Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4243

⸱

16 grudnia 2012

 , 
1Department of Biology, Whitehead Institute of Biomedical Research, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) oraz tworzenia układu pozbawionego CSF w obrębie układu komorowego embrionalnego mózgu rybki zebrafish. Pozwala to na dalsze badanie składu CSF oraz jego roli w rozwoju embrionalnego mózgu.

Streszczenie

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) jest bogatym w białka płynem wypełniającym komory mózgu. Występuje on we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego kręgowców i utrzymuje się przez całe życie. Przyjmuje się, że u osobników dorosłych CSF amortyzuje mózg, usuwa produkty przemiany materii oraz transportuje wydzielane cząsteczki1,2. U dorosłych oraz w późniejszych stadiach rozwoju embrionalnego większość CSF jest wytwarzana przez splot naczyniowy, czyli szereg silnie unaczynionych obszarów wydzielniczych zlokalizowanych w sąsiedztwie komór mózgu3-5. U danio pręgowanego splot naczyniowy jest w pełni uformowany w 144 godzinach po zapłodnieniu (hpf)6. Przed tym etapem, zarówno u danio pręgowanego, jak i u innych embrionów kręgowców, w tym myszy, występuje znaczna ilość embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego (eCSF). Dane te oraz badania na kurczętach sugerują, że neuroepithelium posiada właściwości wydzielnicze we wczesnej fazie rozwoju i może stanowić główne źródło eCSF przed rozwojem splotu naczyniowego7.

eCSF zawiera około trzykrotnie więcej białka niż płyn mózgowo-rdzeniowy dorosłych, co sugeruje, że może on odgrywać istotną rolę podczas rozwoju8,9. Badania na kurczętach i myszach wykazują, że wydzielane czynniki w eCSF, ciśnienie płynu lub ich kombinacja są ważne dla neurogenezy, ekspresji genów, proliferacji komórek oraz przeżywalności komórek w neuroepithelium10-20. Analizy proteomiczne eCSF ludzi, szczurów, myszy i kurcząt pozwoliły zidentyfikować wiele białek, które mogą być niezbędne dla funkcji CSF. Należą do nich składniki macierzy pozakomórkowej, apolipoproteiny, białka regulujące ciśnienie osmotyczne oraz białka zaangażowane w śmierć i proliferację komórek21-24. Niemniej jednak złożone funkcje eCSF pozostają w dużej mierze nieznane.

Opracowaliśmy metodę usuwania eCSF z komór mózgu danio pręgowanego, co umożliwia identyfikację składników eCSF oraz analizę zapotrzebowania na eCSF podczas rozwoju. Chociaż z innych systemów kręgowców z większymi embrionami można pobrać więcej eCSF, w przypadku danio pręgowanego pobieranie eCSF jest możliwe już od najwcześniejszych etapów rozwoju, a także w warunkach genetycznych lub środowiskowych prowadzących do nieprawidłowej objętości lub morfologii komór mózgu. Usuwanie i zbieranie eCSF pozwala na analizę spektrometryczną, badanie funkcji eCSF oraz ponowne wprowadzenie wybranych czynników do komór w celu oceny ich funkcji. Zatem dostępność wczesnego embrionu danio pręgowanego umożliwia szczegółową analizę funkcji eCSF podczas rozwoju.

Protokół

1. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji i tramwaju do komórek

  1. Napełnić mikroinżektor olejowy Eppendorf CellTram olejem mineralnym zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Przygotować igły do mikroiniekcji, wyciągając rurki kapilarne za pomocą wyciągarki igieł Sutter instruments.
  3. Zamocować igłę w mikromanipulatorze podłączonym do urządzenia Eppendorf CellTram.
  4. Ostrożnie złamać końcówkę igły. Aby uzyskać jednolity rozmiar końcówki, zmierzyć ją mikrometrem lub porównać z igłą referencyjną.
  5. Wypełnić długość igły olejem, używając urządzenia CellTram do przesunięcia oleju w dół igły, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

2. Przygotowanie zarodków

  1. W naczyniu powleczonym 1% agarozą wykonać otwory za pomocą końcówki pipety 1-200 μl, a następnie usunąć korki agarowe. Naczynie napełnić pożywką dla embrionów (przygotowaną zgodnie z opisem Westerfield25).
  2. Za pomocą pincety przeprowadzić dechorionację embrionów pod stereomikroskopem.
  3. Przenieść zdechorionowane embriony do naczynia powleczonego agarozą.
  4. Aby znieczulić embriony, do naczynia z agarozą dodawać Tricaine (0,1 mg/ml) aż do momentu, gdy embriony przestaną się poruszać (przygotowany zgodnie z opisem Westerfield25).

3. Odprowadzanie eCSF

  1. Ustawić embriony tak, aby ich ogony znajdowały się w otworach agarozy, a strony tylne były najbliżej mikromanipulatora, co umożliwi wizualizację grzbietowej strony mózgu.
  2. Umieścić igłę w punkcie przegięcia rombomeru 0/1 lub w najszerszym punkcie komory tylnego mózgu (Rysunek 1A).
  3. Ostrożnie przebić płytkę dachową komory tylnego mózgu, dbając o to, aby nie przejść przez całą głębokość mózgu aż do żółtka.
  4. Odssać eCSF za pomocą urządzenia CellTram i zebrać płyn do igły do mikroiniekcji. Należy uważać, aby nie pobrać żadnych komórek.

4. Pobieranie eCSF do analizy składu

  1. Po pobraniu eCSF do igły, ostrożnie przerwij ssanie w urządzeniu CellTram.
  2. Wysuń szalkę spod igły i ostrożnie umieść igłę w probówce zawierającej odpowiedni bufor.
  3. Za pomocą urządzenia CellTram odprowadź eCSF z igły do buforu, starając się nie zanieczyścić roztworu olejem.
  4. Aby usunąć komórki aspirowane wraz z eCSF, odwiruj eCSF z prędkością 10 000 x g. Zbierz oczyszczony eCSF (nadstaw) i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.

5. Reintrodukcja wybranych czynników

  1. Odprowadzać eCSF co 2 hr w wybranym przedziale czasowym, ponieważ płyn ten uzupełnia się w tym okresie. Pomiędzy punktami czasowymi odprowadzania należy wyjąć igłę i przechowywać embriony w temperaturze 28.5 °C lub innej wybranej temperaturze.
  2. Napełnić igłę drugiej mikropipety czynnikiem testowym.
  3. Umieścić igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikroinjektora.
  4. Ustawić objętość iniekcji na 1 nl, mierząc wielkość kropli w oleju i dostosowując czas oraz ciśnienie wtrysku.
  5. Wstrzyknąć 1-2 nl do komór mózgowych zgodnie z wcześniejszym opisem26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład opróżnionej komory mózgu przedstawiono na Rycini 1B-C. Komory mózgu są zapadnięte z powodu braku eCSF (Rycina 1B vs. C). Jak widać na obrazach grzbietowych (Rycina 1B-C oraz Rycina 2A-D), neuroepithelium rąbu mózgu zachowuje swoją charakterystyczną morfologię i wydaje się pozostać otwarte mimo braku eCSF, co jest prawdopodobnie wynikiem obecności silnych punktów przegięcia (hinge-points). Jednakże widoki boczne (Rycina 2A'-D') w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie tej techniki do manualnego drenażu eCSF z komór mózgu ryb zebrafish będzie przydatne w określaniu zapotrzebowania na eCSF podczas rozwoju. Ponadto technika ta pozwoli na opisanie profilu białkowego eCSF w trakcie rozwoju embrionalnego. Identyfikacja różnych białek w tym czasie umożliwi dalsze badanie funkcji CSF oraz jego potencjalnej roli w rozwoju mózgu. U amnionów niektóre czynniki zidentyfikowane w eCSF (IGF2, FGF2, kwas retinowy i apolipoproteiny) wykazują udokumentowaną rolę w przeżywalności, prolifera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez National Institute for Mental Health oraz National Science Foundation. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Jen Gutzman, dr Amandy Dickinson oraz pozostałych członków laboratorium Sive za liczne pomocne dyskusje i konstruktywną krytykę, a także do Oliviera Paugois za ekspercką opiekę nad rybami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Olej Eppendorf CellTramEppendorf516 000.025
Olej mineralnySigmaM8410
Trikaina w proszkuSigmaA5040
KapilaryFHC Inc.30-30-1

Bibliografia

  1. Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
  2. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
  3. Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
  4. Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
  5. Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
  6. Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090(2008).
  7. Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
  8. Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
  9. Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
  10. Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
  11. Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
  12. Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
  13. Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
  14. Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
  15. Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
  16. Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
  17. Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
  18. Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2(2006).
  19. Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
  20. Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
  21. Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
  22. Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
  23. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
  24. Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
  25. Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
  26. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218(2009).
  27. Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
  28. Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
  29. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  30. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  31. Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pozyskiwanie embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowegodostęp do układu komorowegoaparat do iniekcji olejowejigła do mikroiniekcjianaliza eCSFspektrometria masreintrodukcja czynnikówmonitorowanie rozwoju mózgu
Ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.