Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4274

⸱

20 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

Streszczenie

Różnicowanie ludzkich prekursorów neuronalnych w typy komórek neuronalnych i glejowych stanowi model do badania i porównywania molekularnej regulacji rozwoju linii komórek nerwowych. Ekspansja in vitro prekursorów neuronalnych z płodowej tkanki OUN została dobrze scharakteryzowana. Pomimo identyfikacji i izolacji prekursorów glejowych z podkorowej białej materii dorosłego człowieka oraz opracowania różnych warunków hodowli w celu ukierunkowania różnicowania płodowych prekursorów neuronalnych w oligodendrocyty wytwarzające mielinę, pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne. Opisano różnicowanie galaktocerebrozydowych+ (GalC) i O4+ komórek prekursorowych lub progenitorowych oligodendrocytów (OPC) z komórek prekursorowych neuronów z wykorzystaniem mózgu płodu w drugim trymestrze. Jednakże komórki te nie proliferują wobec braku komórek wspierających, takich jak astrocyty i neurony, i są szybko utracone w czasie trwania hodowli. Istnieje zatem zapotrzebowanie na system hodowli pozwalający na wytwarzanie komórek linii oligodendrocytów odpowiednich do eksperymentów in vitro.

Hodowla pierwotnych ludzkich oligodendrocytów mogłaby być na przykład użytecznym modelem do badania patogenezy neurotropowych czynników zakaźnych, takich jak ludzki poliomawirus JCV, który in vivo infekuje te komórki. Hodowane komórki te mogłyby również stanowić modele innych chorób demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pierwotne, wielopotencjalne ludzkie komórki progenitorowe układu nerwowego pochodzące z mózgu płodowego proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony (neurony pochodzące z progenitorów, PDN) i astrocyty (astrocyty pochodzące z progenitorów, PDA). Niniejsze badanie pokazuje, że progenitory neuronalne mogą zostać indukowane do różnicowania się poprzez wiele etapów rozwoju linii oligodendrocytarnej (oligodendrocyty pochodzące z progenitorów, PDO). Hodujemy komórki progenitorowe układu nerwowego w bezserwatkowym medium DMEM-F12 uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-AA), białko Sonic hedgehog (Shh), czynnik neurotroficzny 3 (NT-3), N-2 oraz trijodotyroninę (T3). Hodowane komórki są pasażowane w zagęszczeniu 2.5e6 komórek na kolby 75cm w przybliżonych odstępach siedmiodniowych. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię charakteryzującą się niewielką liczbą wypustek i wykazuje ekspresję markerów komórek pre-oligodendrocytarnych, takich jak A2B5 i O-4. Po usunięciu czterech czynników wzrostu (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) i dodaniu medium kondycjonowanego z PDN, komórki zaczynają wytwarzać więcej wypustek i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania oligodendrocytów, takich jak GalC i podstawowe białko mieliny (MBP). Przeprowadziliśmy charakterystykę fenotypową z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania unikalnych markerów oligodendrocytów.

Protokół

Uwaga: W rutynowej hodowli progenitorów neuronalnych i komórek linii oligodendrocytycznej inkubację przeprowadzono w temperaturze 37 °C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Co 2 dni pożywkę wymieniano, stosując od 50 do 100% świeżej pożywki, jeżeli konfluencja hodowli wynosiła 40-70%. W momencie osiągnięcia niemal pełnej konfluencji hodowle pasażowano w zagęszczeniu 2-2.5e6/kolbę T75, zazwyczaj w cyklu tygodniowym.

1. Przygotowanie powlekanej kolby

  1. Aby przygotować powlekane kolby, rozpuścić 5 mg poli-D-lizyny (PDL) w 100 ml wody dejonizowanej (DI-water), a następnie powlec kolby T75 stężeniem 50 μg/ml PDL w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności. Po 1½ h odessać PDL i jednorazowo przepłukać kolby wodą DI-water. Pozostawić kolby do wyschnięcia przed wysianiem komórek (Tabela 1).

2. Rozpoczęcie różnicowania komórek progenitorowych neuronów w oligodendrocyty pochodzące z progenitorów (PDO)

Protokół izolacji ludzkich komórek progenitorowych OUN został opisany w poprzedniej publikacji i nie stanowi części niniejszego protokołu1. Ludzkie komórki progenitorowe OUN wyizolowano z telencefalonu płodu w 8. tygodniu ciąży, zgodnie z wytycznymi NIH.

  1. Hodować multipotencjalną populację komórek progenitorowych neuronów w kolbach powlekanych PDL w pożywce Neurobasal uzupełnionej o 25 ng/ml bFGF oraz 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF) (Rycina 1A). Nie należy ich używać, jeśli przekroczyły one 11. pasaż (p11).
  2. Rozpocząć różnicowanie komórek progenitorowych neuronów, gdy kultura osiągnie około 70% konfluencji.
  3. Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania oligodendrocytów, używając bezsurowiczej pożywki DMEM/HAMS F12 1:1 uzupełnionej o albuminę surowiczą wołu, L-glutaminę, gentamycynę, komponenty N2, T3, Shh, NT-3, bFGF oraz PDGF-AA (Tabela 1). Pożywka ta będzie określana jako pożywka do oligodendrocytów z czynnikami wzrostu (pożywka oligo + GF).
  4. Usunąć pożywkę dla progenitorów z kolb, przepłukać komórki raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dodać pożywkę oligo + GF (szczegóły opisane w 2.3), aby rozpocząć różnicowanie w kierunku oligodendrocytów. Rosnąć będą tylko komórki zdeterminowane do linii oligodendrocytarnej (Rycina 1B). Hodować komórki w tej pożywce przez 3 tygodnie.
  5. W każdym tygodniu, gdy komórki osiągną 90-95% konfluencji, przeprowadzić pasaż za pomocą trypsyny (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml dla kolby T75). Przenieść całą pożywkę od komórek przeznaczonych do pasażu do probówki stożkowej 50 ml; ta pożywka warunkowana zostanie użyta do zneutralizowania trypsyny. Należy dopilnować, aby nie wysuszyć komórek. Następnie dodać trypsynę.
  6. Inkubować komórki w trypsynie przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT), delikatnie stukując kolbę kilka razy, aby wspomóc odrywanie się komórek.
  7. Zneutralizować trypsynę, dodając 4-5 ml pożywki warunkowanej do kolby z odłączonymi komórkami.
  8. Przenieść pożywkę i komórki do tej samej probówki stożkowej 50 ml. Odwirować pożywkę i komórki przy 1 200 rpm (~300 ×g) przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Odssać nadsącz, resuspendować osad komórkowy, delikatnie przechylając probówkę, a następnie dodać świeżą pożywkę oligo + GF. Delikatnie pipetować pożywkę i komórki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.
  10. Policzyć komórki i przenieść 2,5e6 do każdej nowej kolby T75 powlekanej PDL.

3. Końcowy etap różnicowania oligodendrocytów

  1. Po 3 tygodniach hodowli w pożywce oligo + GF, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, rozpocząć końcowy proces różnicowania (Rysunek 1C).
  2. Przygotować pożywkę w ten sam sposób co pożywkę oligo + GF, ale bez dodawania czterech GF: Shh, NT-3, bFGF i PDGF-AA. Pożywkę bez tych czterech GF definiuje się jako pożywkę oligo - GF.
  3. Odssać pożywkę oligo + GF z kolby, przepłukać raz PBS, a następnie dodać całkowitą objętość 16 ml pożywki, z czego ¾ (12 ml) stanowi pożywka oligo - GF, a ¼ (4 ml) to pożywka warunkowana PDN (na okres 6-10 dni). Stosowanie pożywki warunkowanej PDN nie jest krytyczne dla procesu różnicowania ani przeżywalności komórek. W rzeczywistości zaobserwowano, że tylko bezpośredni kontakt PDO z komórkami PDN w eksperymentach z kokulturą wpływał na czas przeżycia PDO. Czas przeżycia w pożywce oligo - GF może zostać wydłużony do dwóch lub trzech tygodni, jeśli komórki PDO są hodowane w kokulturze z komórkami PDN. Protokół różnicowania ludzkich progenitorowych komórek neuralnych w PDN został opisany w poprzedniej publikacji i nie stanowi części niniejszego protokołu1. Usunięcie czynników wzrostu z pożywki prowadzi do progresywnego różnicowania hodowli komórek z licznymi wypustkami (Rysunek 1D).

4. Analiza z użyciem cytometrii przepływowej

Analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej porównuje nabywanie markerów oligodendrocytów podczas procesu różnicowania w odniesieniu do markerów ich populacji wyjściowej.

  1. Użyć progenitorów neuronalnych jako kontroli. Wysiać komórki PDO w liczbie 2.5x106 komórek do dwóch kolb T75 powlekanych poli-D-lizyną w pożywce oligo + GF.
  2. Tydzień później wymienić pożywkę na świeżą pożywkę oligo + GF w kolbach służących jako kultura kontrolna dla żywotności komórek, podczas gdy w pozostałych kolbach zastosowano pożywkę oligo - GF.
  3. Do dysocjacji komórek PDO w obu pożywkach należy użyć papainy w stężeniu 20 U/ml, a nie trypsyny. Wynika to z faktu, że papaina działa łagodniej na komórki podczas dysocjacji, co pozwala zachować morfologię komórkową.
  4. Dodać 5 ml zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS) do fiolki z papainą. Pozostawić fiolkę w temperaturze 37 °C przez 10 min lub do całkowitego rozpuszczenia papainy i uzyskania klarownego roztworu. Jest to roztwór papainy stosowany do dysocjacji komórek.
  5. Dodać 0.5 ml EBSS do fiolki z Deoksyrybonukleazą I (DNase) (Tabela 1). Delikatnie wymieszać. Dodać 0.25 ml tego roztworu do fiolki z rozpuszczoną papainą. Preparat ten zawiera końcowe stężenie około 20 U/ml papainy i 0.005% DNase.
  6. Nanieść roztwór papainy (opisany powyżej) na komórki i inkubować w 37 °C przez 15-30 min; monitorować odrywanie się komórek za pomocą mikroskopu. Przerwać reakcję, dodając 5 ml pożywki z GF lub bez GF, a następnie wirować przy 1,200 rpm przez 7 min.
  7. Przenieść osady komórkowe z obu kolb do dwóch różnych probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml i przemyć je zwykłą pożywką fizjologiczną (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 10 mM Hepes i 10 mM glukozy) uzupełnioną o 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (NPM+BSA).
  8. Przeprowadzić immunobarwienie powierzchniowe w 4 °C przez 20 min, stosując specyficzne i odpowiednio miareczkowane przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko A2B5, O4 i GalC (Tabela 2).
  9. Przemyć komórki roztworem NPM+BSA w 4 °C przez 5 min, a następnie inkubować je ze specyficznymi przeciwciałami drugorzędowymi w 4 °C przez 20 min (Tabela 2).
  10. Aby zbarwić antygeny wewnątrzkomórkowe, w tym nestynę, kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP), β-tubulinę klasy III oraz podstawowe białko mieliny (MBP) (Tabela 2), utrwalić komórki w 2% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT) i permeabilizować zimnym 70% etanolem przez 15 min w -20 °C.
  11. Przemyć komórki 1x PBS i inkubować ze specyficznymi przeciwciałami drugorzędowymi (Tabela 2).
  12. W celu odróżnienia całych komórek od debris subkomórkowych podczas analizy cytometrycznej, zbarwić komórki 4,6-diamidyno-2-fenylindołem, dihydrochlorkiem (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. Podczas optymalizacji powyższego protokołu przeprowadzono wszystkie odpowiednie eksperymenty kontrolne w celu potwierdzenia specyficzności każdego odczynnika immunologicznego. W przypadku przeciwciał bezpośrednio znakowanych, odpowiednią kontrolą negatywną było przeciwciało bezpośrednio sprzężone z tym samym izotypem klasy (lub podklasy) immunoglobulin i tym samym fluorochromem co przeciwciało pierwszorzędowe (tj. kontrola izotypowa). W przypadku pośredniego immunobarwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi, odpowiednią kontrolą negatywną było przeciwciało drugorzędowe sprzężone z interesującym fluorochromem, skierowane specyficznie przeciwko klasie (lub podklasie) immunoglobulin gatunku, w którym wygenerowano przeciwciało pierwszorzędowe. Gdy razem używano przeciwciał pierwszorzędowych od wielu gatunków (mysz, królik, kurczak), stosowano przeciwciało drugorzędowe skierowane przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu każdego gatunku; każde użyte przeciwciało drugorzędowe było zazwyczaj adsorbowane krzyżowo przeciwko immunoglobulinom innych gatunków, aby zminimalizować reaktywność krzyżową międzygatunkową. Kontrole pozytywne obejmowały bezpośrednie lub pośrednie immunobarwienie preparatów komórkowych znanych z ekspresji interesujących antygenów, z wykorzystaniem bezpośrednich lub pośrednich reakcji immunologicznych z przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla tych antygenów. Powyższe metody optymalizacji przeprowadzono raz dla każdego rodzaju eksperymentów immunobarwienia. Kontrolne reakcje immunologiczne nie wykazały istotnej reaktywności krzyżowej między epitopami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Cytometrię przepływową wykonano na jednorodnie zawieszonych komórkach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu sortera komórkowego FACVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA) wyposażonego w trzy lasery, zapewniające długości fal wzbudzenia nastrojone na 488 nm, 647 nm oraz szerokie UV (351-364 nm) (Rysunek 2).

5. Analiza immunofluorescencyjna

Uwaga: Do eksperymentów z immunofluorescencją PDO wysiewa się w pożywce oligo + GF lub pożywce oligo - GF w zagęszczeniu 2.5e5 w płytkach 6-dołkowych pokrytych PDL. Komórki utrwala się w 2% PFA w różnych punktach czasowych po usunięciu czynników wzrostu. Barwienie przeciwciałami przeprowadza się bezpośrednio na plastikowych płytkach 6-dołkowych, zamiast na szklanych lamelkach.

  1. Usunąć medium i dodać 2% PFA. Inkubować przez 10 min w RT. Odpiąć PFA. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek.
  2. Przeprowadzić permeabilizację komórek w celu wykrycia markerów wewnątrzkomórkowych, stosując 0,25% roztwór Tritonu w PBS przez 10 min w RT.
  3. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu, zablokować komórki przez 10 min za pomocą HHG (bufor HEPES 1 mM, 2% surowicy konia i 10% surowicy kozy w zrównoważonym roztworze soli Hanksa). Rozcieńczyć specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe (Tabela 2) do ustalonego stężenia w HHG. Nanieść rozcieńczone przeciwciała na komórki. Inkubować przez 1 h w RT na wytrząsarkach lub przez noc w 4 °C.
  4. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (Tabela 2) sprzężone z fluorochromem do ustalonego stężenia w HHG. Nanieść mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych na komórki. Inkubować przez 1 h w RT na wytrząsarce w ciemności.
  5. Przemyć komórki 3 razy PBS, po 5 min za każdym razem.
  6. Aby uniknąć fotobleachingu, dodać do komórek 10 μl Prolong Gold z DAPI i nałożyć na nie szklaną lamellkę. Zwizualizować znakowane komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Rycina 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bardzo ważne jest rozpoczęcie procesu różnicowania od hodowli komórek progenitorowych neuronów o konfluencji 70%-80% (Rysunek 1A). Wiele komórek obumrze po zmianie pożywki hodowlanej z pożywki dla progenitorów na pożywkę dla oligodendrocytów, ponieważ zawiera ona specyficzne czynniki wzrostu. Wskazuje to, że wzrost komórek progenitorowych neuronów, które nie są zobligowane do fenotypu oligodendrocytycznego, nie będzie wspierany przez nową pożywkę (Rysunek 1B). Inkubacja w pożywce dla oli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób otrzymywania płodowych oligodendrocytów z pierwotnych ludzkich komórek progenitorowych neuronów oraz charakteryzację ich fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunofluorescencyjnego. Ekspansja i wzrost progenitorów neuronów z płodowego OUN została bardzo dobrze opisana1-4. Jednakże pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne, mimo że możliwe jest zidentyfikowanie i wyizolowanie prekursorów gle...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badanie to było wspierane przez Wewnętrzny Program Badawczy w Narodowych Instytutach Zdrowia (NIH), NINDS. Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom Laboratorium Medycyny Molekularnej i Neuronauki, Rickowi Dreyfussowi za pomoc w mikroskopii oraz Pamele C. Sieving za pomoc w redakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/HAMS F12 1:1Omega ScientistDM-2511X
Albumina bydlęcaSigmaA94181%
GentamicynaQuality Biologicals120-098-031 50 μg/ml
L-glutaminaQuality Biologicals118-084-0612 mM
T3SigmaT28773 nM
Składniki N2Gibco BRL175021:100
NT-3PeproTech Inc450-032 ng/ml
ShhR&System amp;D1314-SH/CF2 ng/ml
bFGFPeproTech Inc100-18B20 ng/ml
PDGF-AAPeproTech Inc100-13A10 ng/ml
PDLSigmaP640750 μg/m
PFAElectron Microscopy Sciences157122%
TrypsynaQuality Biologicals118-087-721
PapainaWorthingtonLK00317820 U/ml
Fiolki z DNaząWorthingtonLK0031720.005%
EBSSWorthingtonLK003188
ProLong Gold
z DAPI		InvitrogenP36931

Tabela 1. Odczynniki.

Przeciwciała pierwszorzędowe (wszystkie w rozcieńczeniu 1: μg/ml) Gatunek, izotypRóżnicowanie ludzkich progenitorów neuronalnych w neuronalne i glejowe typy komórek stanowi model służący do badania i porównywania molekularnej regulacji rozwoju linii komórek neuronalnych. Ekspansja in vitro progenitorów neuronalnych z tkanki płodowego OUN została dobrze scharakteryzowana. Pomimo identyfikacji i izolacji progenitorów glejowych z dorosłej ludzkiej istoty białej podkorowej oraz opracowania różnych warunków hodowli w celu ukierunkowania różnicowania płodowych progenitorów neuronalnych w oligodendrocyty wytwarzające mielinę, pozyskanie wystarczającej liczby ludzkich oligodendrocytów do eksperymentów in vitro pozostaje trudne. Opisano różnicowanie prekursorów lub progenitorów oligodendrocytów (OPC) GalC+ (galaktocerebrosyd+) i O4+ z komórek prekursorowych neuronalnych z wykorzystaniem mózgu płodowego z drugiego trymestru. Jednak komórki te nie proliferują wobec braku komórek wspierających, w tym astrocytów i neuronów, i są szybko tracone w czasie hodowli. Nadal istnieje zapotrzebowanie na system hodowli umożliwiający otrzymywanie komórek linii oligodendrocytarnej odpowiednich do eksperymentów in vitro. Hodowla pierwotnych ludzkich oligodendrocytów mogłaby być, na przykład, użytecznym modelem do badania patogenezy neurotropowych czynników zakaźnych, takich jak ludzki poliomawirus JCV, który in vivo infekuje te komórki. Hodowane komórki te mogłyby również służyć jako modele innych chorób demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pierwotne, pochodzące z ludzkiego mózgu płodowego, multipotencjalne komórki progenitorowe neuronalne proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony (neurony pochodzące z progenitorów, PDN) i astrocyty (astrocyty pochodzące z progenitorów, PDA). Niniejsze badanie wykazuje, że można indukować różnicowanie progenitorów neuronalnych poprzez wiele etapów rozwoju linii oligodendrocytarnej (oligodendrocyty pochodzące z progenitorów, PDO). Hodujemy komórki progenitorowe neuronalne w bezserwatkowym medium DMEM-F12 uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), czynnik neurotroficzny 3 (NT-3), N-2 oraz trijodotyroninę (T3). Hodowane komórki są pasażowane w zagęszczeniu 2,5e6 komórek na kolby 75 cm mniej więcej co siedem dni. W tych warunkach większość komórek w hodowli zachowuje morfologię charakteryzującą się nielicznymi wypustkami i wykazuje ekspresję markerów komórek pre-oligodendrocytarnych, takich jak A2B5 i O-4. Po usunięciu czterech czynników wzrostu (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) i dodaniu medium kondycjonowanego z PDN, komórki zaczynają wytwarzać więcej wypustek i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania oligodendrocytów, takich jak GalC i podstawowe białko mieliny (MBP). Przeprowadziliśmy charakterystykę fenotypową z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przepływowej w celu identyfikacji unikalnych markerów oligodendrocytów. Przeciwciała wtórne
Cytometria przepływowa
A2B5-Biotyna Mysz IgM Gift J. Nielson Streptawidyna PETR, Invitrogen, CA
O4-FITC Mysz IgM Dar od J. Nielson
A2B5 Mysz IgM Millipore, MA gαprzeciwciało IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mysz IgM Millipore, MA gαprzeciwciało IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mysz IgG3 Millipore, MA gαmIgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBPKurczak IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestyna Mysz IgG1 Messam it al. 200028gαanty-IgG mysie1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Królik IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βtubulina III Mysz IgG2 Covance, CA gαmysie IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemia
βtubulina III
(1:1,500) 		Mysz IgG2a Covance, CA gαmysia IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Królik IgG Millipore, MA gαkrólicze IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		Kurczak IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mysz IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Królik IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Tabela 2. Przeciwciała (Ab) wykorzystane w analizach cytometrii przepływowej i immunocytochemicznej. Koniugaty przeciwciał: PE, fikocyjanina–rytryna; PETR, fyc–rythrin Texas Red; AMCA, octan aminometylokumaryny; Cy, cyjanina; FITC, izotiocyjanian fluoresceiny. Immunoglobuliny: immunoglobulina AF: Alexa Fluor; gαm: kozie przeciwko mysim; gαrb: kozia antykrólicza; dαck: osioł przeciwko kurczakowi.

Bibliografia

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5(2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neuronalne kom rki progenitorower nicowanie oligodendrocyt wcytometria przep ywowamikroskopia immunofluorescencyjnaodstawienie czynnik w wzrostumarkery oligodendrocyt wprogenitory glejowepodstawowe bia ko mieliny
System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.