kontrole, aby ustalić, czy wstrzyknięcie soli fizjologicznej nie zaburza prawidłowego rozwoju cewy nerwowej.

Rysunek 1. Przebieg czasowy dla barwników o różnej masie cząsteczkowej. (A) Schemat doświadczenia. W pierwszej kolejności do komór mózgu wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny. X = pozycja igły do wstrzyknięcia. Następnie w określonych odstępach czasu rejestrowane są obrazy grzbietowe. Na koniec mierzy się odległość, o którą przunął się front barwnika od punktu przegięcia przedmózgu (oznaczonego czerwoną linią). (B-C) Zestawione obrazy grzbietowe w świetle przechodzącym i fluorescencyjne w 22 hpf (t = 0 min, B) oraz 24 hpf (t = 120 min, C). Biała linia wskazuje odległość frontu barwnika od komory przedmózgu. (D) Hipotetyczne dane dotyczące przepuszczalności próbek. Kolor niebieski = typ dziki lub kontrola, czerwony = próbka o zmniejszonej przepuszczalności w stosunku do kontroli, zielony = próbka o zwiększonej przepuszczalności w stosunku do kontroli.

Rysunek 2. Pomiar przepuszczalności neuroepitelium dla barwników o różnych masach cząsteczkowych. (A-E) Grzbietne nałożone obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne embrionów typu dzikiego w 22 hpf w czasie t=0 min po wstrzyknięciu FITC-dekstranu o następujących masach cząsteczkowych: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) i 2 000 kDa (E). (A'-E') Ten sam embrion co w (A-E) w czasie t=120 min w 24 hpf. Strona przednia po lewej. F= przedmózgowie, M= śródmózgowie, H= rombencephalon. Gwiazdka = ucho.

Dyskusja

Demonstrujemy możliwość ilościowego oznaczenia przepuszczalności żywego mózgu embrionalnego danio pręgowanego, określonej dla wstrzykniętego barwnika o danej masie cząsteczkowej. Nasza obserwacja, że neuroepithelium embrionalnego danio pręgowanego wykazuje różną przepuszczalność dla barwników o różnych masach cząsteczkowych, sugeruje, że barwnik przemieszcza się poprzez przepuszczalność parakomórkową. Nie możemy jednak wykluczyć możliwości wkładu transkomórkowego w obserwowaną przepuszczalność. Technikę tę można zastosow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dekstran, fluoresceina, anionowy, wiązany do lizyny	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Proszek trikainy	Sigma	A5040
Kapilary	FHC Inc.	30-30-1