Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system hodowlany

Streszczenie

Opisujemy metodę hodowli ex vivo całych mózgów Drosophila. Może ona służyć jako uzupełnienie przewlekłych manipulacji genetycznych w badaniach nad biologią komórki i rozwojem struktur centralnych mózgu, umożliwiając ostre interwencje farmakologiczne oraz obrazowanie procesów komórkowych na żywo. Jako przykład zastosowania tej techniki, wcześniejsze prace naszego laboratorium¹ wykazały istnienie wcześniej nieznanego przedziału subkomórkowego, znajdującego się pomiędzy przedziałem aksonalnym a somatodendrytycznym aksonów w centralnym mózgu Drosophila. Wykazano genetycznie, że rozwój tego przedziału, określanego jako początkowy segment aksonu (AIS)², zależy od specyficznej dla neuronów kinazy zależnej od cyklin, Cdk5. Pokazujemy tutaj, że traktowanie ex vivo mózgów larw Drosophila typu dzikiego swoistymi dla Cdk5 inhibitorami farmakologicznymi, takimi jak roscowityna i olomucyna³, powoduje ostre zmiany w organizacji aktyny oraz w lokalizacji białka powierzchni komórki Fasciclin 2, które naśladują zmiany obserwowane u mutantów z genetycznym brakiem aktywności Cdk5.

Drugim przykładem techniki hodowli ex vivo jest przebudowa połączeń embrionalnych neuronów gamma ciała grzybowatego (MB) podczas metamorfozy z larwy w osobnika dorosłego. Ciało grzybowate jest ośrodkiem uczenia się i pamięci węchowej u muchy⁴, a wspomniane neurony gamma usuwają swoje odgałęzienia aksonalne i dendrytyczne podczas rozwoju poczwarki, a następnie w późniejszym punkcie czasowym ponownie rozbudowują odgałęzienia, aby ustanowić wzorzec unerwienia dorosłego osobnika⁵. Wykazano, że usuwanie tych neuronów MB zachodzi poprzez lokalną degenerację odgałęzień neurytów⁶, w mechanizmie wyzwalanym przez ekdyson – hormon steroidowy działający na receptor ekdysonu B1⁷ – i zależnym od aktywności systemu ubikwityna-proteasom⁶. Nasza metoda hodowli ex vivo może być wykorzystana do dalszego badania mechanizmu przebudowy rozwojowej. Stwierdziliśmy, że w warunkach hodowli ex vivo neurony gamma MB odtwarzały proces usuwania rozwojowego z przebiegiem czasowym zbliżonym do tego in vivo. Niezbędne było jednak odczekanie 1,5 godziny po utworzeniu puparium przed wypreparowaniem tkanki, aby komórki nieodwracalnie zaangażowały się w metamorfozę; sekcja zwierząt w momencie rozpoczęcia pupariacji prowadziła do niewielkiej metamorfozy w kulturze lub jej całkowitego braku. Zatem, przy odpowiednich modyfikacjach, podejście hodowli ex vivo można zastosować do badania zarówno dynamicznych, jak i stacjonarnych aspektów biologii centralnego mózgu.

Protokół

A. Przygotowanie pożywek

1. Przygotować pożywkę kompletną poprzez sterylizację filtracyjną pożywki Schneidera dla Drosophila, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Pożywkę należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem. Alternatywnie można rozmrozić świeżą porcję wcześniej zamrożonej pożywki.
3. Przed hodowlą do pożywki dodać 10 μg/ml insuliny oraz 2 μg/ml ekdysonu. Substancje te przygotowano w formie stężonych roztworów stokowych i zamrożono w małych porcjach. Rozmrożonych porcji nie zamrażano ponownie.
4. Wszystkie roztwory robocze powinny być utrzymywane w temperaturze 25 °C.

Hodowla mózgów larwalnych

1. Wybór i sekcja mózgów larwalnych

1. Do wkładki do hodowli komórkowej Millicell 12 mm dodać 500 μl pożywki. Wypreparowane mózgi zostaną umieszczone w tych wkładkach, aby ułatwić późniejsze barwienie immunocytochemiczne.
2. Na szkiełko zegarowe do preparacji nanieść niewielką ilość przygotowanej pożywki.
3. Za pomocą małej szpatułki wyłowić poruszające się larwy trzeciego stadium i umieścić je na szkiełku zegarowym. (Przypuszczamy, że metoda hodowli ex vivo byłaby równie skuteczna w przypadku larw pierwszego lub drugiego stadium, jednak nie zostało to przetestowane).
4. Trzymając tylny koniec larwy pęsetą, ostrożnie otworzyć koniec przedni za pomocą drugiej pęsety nr 5.
5. Szybko wypreparować mózg, zachowując ciągłość brzusznego sznura nerwowego.

2. Hodowla ex vivo wypreparowanych mózgów larwalnych

1. Używając uprzednio zwilżonych końcówek do pipety, ostrożnie przenieś mózg do insertów do hodowli komórkowej, uprzednio wypełnionych pożywką.
2. Przenieś mózgi w pożywce do inkubatora w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego. Metoda ta działa efektywnie do 48 hr hodowli.
3. Wymień pożywkę po 8 godzinach. Po tym czasie wymieniaj połowę pożywki co 5-6 godzin.

3. Manipulacja farmakologiczna mózgów larw

Tę metodę hodowli ex vivo można wykorzystać do farmakologicznego potwierdzenia interakcji genetycznych wykazanych wcześniej w naszym laboratorium ¹.

1. Do przygotowanego medium dodać 100 μM roscovityny i 100 μM olomucyny.
2. Przenieść wypreparowane mózgi do tego medium.
3. Kulturować mózgi w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.
4. Wymienić medium po 8 godzinach. Następnie wymieniać połowę medium (z dodatkiem leków) co 5-6 godzin.

Hodowla mózgów poczwarki

1. Wybór pociorek do sekcji

1. Oznacz białe poczwarki na butelkach/fiolkach.
2. Wybierz wyłącznie poczwarki całkowicie białe. Nie należy uwzględniać poczwarek z jakimkolwiek zabarwieniem.
3. Ten etap odpowiada 0 godzin po utworzeniu puparium (APF).
4. Poczwarki te będą gotowe do sekcji 1,5 godziny po oznaczeniu. Krok ten jest kluczowy, aby zapewnić zachodzenie pruningowania rozwojowego w hodowli ex vivo.

2. Disekcja poczwarek

1. Do wkładki do hodowli komórkowej Millicell 12 mm należy dodać 500 μl pożywki. (Wypreparowane mózgi zostaną umieszczone w tych wkładkach, aby ułatwić późniejsze barwienie immunocytochemiczne).
2. Po osiągnięciu pożądanego punktu czasowego należy nalać niewielką ilość przygotowanej pożywki na szkiełko zegarowe do preparacji.
3. Używając małej, wilgotnej szpatułki, należy pobrać poczwarki wcześniej wyznaczonych do preparacji i umieścić je na szkiełku zegarowym.
4. Trzymając tylny koniec poczwarki pęsetą, należy ostrożnie otworzyć przedni koniec pochewki poczwarki drugą pęsetą nr 5.
5. Należy szybko wypreparować mózg, zachowując nienaruszoną i przytwierdzoną strukturę brzusznego sznura nerwowego.

3. Hodowla ex vivo wypreparowanych mózgów poczwarki

1. Ostrożnie przenieś mózg do wkładek do hodowli komórkowej, uprzednio wypełnionych pożywką.
2. Przenieś mózgi w pożywce do inkubatora w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego. W przedstawionym eksperymencie metodę tę stosowano do 10 godzin hodowli, jednak w razie potrzeby można ją przedłużyć o dłuższe okresy obserwacji i traktowania.
3. W przypadku punktów czasowych przekraczających 8 godzin APF, wymieniaj pożywkę co 5-6 godzin.

Od tego kroku protokół pozostaje taki sam zarówno dla larw, jak i pociorek.

B. Fixacja wypreparowanych mózgów

1. Po osiągnięciu pożądanego punktu czasowego usunąć medium i dodać 500 μl 4% formaldehydu w 1x PBS z 0,5% Triton X-100 (PBST) na 30 minut, wymieniając formaldehyd na świeży po 15 minutach.
2. Należy dopilnować, aby mózgi nie wyschły podczas wymiany medium na utrwalacz.
3. Usunąć formaldehyd, wykonując cztery 10-minutowe przemycia w 1x PBS z 0,5% TritonX-100 (PBST).

C. Barwienie utrwalonych mózgów

1. Po wypłukaniu formaldehydu blokować mózgi przez 1 godzinę w roztworze blokującym składającym się z 1x PBS z 1% normalnym surowicą kozią i 1% albuminą surowiczą wołową (BSA).
2. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe przygotowane w roztworze blokującym.
3. Inkubować mózgi przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnego dnia rano wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe, wykonując cztery 10-minutowe płukania w roztworze PBST.
5. Dodać przeciwciała drugorzędowe przygotowane w roztworze blokującym.
6. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 4 godziny.
7. Wypłukać przeciwciała drugorzędowe, wykonując cztery 10-minutowe płukania w roztworze PBST.

D. Montowanie utrwalonych i barwionych mózgów do mikroskopii

1. Równoważyć mózgi w medium montażowym Vectashield przez 1 godzinę.
2. Zamontować mózgi na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Vectashield.
3. Przed nałożeniem szkiełka nakrywki, umieścić szklane podkładki po obu stronach mózgów. Zapobiega to zmiażdżeniu mózgów, utrzymując jednocześnie próbkę na tyle cienką, aby można było przeskanować wszystkie płaszczyzny ogniskowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Podczas montażu mózgi orientowano w przybliżeniu tak, aby ułatwić obrazowanie interesujących cech. W razie potrzeby obrazy mózgu obracano w oprogramowaniu Imaris, aby uzyskać optymalny widok do dokumentacji i pomiarów.
4. Uszczelnić szkiełka nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci.
5. Przechowywać szkiełka w ciemności.

E. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia panel mózgów larw w trzecim stadium rozwoju (A) much typu dzikiego oraz (B) much wykazujących ekspresję pochodnej dominantno-negatywnej Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). W obu przypadkach w neuronach gamma ciała grzybiastych (MB) wykazano ekspresję aktyny-GFP (kolor zielony). Jak opisano wcześniej (Trunova et al., 2011), w proksymalnych aksonach neuronów gamma typu dzikiego znajduje się obszar, w którym nie kumuluje się aktyna-GFP, co objawia się jako „strefa przejaśnienia” (A, nawias), a białko fasciklina 2 (kolor czerwony) kumuluje się w aksonach jedynie do brzusznej granicy tej strefy (biała pozioma linia). Linia przerywana na trzecim panelu Ryciny 1(A) wskazuje położenie MB, podkreślając „strefę przejaśnienia” aktyny oraz jej brzuszną granicę. U much wykazujących ekspresję Cdk5DN strefa przejaśnienia aktyny nie występuje (B), a immunoreaktywność fascikliny 2 (FasII) rozprzestrzenia się grzbietowo przez ten obszar. (Należy zauważyć, że zmienna liczba aksonów dodatnich pod kątem FasII biegnie poziomo przez MB; nie mają one związku z fenotypem). Pasek skali reprezentuje 20 μm.

Stosując naszą metodę hodowli ex vivo, traktowaliśmy muchy typu dzikiego kombinacją roscovityny i olomoucyny, będących farmakologicznymi inhibitorami aktywności Cdk5. Rysunek 2 przedstawia panel mózgów larw trzeciego stadium rozwoju much typu dzikiego z grupy kontrolnej (A) oraz grupy traktowanej lekami (B). Podobnie jak u much wykazujących ekspresję dominującego negatywnego konstruktu Cdk5, mózgi traktowane inhibitorami Cdk5 przez 24 godziny wykazują charakterystyczną utratę strefy przejaśnienia aktyny oraz przesunięcie granicy FasII (nawiasy kwadratowe). Białe linie wskazują położenie granicy FasII u typu dzikiego. Pasek skali reprezentuje 20 μm.

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywną serię ciał grzybowatych Drosophila z okresu 0-10 godzin APF, znakowanych skierowanym do błony mCD8-GFP (kolor zielony). Nawiasy wskazują kielich, czyli projekcje dendrytyczne ciał grzybowatych (MB). Przed metamorfozą widoczne są aksony MB biegnące grzbietowo-brzusznie w grubych pęczkach, a także „poświata” sygnału fluorescencyjnego pochodząca z gęstego drzewa dendrytycznego (nawias). Panel A przedstawia mózgi wypreparowane w wyznaczonym czasie. Należy zwrócić uwagę na pruning dendrytów w obszarze wskazanym nawiasami, tak że do 6-8 h APF poświata sygnału dendrytycznego znika (podczas gdy sygnał aksonalny pozostaje niezmieniony). Mózgi w panelu B zostały wypreparowane w 0 h APF, przed wewnętrznym pikiem ekdysonu (Truman and Riddiford, 2002), i hodowane ex vivo zgodnie z opisem. Nie wykazują one rozwojowego pruningu dendrytów; przeciwnie, sygnał dendrytyczny utrzymuje się w 10 h APF. Aby temu zapobiec, poczwarki są znakowane w 0 h APF, ale wypreparowywane i hodowane w 1,5 h APF. Panel C przedstawia reprezentatywną serię tych ciał grzybowatych Drosophila z okresu 0-10 godzin APF. Podobnie jak w próbkach niehodowanych, sygnał dendrytyczny jest niewykrywalny do 8 h APF. Pasek skali reprezentuje 20 μm.

Dyskusja

Przewlekłe manipulacje genetyczne strukturą i funkcją tkanek, w tym mutacje i ekspresja transgenów, zazwyczaj wywołują kombinację efektów natychmiastowych oraz późnych konsekwencji pośrednich, które mogą być bardzo trudne do rozdzielenia. Uzupełnienie metod genetycznych o farmakologię może ułatwić badanie przebiegu czasowego powstawania fenotypu. Przykładowo, było to skuteczne podejście do analizy udziału różnych komponentów cytoszkieletu podczas spermatogenezy u Drosophila ¹⁰. W obecnym przykładzie p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Schneidera dla Drosophila	Invitrogen	21720-024
Płódca bydlęca surowica (inaktywowana termicznie)	Invitrogen	10082-147	10%
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122	1%
Insulina	Invitrogen	12585-014	10μg/ml
Ekdyzon	Sigma-Aldrich	H5142	2μg/ml
Roscityna	Sigma-Aldrich	R7772	100μM
Olomoucyna	Sigma-Aldrich	O0886	100μM
Normalna surowica kozia	Invitrogen	50062Z	1%
Seryjna albumina bydlęca	Fisher Scientific	M9501	1%
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	D4551	4%
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151	0.5%
Fosforanowy bufor solny (PBS)	Invitrogen	70011-044	1X
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
Wkładki do hodowli komórkowej Millicell	EMD Millipore	PI8P01250
Płytka wielodołkowa, 4 dołki	Thermo Fisher Scientific, Inc.	176740
Pinceta Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-544-7
Łaseczki	Fisher Scientific	12-548-5M