Artykuł metodologiczny

Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

28.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4277

⸱

8 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1Prokaryotic Small RNA Biology, Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology

W tym artykule

Podsumowanie

Systemy CRISPR/Cas pośredniczą w odporności adaptacyjnej u bakterii i archeonów. Przypuszcza się, że wiele białek Cas pełni funkcję endorybonukleaz działających na prekursory crRNA o różnej długości. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy różne podejścia do generowania substratów pre-crRNA na potrzeby analizy biochemicznej aktywności endonukleazy Cas.

Streszczenie

Interakcje wirusów z ich prokariotycznymi gospodarzami ukształtowały ewolucję bakterii i archeonów. Prokarioty wypracowały kilka strategii unikania ataków wirusowych, do których należą modyfikacja restrykcyjna, infekcja abortywna oraz systemy CRISPR/Cas. Te adaptacyjne systemy odpornościowe, występujące u wielu bakterii i większości archeonów, składają się z sekwencji clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) oraz szeregu genów CRISPR associated (Cas) (Ryc. 1) 1-3. Różne zestawy białek Cas i powtórzeń definiują co najmniej trzy główne, rozbieżne typy systemów CRISPR/Cas 4. Przypuszcza się, że uniwersalne białka Cas1 i Cas2 uczestniczą w pobieraniu wirusowego DNA, który wytworzy nowy element dystansowy (spacer) pomiędzy dwoma powtórzeniami na końcu 5' rozszerzającego się klastra CRISPR 5. Cały klaster jest transkrybowany do pre-crRNA zawierającego wszystkie sekwencje spacerowe i powtórzenia, a następnie przetwarzany przez enzym z różnorodnej rodziny Cas6 na mniejsze cząsteczki crRNA 6-8. crRNA te składają się z sekwencji spacerowej flankowanej przez znacznik końcowy 5' (8 nukleotydów) oraz znacznik końcowy 3' pochodzący z sekwencji powtórzenia 9. Ponowna infekcja wirusem może teraz zostać zablokowana, ponieważ nowe crRNA zostanie skierowane przez kompleks białek Cas (Cascade) do wirusowego DNA i zidentyfikuje go dzięki komplementarności zasad10. Ostatecznie, w systemach CRISPR/Cas typu 1, nukleaza Cas3 niszczy wykryte DNA najeźdźcy 11,12.

Procesy te definiują CRISPR/Cas jako adaptacyjny układ odpornościowy prokariotów i otworzyły fascynującą dziedzinę badań nad zaangażowanymi w ten proces białkami Cas. Funkcja wielu białek Cas pozostaje niejasna, a przyczyny pozornej różnorodności systemów CRISPR/Cas wymagają dalszego wyjaśnienia. Potencjalne aktywności większości białek Cas przewidziano za pomocą szczegółowych analiz komputerowych. Wykazano lub zasugerowano, że znaczna część białek Cas pełni funkcję endonukleaz 4.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania crRNA oraz prekursorów-crRNA do badań nad endoribonukleazami Cas. Różne testy aktywności endonukleazy wymagają albo krótkich sekwencji powtórzeń, które mogą być bezpośrednio syntetyzowane jako oligonukleotydy RNA, albo dłuższych sekwencji crRNA i pre-crRNA generowanych poprzez transkrypcję in vitro polimerazą RNA T7. Metodologia ta umożliwia wbudowanie nukleotydów promieniotwórczych w celu wytworzenia wewnętrznie znakowanych substratów dla endonukleaz oraz tworzenie syntetycznych lub zmutowanych crRNA. Aktywność endonukleazy Cas6 jest wykorzystywana do dojrzewania pre-crRNA do postaci crRNA z końcem 5'-hydroksylowym oraz 2',3'-cyklicznym fosforanem na końcu 3'.

Protokół

1. Generowanie długich substratów pre-crRNA za pomocą PCR

  1. Zaprojektować startery PCR nakierowane na regiony spacerowe klastra CRISPR. Do startera forward dodać sekwencję promotora polimerazy RNA T7 (T7RNAP) (5' -taatacgactcactata-3'), a do obu starterów miejsca restrykcyjne umożliwiające klonowanie produktu PCR do wektora (np. BamHI i Hind III dla pUC19, Rys. 2A).
    Uwaga: T7RNAP wymaga obecności reszty guanidyny do prawidłowej inicjacji transkrypcji.
  2. Przeprowadzić amplifikację PCR interesującej sekwencji pre-crRNA z DNA genomicznego.
  3. Rozdzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wyciąć pożądany prążek z żelu. Strawić produkt PCR enzymami restrykcyjnymi w celu utworzenia lepkich końców (np. BamHI i HindIII, Rys. 2A). Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, aby usunąć produkty uboczne cięcia.
  4. Przygotować reakcję ligacji zawierającą ligazę DNA T4, bufor do ligazy DNA T4 oraz produkt PCR po trawieniu i zdefosforylowany liniowy wektor pUC z odpowiadającymi lepkimi końcami w stosunku molowym 3:1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 16 °C przez noc. Przenieść mieszaninę ligacyjną do kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami i zastosować selekcję biało-niebieską w celu zidentyfikowania udanych ligacji.
  5. Wyizolować plazmidy z białych kolonii przy użyciu zestawu do preparatyki plazmidów. Zidentyfikować pozytywne klony poprzez sekwencjonowanie plazmidów. Alternatywnie, do przesiewania można wykorzystać PCR kolonii.

2. Generowanie pośrednich substratów pre-crRNA poprzez hybrydyzację oligonukleotydów DNA

  1. Zaprojektuj oligonukleotydy forward i reverse z pożądaną sekwencją powtórzeń/spacerów CRISPR. Oligonukleotydy zawierają sekwencję promotora T7 RNAP oraz terminalne miejsca restrykcyjne (np. BamHI i Hind III dla pUC19). Zakończ oligonukleotydy w sposób zapewniający powstanie lepkich końców po wyżarzaniu (patrz Rys. 2B).
  2. Przeprowadź 5'-fosforylację 1 nmol każdego oligonukleotydu w oddzielnej reakcji o objętości 20 μl zawierającej 5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK), 2 μl buforu 10x do T4 PNK oraz 2 μl ATP (10 mM). Inkubuj każdą próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Zhybrydyzuj dwa fosforylowane oligonukleotydy. Połącz 1 μl mieszaniny fosforylowanego oligo forward (z punktu 2.2.), 1 μl mieszaniny fosforylowanego oligo reverse (z punktu 2.2.) oraz 1 μl buforu 10x do T4 DNA ligazy w reakcji o objętości 10 μl. Inkubuj próbki przez 5 min w 95 °C na bloku grzewczym lub w wrzącej wodzie, wyłącz źródło ciepła i pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej (~2-3 godziny).
    Uwaga: W tym krytycznym etapie powolny proces chłodzenia sprzyja wyżarzaniu dwóch oligonukleotydów w porównaniu do tworzenia struktur w obrębie pojedynczego oligonukleotydu.
  4. Przeprowadź ligację 4 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej oraz 1 μl trawionego i defosforylowanego wektora pUC (0,1 μg/μl) z użyciem T4 DNA ligazy, buforu 10x do T4 DNA ligazy i 10 mM ATP w 20 μl mieszaniny ligacyjnej. Inkubuj próbkę w 16 °C przez noc.
  5. Transformuj ligowane plazmidy do kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α zgodnie ze standardowymi protokołami i zastosuj selekcję niebiesko-białą. Izoluj plazmidy i identyfikuj pozytywne klony poprzez trawienie (w celu weryfikacji insertów o pożądanej wielkości) oraz następujące po nim sekwencjonowanie plazmidów.

3. Generowanie krótkich substratów Cas RNA poprzez syntezę niestandardowych oligonukleotydów RNA

Zaprojektuj krótkie substraty RNA dla Cas (np. sekwencje pojedynczych powtórzeń, Rys. 2C) i skorzystaj z usług komercyjnej syntezy oligonukleotydów RNA.

Uwaga: Wprowadzenie deoksyrybonukleotydu w określonej pozycji oligonukleotydu RNA (Rys. 2C) może zostać wykorzystane do precyzyjnego wskazania miejsca rozcięcia RNA.

4. Transkrypcja in vitro za pomocą polimerazy RNA T7

  1. Wyizoluj plazmidy z zaprojektowaną konstrukcją (z pkt 1.9. lub 2.7.) przy użyciu zestawu do maxiprepu służącego do oczyszczania plazmidów.
  2. Zlinearyzuj plazmid za pomocą enzymu restrykcyjnego, który tnie w miejscu poniżej sklonowanego fragmentu (np. HindIII). Upewnij się, że trawienie przebiegło całkowicie.
    Uwaga: Jeśli pożądany jest odmienny, zdefiniowany koniec 3' transkryptu RNA, zaprojektowana konstrukcja powinna zawierać dodatkową specyficzną sekwencję rozpoznawania enzymu restrykcyjnego do transkrypcji typu „run-off” powyżej sekwencji HindIII.
  3. Oczyść zlinearyzowany plazmid poprzez ekstrakcję fenol:chloroform (1:1) oraz precypitację etanolem. Odzyskaj kwasy nukleinowe, resuspendując osad w sterylnej wodzie traktowanej DEPC.
  4. Przygotuj mieszaninę do transkrypcji in vitro typu run-off z wykorzystaniem T7 RNAP, zawierającą 40 mM Hepes/KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidynę, 4 mM każdego nukleozydotrifosforanu (ATP, CTP, GTP, UTP), 40-100 μg/ml strawionego plazmidu oraz 0.1 mg/ml T7 RNAP w wodzie traktowanej DEPC. Inkubuj przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Przeanalizuj otrzymane transkrypty RNA na denaturującym żelu poliakrylamidowym 12% z 8 M mocznikiem (Rys. 3A). Transkrypty RNA można oczyścić za pomocą chromatografii wymiany anionowej Mono Q13 i odzyskać poprzez precypitację etanolem frakcji RNA oraz resuspensję osadu w sterylnej wodzie traktowanej DEPC. Do późniejszego wykorzystania przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.

5. Test endonukleazy Cas6

  1. Przygotuj 20 μl in vitro mieszanina do transkrypcji z T7 RNAP (patrz 4.4), zawierająca zmniejszoną ilość ATP (2 mM) i uzupełniona o 2.5 μl α-[32[P]-ATP (10 mCi/ml, 5000 Ci/mmol). Produkty reakcji należy oczyścić poprzez ekstrakcję z żelu z denaturującego żelu poliakrylamidowego 12% z dodatkiem 8 M mocznika. Prążki należy uwidocznić za pomocą autoradiografii.
  2. Wytworzyć i oczyścić pożądane rekombinowane białka Cas. W tym przykładzie białko Cas6 z Clostridium thermocellum oczyszczono metodą precypitacji termicznej oraz chromatografii Ni-NTA.
  3. Przygotuj reakcję testu endonukleazy (np. dla Clostridium thermocellum Cas6, mieszanina reakcyjna zawiera 20 mM Hepes (KOH pH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12 000 cpm substratu RNA oraz 1 μM enzym i inkubowano w 37 °C przez 30 min).
  4. Załaduj 5 μl mieszaniny reakcyjnej (+ 10 μl bufor do ładowania RNA zawierający 95% formamid) na żel poliakrylamidowy 12% z 8 M mocznikiem. Produkty cięcia po elektroforezie należy zwizualizować za pomocą autoradiografii.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład substratów RNA do analizy aktywności endonukleazy Cas przedstawiono na rysunku 3A. Nanoszono alikwot 5 μl z analitycznej reakcji transkrypcji in vitro o objętości 100 μl. Należy pamiętać, że wydajność produkcji RNA różni się w zależności od zastosowanych konstruktów. Zaobserwowano, że na ilość uzyskanego RNA wpływają następujące czynniki: (i) sekwencja początkowa następująca po +1G niezbędnym do inicjacji transkrypcji, (ii) możliwość tworzenia się struktur RNA podczas transkrypcji oraz (iii) wybór miejsca restrykcyjnego dla wygenerowania pozycji cięcia run-off.

Badanie aktywności endonukleazy RNA wymaga zarówno wysoce oczyszczonych rekombinowanych białek Cas (Ryc. 3B), jak i odpowiednich kontroli negatywnych. W idealnym przypadku próbka kontroli negatywnej różni się jak najmniej od badanej reakcji endonukleazy Cas. Można to osiągnąć poprzez inkubację RNA z buforem reakcyjnym i lizatem komórkowym bez ekspresji Cas (stosując identyczną procedurę oczyszczania). Idealną kontrolą negatywną jest dodanie deoksyrybonukleotydu w proponowanym miejscu cięcia. Na Ryc. 3C przedstawiono cięcie sekwencji powtórzonej znakowanej na końcu 5' dla Cas6 z Clostridium thermocellum. W identycznych warunkach powtórzenie to przestaje być substratem, gdy w pozycji -9 wprowadzony zostanie deoksyrybonukleotyd. Metoda ta dostarcza również informacji o miejscu cięcia. Na koniec, długie, znakowane wewnętrznie pre-crRNA zostaje przecięte przez Cas6, co pozwala na zaobserwowanie dwóch fragmentów cięcia.

Schemat CRISPR: proces edycji genów, interakcja Cas1-Cas3, transkrypcja crRNA, etapy interferencji.
Rycina 1. Schematyczny przegląd aktywności CRISPR/Cas. Przegląd przedstawia insercję wirusowej sekwencji DNA (protospacera) do klastra CRISPR (adaptacja), transkrypcję i przetwarzanie macierzy CRISPR w małe crRNA przez endonukleazę Cas6, wbudowanie crRNA do kompleksu Cascade oraz interferencję w przypadku ponownego ataku wirusa w oparciu o komplementarność między crRNA a protospacerem. Motywy sąsiednie protospacera (PAM) oznaczają wirusowe sekwencje protospacerów.

Proces transkrypcji pre-crRNA CRISPR; schemat przedstawia etapy amplifikacji PCR i transkrypcji in vitro.
Rycina 2. Generowanie substratów RNA dla białek Cas. Schemat przedstawia przebieg procesu generowania (A) długich substratów pre-crRNA, (B) pośrednich substratów pre-crRNA oraz (C) krótkich substratów RNA Cas do produkcji pre-crRNA. Przedstawiono przykładowe sekwencje dla macierzy CRISPR Clostridium thermocellum. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Substraty RNA i wyniki testu endonukleazy Cas6; schemat żelu elektroforetycznego; prążek białka 28 kDa.
Rysunek 3. Test endonukleazy Cas6. A.) Żel poliakrylamidowy barwiony błękitem toluidyny z zastosowaniem zaprojektowanego na zamówienie oligonukleotydu RNA (250 pmol) oraz dwóch transkryptów RNA in vitro (5 μl z typowej reakcji o objętości 100 μl). B.) Żel SDS-PAGE preparatu Cas6 (80 pmol) z Clostridium thermocellum po wytrąceniu termicznym w 50°C przez 1 godzinę i chromatografii Ni-NTA. C.) Wykrywanie aktywności endonukleolitycznej Cas6 dla sekwencji powtórzeń znakowanych na końcu 5' oraz transkryptów pre-crRNA in vitro. Wprowadzenie dNTP w pozycji -9 znosi cięcie przez Cas6 w przypadku krótkiego substratu RNA Cas (S, Rys. 2C). Dla dojrzewania crRNA z długich substratów pre-crRNA generowany jest również 8 nt znacznik na końcu 5' (L, Rys. 2A). Prążki rozdzielono na denaturującym żelu poliakrylamidowym 12% z 8 M mocznikiem i wizualizowano za pomocą autoradiografii.

Dyskusja

Przedstawione metody umożliwiają generowanie substratów dla endonukleazy Cas o różnych zakresach wielkości oraz z różnym stopniem swobody w projektowaniu sekwencji. Najprostsze podejście do generowania syntetycznych substratów oligonukleotydowych RNA ogranicza się do krótkich projektów RNA ze względu na rosnące koszty i ograniczenia techniczne w tworzeniu dłuższych oligomerów RNA. Chociaż raportowano pomyślną syntezę niemodyfikowanych oligomerów RNA o długości powyżej 100 nukleotydów, praktyczne i ekonomiczne maksimum dla syntezy RNA na zamówienie wynosi poniżej 40 nukleotydów. Jednakże można zsyntetyzować dowolną daną sekwencję, a celowe wprowadzenie zmodyfikowanych nukleotydów (np. ldeoksyrybonukleotydów) może zostać wykorzystane do szczegółowej analizy miejsc cięcia. Dłuższe pre-cRNA należy generować poprzez transkrypcję in vitro.

Hybrydyzacja oligonukleotydów zawierających promotor polimerazy RNA T7 umożliwia produkcję pre-crRNA o średniej długości. Maksymalna długość rutynowo i ekonomicznie syntetyzowanych oligonukleotydów DNA wynosi nieco ponad 150 nukleotydów, co stanowi limit długości syntetycznych pre-crRNA otrzymywanych tą metodą. Złożenie kilku sparowanych oligonukleotydów DNA, które tworzą ze sobą lepkie końce, pozwala zwiększyć tę maksymalną długość, jednak wiąże się to z coraz większymi trudnościami podczas klonowania konstruktu. Główną zaletą tej metody jest możliwość generowania konstruktów pre-crRNA (a tym samym substratów dla endonukleazy Cas) o dowolnej pożądanej sekwencji. Pozwala to na testowanie syntetycznych projektów crRNA.

Wreszcie, większe pre-crRNA można uzyskać z amplikonów PCR całych genomicznych elementów CRISPR lub ich fragmentów. Zmiany w plazmidzie będącym matrycą do transkrypcji in vitro można wprowadzić za pomocą mutagenezy celowanej w celu wygenerowania wariantów pre-crRNA. Konstrukcje te mogą być wykorzystane do analizy globalnego wzorca cięcia endonukleolitycznego w obrębie całego pre-crRNA.

Pionierskie prace nad produkcją niemodyfikowanego RNA za pomocą transkrypcji in vitro polimerazą RNA T7 opierały się na tRNA 14 oraz RNA wirusa mozaiki bromii 15. Konsensusowy promotor polimerazy RNA T7 składa się z domeny rozpoznawczej (od -17 do -5) oraz domeny inicjującej (od -4 do +6), przy czym inicjacja transkrypcji następuje w kluczowej pozycji guanozyny +1 16. Pozycje poniżej +1 mogą być zmienne, co pozwala na transkrypcję niemal każdej pożądanej sekwencji RNA. Przedstawione metody generowania matryc do transkrypcji typu run-off in vitro umożliwiają syntezę in vitro kompletnych pre-crRNA, które odpowiadają genomowym regionom CRISPR lub syntetycznym wariantom pre-crRNA. Transkrypty są generowane z obecnością trifosforanu na końcu 5', chyba że reakcja transkrypcji jest inicjowana GMP w celu uzyskania końców monofosforanowych 5' 14. Takie końce są wymagane, jeśli transkrypty mają być znakowane za pomocą polinukleotydowej kinazy T4 i γ-[32P]-ATP. Aktywność tnąca enzymów Cas6 i enzymów typu Cas6 generuje crRNA zawierające grupę hydroksylową na końcu 5' oraz cykliczny fosforan 2',3'. Takie cząsteczki RNA mogą następnie zostać poddane analizie pod kątem rozpoznawania przez kompleks Cascade.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jeanette Schermuly za przygotowanie rekombinowanej polimerazy RNA T7 oraz Normanowi Ebeltowi za pomoc w przygotowaniu Rysunku 1. Praca ta była finansowana ze środków Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) oraz Max Planck Society.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosfataza antarktycznaNEBM0289L
in vitro Ultra-czyste nukleotydotrifosforany do transkrypcjiJena BioscienceNU-1010 - NU-1013
Chromatografia cieczowa, ktapurifier 100GE Healthcare
Oligonukleotydy DNAMWG Operon
Oligonukleotydy RNAMWG Operon
Zestaw do ekstrakcji z żeluQIAGEN28704
Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28104
Zestaw Spin MiniprepQIAGEN27106
Zestaw Plasmid MaxiQIAGEN12163
BamHINEBR0136L
HindIIINEBR0104L
Ligaza T4 DNANEBM0202S
Kinaza polinukleotydowa T4AmbionAM2310
Polimeraza RNA T7własna preparatyka
Mieszanka roztworów deoksynukleotydówNEBN0447L
System elektroforetyczny Mini-PROTEAN TetraBio-Rad165-8001
Skaner Storm 840GE Healthcare163723
Ekran fosforowy do przechowywaniaMolecular Dynamics63-0034-81
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare17-5166-01
Polimeraza DNA Phusion High-FidelityNEBM0530Lużyć buforu GC
Błękit toluidynySigmaT3260
pUC19NEBN3041S
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP Hartmann AnalyticSRP-401, SRP-307

Bibliografia

  1. Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  2. Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7(2006).
  3. Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
  4. Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
  5. Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
  6. Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
  7. Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
  8. Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
  9. Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
  10. Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
  11. Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
  12. Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
  13. Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
  14. Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
  15. Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
  16. McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Testy endonukleaztranskrypcja in vitrogenerowanie substratu RNAendonukleaza Cas6polimeraza RNA T7elektroforeza w eluautoradiografiaoczyszczanie plazmid wwbudowywanie nukleotyd w

Powiązane artykuły