Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i identyfikacja bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych

DOI:

10.3791/4282

⸱

23 kwietnia 2013

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę testu elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Test obejmuje matrycę czujników funkcjonalizowaną sondami wychwytującymi oligonukleotydy DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja warstwowa docelowego rRNA za pomocą sondy wychwytującej i sondy detektora oligonukleotydów DNA połączonej z peroksydazą chrzanową wytwarza mierzalny prąd amperometryczny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czujniki elektrochemiczne są powszechnie używane do szybkiego i dokładnego pomiaru stężenia glukozy we krwi i mogą być przystosowane do wykrywania szerokiej gamy analitów. Czujniki elektrochemiczne działają poprzez przekształcanie zdarzenia rozpoznania biologicznego w użyteczny sygnał elektryczny. Transdukcja sygnału zachodzi poprzez sprzężenie aktywności enzymu redoks z elektrodą amperometryczną. Swoistość czujnika jest albo nieodłączną cechą enzymu, oksydazy glukozowej w przypadku czujnika glukozy, albo produktem połączenia między enzymem a przeciwciałem lub sondą.

Tutaj opisujemy metodę testowania czujników elektrochemicznych do bezpośredniego wykrywania i identyfikacji bakterii. W każdym przypadku opisywane tutaj sondy są oligonukleotydami DNA. Metoda ta opiera się na hybrydyzacji warstwowej sond wychwytujących i detektorowych z docelowym rybosomalnym RNA (rRNA). Sonda wychwytująca jest zakotwiczona na powierzchni czujnika, podczas gdy sonda detektora jest połączona z peroksydazą chrzanową (HRP). Gdy substrat, taki jak 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) jest dodawany do elektrody z kompleksami wychwytująco-celu-detektora związanymi z jej powierzchnią, substrat jest utleniany przez HRP i redukowany przez elektrodę roboczą. Ten cykl redoks powoduje przenoszenie elektronów przez podłoże z elektrody do HRP, wytwarzając przepływ prądu w elektrodzie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie rRNA jako cząsteczki docelowej do wykrywania i identyfikacji bakterii ma wiele zalet. Obfitość rRNA w komórkach bakteryjnych zapewnia limit czułości wynoszący zaledwie 250 bakterii na mililitr bez konieczności docelowej amplifikacji 1. Bakteryjne rRNA zawiera unikalne sekwencje specyficzne dla gatunku, które są dostępne do hybrydyzacji z sondami DNA. W związku z tym do identyfikacji nieznanych bakterii można wykorzystać szereg czujników elektrochemicznych, z których każdy jest funkcjonalizowany za pomocą innej sondy wychwytującej specyficznej dla gatunku. Czujniki kontroli dodatniej powinny być dołączone do syntetycznego celu oligonukleotydowego, który "łączy" sondy wychwytujące i wykrywające w celu wytworzenia wewnętrznego sygnału kalibracyjnego.

Czujniki elektrochemiczne mają szeroki zakres zastosowań w badaniach podstawowych i translacyjnych. Na przykład opisany tutaj test został wykorzystany do precyzyjnego pomiaru wpływu fazy wzrostu E. coli na liczbę kopii rRNA i pre-rRNA, co jest bardzo interesujące dla badaczy zainteresowanych fizjologią bakterii 2. Czułość testu czujnika elektrochemicznego zależy od stosunku sygnału do szumu. Zbadano różne metody wzmacniania sygnału i redukcji szumów. Odkryliśmy, że poprawa składu chemicznego powierzchni czujnika jest kluczem do zmniejszenia niespecyficznego wiązania sondy detektora i/lub enzymu HRP. W szczególności stwierdzono, że mieszana monowarstwa alkanedithioli i merkaptoheksanolu zmniejsza tło poprzez pełniejsze pokrycie powierzchni elektrody, zachowując jednocześnie dostępność sondy wychwytującej do hybrydyzacji docelowej 3. Te zabiegi chemii powierzchni są szczególnie ważne w przypadku testów obejmujących złożone próbki biologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Funkcjonalizacja czujników elektrochemicznych

  1. Przygotować tiolowaną sondę wychwytującą o stężeniu 0,05 μM w 300 μM 1,6-heksanodiolu (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Inkubacja tiolowanej sondy wychwytującej z HDT zapewnia zmniejszenie grupy tiolowej na sondzie wychwytującej, co skutkuje bardziej spójnymi wynikami.
  2. Nałóż strumień azotu na gołe złote 16 chipów matrycy czujników na 5 sekund, aby usunąć wilgoć i/lub cząstki stałe.
  3. Nanieść 6 μl mieszaniny HDT z tiolowaną sondą wychwytującą na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników w układzie czujników i przechowywać chip(y) czujnika na przykrytej szalce Petriego w temperaturze 4 °C przez noc. Tiolowane sondy wychwytujące wiążą się bezpośrednio z gołą złotą elektrodą, a HDT zapobiega przepakowaniu sond wychwytujących i utrzymuje je w przedłużonej konformacji, która sprzyja hybrydyzacji z celem.
  4. Następnego dnia umyj chip czujnika dejonizowanymH2Oprzez 2-3 sekundy i susz pod strumieniem azotu przez 5 sekund.
  5. Nałożyć 6 μl 10 mM Tris-HCl o pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubować przez 50 minut. Ta i wszystkie kolejne inkubacje chipów czujnika są przeprowadzane na przykrytej szalce Petriego w temperaturze pokojowej. MCH działa jako środek blokujący, wypełniając wszelkie luki, w których tiolowana sonda wychwytująca lub HDT nie jest obecna na powierzchni elektrody.

2. Przygotowanie próbki

  1. Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 ≈ 0,1) do probówki do mikrowirówki i odwirowywać przy 16 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant hodowli. Osad bakteryjny może być natychmiast przetworzony lub przechowywany w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Dokładnie zawiesić osad bakteryjny w 10 μl 1 M NaOH, przykładając końcówkę pipety do dna probówki mikrowirówki i kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Zneutralizować lizat bakteryjny przez dodanie 50 μl 1 M buforu fosforanowego o pH 7,2, zawierającego 2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,25 mM sondy detektora zmodyfikowanej fluoresceiną. Inkubować zobojętniony lizat przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Sondy detektorowe zmodyfikowane fluoresceiną hybrydyzują z docelowymi cząsteczkami rRNA bakterii.

3. Test elektrochemiczny

  1. Umyj MCH z chipa czujnika dejonizowanymH2Oprzez 2-3 sekundy i susz pod strumieniem azotu przez 5 sekund.
  2. Nałożyć 4 μl zneutralizowanego lizatu bakteryjnego na elektrodę roboczą każdego z 14 czujników i inkubować przez 15 minut. Kompleksy sondy cel-detektor hybrydyzują się z immobilizowanymi tiolowanymi sondami wychwytującymi.
  3. Nałożyć 4 μl oligonukleotydu mostkowego 1 nM w 1 M buforze fosforanowym o pH 7,2, zawierającym 2,5% BSA i 0,25 μM sondy detektorowej zmodyfikowanej fluoresceiną do 2 czujników kontroli dodatniej (używanych do normalizacji sygnału) i inkubować przez 15 minut.
  4. Umyj chip czujnika dejonizowanymH2Oprzez 2-3 sekundy i susz pod strumieniem azotu przez 5 sekund.
  5. Nałożyć 4 μl 0,5 U/ml anty-fluoresceiny-HRP w 1 M buforze fosforanowym o pH 7,2, zawierającym 0,5% kazeiny na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubować przez 15 minut. Anty-Fluoresceina-HRP wiąże się z unieruchomionymi sondami detektora zmodyfikowanymi fluoresceiną.
  6. Umyj chip czujnika dejonizowanymH2Oprzez 2-3 sekundy i susz pod strumieniem azotu przez 5 sekund.
  7. Nałóż naklejkę z folią na powierzchnię chipa czujnika i załaduj do mocowania chipa czujnika. Odpipetować 50 μl podłoża TMB na wszystkie 16 czujników i zamknąć mocowanie chipa czujnika.
  8. Uzyskaj pomiary amperometrii i woltamperometrii cyklicznej dla wszystkich 16 czujników za pomocą czytnika chipów Helios. Prąd amperometryczny jest proporcjonalny do szybkości redukcji TMB na powierzchni czujnika (patrz rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy test elektrochemiczny, który ma strukturę podobną do testu ELISA typu kanapkowego. Jak pokazano na rysunku 1, hybrydyzacja docelowego rybosomalnego RNA (rRNA) z sondami wychwytującymi i detektorowymi jest rozwijana przez reakcję redoks katalizowaną przez HRP sprzężoną z fragmentami przeciwciała anty-fluoresceinowego, które wiążą się z wiązaniem 3' fluoresceiny na sondzie detektora. Ważnym elementem czułości testu jest skład chemiczny powierzchni złotej elektrody. Odkryliśmy, że trójskładnikowa ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test elektrochemiczny czujnika umożliwia szybkie wykrywanie celów kwasów nukleinowych. Czułość i swoistość zależą częściowo od energii swobodnej hybrydyzacji cel-sonda, która z kolei zależy od długości i zawartości GC sond wychwytujących i detektorowych. Zazwyczaj wykonujemy etapy hybrydyzacji w temperaturze otoczenia (~20 °C) 5, 6. Jednak etapy hybrydyzacji (3.2 i 3.3) można również przeprowadzić w wyższych temperaturach w piecu do hybrydyzacji, jeśli chip zostanie umieszczony w zakrytej komorze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są wynalazcami patentów związanych z opisanymi metodami. Jeden z tych patentów został licencjonowany przez Qvella Corporation. B.M.C. i D.A.H. posiadać udziały w Qvella Corporation. V.G. jest prezesem firmy GeneFluidics, która jest producentem układu matrycy czujników elektrochemicznych, mocowania chipa i czytnika chipów opisanego w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Cooperative Agreement Award AI075565 (dla D.A.H.) z National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz przez Wendy and Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. B.M.C. jest Katedrą Urologii Dziecięcej im. Judith i Roberta Winstonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-merkapto-1-heksanol (MCH)Sigma451088Przechowywać w temperaturze pokojowej
1,6-heksanodiol (HDT)SigmaH-12005Przechowywać w temperaturze pokojowej
Tiolowane sondy wychwytująceOperonN/APrzechowywać w temperaturze 100 μ M w 0,1x TE przy -20 ° C
Sondy detektorowe modyfikowane fluoresceinąOperonN/A Przechowywaćw temperaturze 100 μ M w 0,1x TE przy -20 ° C
Mostkowanie oligonukleotyduOperonN/A Przechowywaćw 100 μ M w 0,1x TE przy -20 ° C
Anti-Fluorescein-HRP, Fragmenty FabRoche11 426 346 910Przechowywać pod adresem 4 & deg; C
Czytnik chipów HeliosGeneFluidicsGFR-2009
Uchwyt chipowy do czujnikaGeneFluidicsGFR-003
Naklejka na studnię filmowąGeneFluidicsDostarczane z chipami czujników
Bare gold 16-sensorowe układy matrycowe GeneFluidicsSC1000-16X-BPrzechowywać w 100% N2 w temperaturze pokojowej
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906Sklep pod adresem 4 °
Bufor fosforanowy C 1M, pH 7,2 0,35 M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, dostosowany do pH 7,2
Kazeina blokująca w PBS Pierce37528Rozcieńczyć równą objętością 1M buforu fosforanowego, pH 7,2, przechowywać w temperaturze 4 & st.; C
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rybosomalny RNAhybrydyzacja kanapkowaperoksydaza chrzanowasubstrat TMBchip matrycy sensorowejsonda wychwytuj casonda detekcyjnakoniugat z fluorescein

Powiązane artykuły