Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Czujniki elektrochemiczne są szeroko stosowane do szybkiego i dokładnego pomiaru poziomu glukozy we krwi i mogą być adaptowane do wykrywania szerokiej gamy analitów. Czujniki elektrochemiczne działają poprzez przekształcanie biologicznego zdarzenia rozpoznawczego w użyteczny sygnał elektryczny. Przetwarzanie sygnału odbywa się poprzez sprzęgnięcie aktywności enzymu redoks z elektrodą amperometryczną. Specyficzność czujnika jest albo cechą wrodzoną enzymu – w przypadku czujnika glukozy jest to oksydaza glukozowa – albo wynikiem powiązania enzymu z przeciwciałem lub sondą.
W niniejszej pracy opisujemy metodę testu z wykorzystaniem sensora elektrochemicznego do bezpośredniej detekcji i identyfikacji bakterii. We wszystkich opisanych przypadkach sondami są oligonukleotydy DNA. Metoda ta opiera się na hybrydyzacji typu kanapkowego sond wychwytującej i detekcyjnej z docelowym rybosomalnym RNA (rRNA). Sonda wychwytująca jest zakotwiczona na powierzchni sensora, natomiast sonda detekcyjna jest połączona z peroksydazą chrzanową (HRP). Po dodaniu substratu, takiego jak 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB), do elektrody z przywiązanymi do jej powierzchni kompleksami sonda wychwytująca-cel-sonda detekcyjna, substrat ulega utlenieniu przez HRP i redukcji przez elektrodę roboczą. Ten cykl redoks prowadzi do transportu elektronów przez substrat z elektrody do HRP, co generuje przepływ prądu w elektrodzie.
Wprowadzenie
Wykorzystanie rRNA jako cząsteczki docelowej do wykrywania i identyfikacji bakterii wiąże się z szeregiem zalet. Obfitość rRNA w komórkach bakteryjnych pozwala na osiągnięcie granicy czułości na poziomie zaledwie 250 bakterii na mililitr bez konieczności amplifikacji celu 1. Bakteryjne rRNA zawiera unikalne, gatunkowo specyficzne sekwencje, które są dostępne dla hybrydyzacji z sondami DNA. W związku z tym można zastosować macierz czujników elektrochemicznych do identyfikacji nieznanych bakterii, w której każdy czujnik jest funkcjonalizowany inną, gatunkowo specyficzną sondą wychwytującą. Należy uwzględnić czujniki kontroli pozytywnej dla syntetycznego oligonukleotydu docelowego, który „mostkuje” sondy wychwytującą i detekcyjną, tworząc wewnętrzny sygnał kalibracyjny.
Czujniki elektrochemiczne znajdują szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych i translacyjnych. Na przykład opisany tutaj test został wykorzystany do precyzyjnego pomiaru wpływu fazy wzrostu E. coli na liczbę kopii rRNA i pre-rRNA, co jest przedmiotem dużego zainteresowania badaczy fizjologii bakterii 2. Czułość testu z użyciem czujnika elektrochemicznego jest określana przez stosunek sygnału do szumu. Zbadano szereg metod wzmacniania sygnału i redukcji szumów. Ustalono, że kluczem do ograniczenia niespecyficznego wiązania sondy detekcyjnej i/lub enzymu HRP jest udoskonalenie chemii powierzchni czujnika. W szczególności stwierdzono, że mieszana monowarstwa alkanoditioli i merkaptokeksanolu redukuje tło, dokładniej pokrywając powierzchnię elektrody, przy jednoczesnym zachowaniu dostępności sondy wychwytującej dla hybrydyzacji z celem 3. Takie zabiegi w zakresie chemii powierzchni są szczególnie istotne w przypadku testów z wykorzystaniem złożonych próbek biologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Funkcjonalizacja czujników elektrochemicznych
- Przygotować tiolowaną sondę wychwytującą o stężeniu 0,05 μM w 300 μM 1,6-heksanditiolu (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 min. Inkubacja tiolowanej sondy wychwytującej z HDT zapewnia redukcję grupy tiolowej w sondzie, co prowadzi do uzyskania bardziej powtarzalnych wyników.
- Kierować strumień azotu na odsłonięte złote powierzchnie 16 matrycy czujników przez 5 s w celu usunięcia wilgoci i/lub cząstek.
- Nanieść 6 μl mieszaniny HDT i tiolowanej sondy wychwytującej na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników matrycy i przechowywać chipy w przykrytej płytce Petriego w temperaturze 4 °C przez noc. Tiolowane sondy wychwytujące wiążą się bezpośrednio z odsłoniętą elektrodą złotą, a HDT zapobiega zbyt gęstemu upakowaniu sond i utrzymuje je w rozciągniętej konformacji, co sprzyja hybrydyzacji z celem.
- Następnego dnia przemyć chip czujnika dejonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osuszyć strumieniem azotu przez 5 s.
- Nanieść 6 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA i 1 mM 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubować przez 50 min. Ta oraz wszystkie kolejne inkubacje chipów są przeprowadzane w przykrytej płytce Petriego w temperaturze pokojowej. MCH działa jako środek blokujący, wypełniając wszelkie luki na powierzchni elektrody, w których nie ma tiolowanej sondy wychwytującej ani HDT.
2. Przygotowanie próbek
- Przenieś 1 ml kultury bakteryjnej w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 ≈ 0.1) do probówki do mikrowirówki i wiruj przy 16,000 x g przez 5 min. Usuń nadsącz kultury. Osad bakteryjny można przetworzyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
- Dokładnie resuspenduj osad bakteryjny w 10 μl 1 M NaOH, przykładając końcówkę pipety do dna probówki do mikrowirówki i kilkukrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubuj zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Zneutralizuj lizat bakteryjny, dodając 50 μl 1 M buforu fosforanowego o pH 7.2, zawierającego 2.5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0.25 mM modyfikowanej fluoresceiną sondy detekcyjnej. Inkubuj zneutralizowany lizat przez 10 min w temperaturze pokojowej. Modyfikowane fluoresceiną sondy detekcyjne hybrydyzują z docelowymi cząsteczkami bakteryjnego rRNA.
3. Analiza za pomocą czujnika elektrochemicznego
- Przemyj chip czujnika z MCH odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.
- Nanieś 4 μl zneutralizowanego lizatu bakteryjnego na elektrodę roboczą każdego z 14 czujników i inkubuj przez 15 min. Kompleksy sonda-detektor hybrydyzują z unieruchomionymi tiolowanymi sondami przechwytującymi.
- Nanieś 4 μl 1 nM oligonukleotydu łączącego w 1 M buforze fosforanowym o pH 7.2, zawierającym 2,5% BSA oraz 0,25 μM modyfikowanej fluoresceiną sondy detekcyjnej, na 2 czujniki kontrolne dodatnie (używane do normalizacji sygnału) i inkubuj przez 15 min.
- Przemyj chip czujnika odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.
- Nanieś 4 μl 0,5 U/ml przeciwciała anty-Fluoresceina-HRP w 1 M buforze fosforanowym o pH 7.2, zawierającym 0,5% kazeiny, na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubuj przez 15 min. Przeciwciało anty-Fluoresceina-HRP wiąże się z unieruchomionymi modyfikowanymi fluoresceiną sondami detekcyjnymi.
- Przemyj chip czujnika odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.
- Naklej naklejkę z dołkami filmowymi na powierzchnię chipu czujnika i zamocuj go w uchwycie do chipów. Pipetuj 50 μl podłoża TMB na wszystkie 16 czujników i zamknij uchwyt do chipów.
- Wykonaj pomiary amperometrii i woltamperometrii cyklicznej dla wszystkich 16 czujników przy użyciu czytnika Helios Chip Reader. Prąd amperometryczny jest proporcjonalny do szybkości redukcji TMB na powierzchni czujnika (patrz Rycina 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisujemy test elektrochemiczny, który jest skonstruowany podobnie do testu ELISA typu kanapkowego. Jak pokazano na Rysunku 1, hybrydyzacja docelowego rybosomalnego RNA (rRNA) z sondami wychwytującymi i detekcyjnymi jest wykrywana poprzez reakcję redoks katalizowaną przez HRP skoniugowany z fragmentami przeciwciał antyfluoresceinowych, które wiążą się z łącznikiem fluoresceiny na końcu 3' sondy detekcyjnej. Ważnym elementem czułości testu jest chemia powierzchni elektrody złotej. Stwierdziliśmy, że trójs...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj test z użyciem czujnika elektrochemicznego umożliwia szybką detekcję docelowych kwasów nukleinowych. Czułość i swoistość zależą częściowo od wolnej energii hybrydyzacji celu z sondą, co z kolei zależy od długości i zawartości GC sondy wychwytującej oraz sondy detekcyjnej. Kroki hybrydyzacji wykonujemy zazwyczaj w temperaturze pokojowej (~20 °C) 5, 6. Jednak etapy hybrydyzacji (3.2 i 3.3) można również przeprowadzić w wyższych temperaturach w piecu do hybrydyzacji, pod warunkiem umieszczenia chipa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są wynalazcami patentów dotyczących opisanych metod. Jeden z tych patentów został udzielony w licencji firmie Qvella Corporation. B.M.C. oraz D.A.H. posiadają udziały w Qvella Corporation. V.G. jest prezesem firmy GeneFluidics, która jest producentem opisanego w niniejszej pracy układu elektrod czujnika elektrochemicznego, uchwytu na chip oraz czytnika chipów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantu Cooperative Agreement AI075565 (dla D.A.H.) przyznanego przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz z funduszu Wendy and Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. B.M.C. zajmuje stanowisko Judith and Robert Winston Chair in Pediatric Urology.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-merkapto-1-heksanol (MCH) | Sigma | 451088 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| 1,6-heksanoditiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| Tiolowane sondy wychwytujące | Operon | N/A | Przechowywać w stężeniu 100 μM w 0,1x TE w -20 °C |
| Sondy detekcyjne modyfikowane fluoresceiną | Operon | N/A | Przechowywać w stężeniu 100 μM w 0,1x TE w -20 °C |
| Łączący oligonukleotyd | Operon | N/A | Przechowywać w stężeniu 100 μM w 0,1x TE w -20 °C |
| Przeciwciało anty-fluoresceina-HRP, fragmenty Fab | Roche | 11 426 346 910 | Przechowywać w 4 °C |
| Czytnik chipów Helios | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Uchwyt chipa sensorowego | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Naklejka na dołki filmu | GeneFluidics | Dostarczana z chipami sensorowymi | |
| Chipy z macierzą 16 sensorów ze złota | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Przechowywać w 100% N2 w temperaturze pokojowej |
| Seryjowa albumina wołowa (BSA) | Sigma | A7906 | Przechowywać w 4 °C |
| 1M bufor fosforanowy, pH 7,2 | 0,35M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, doprowadzone do pH 7,2 | ||
| Kazeina blokująca w PBS | Pierce | 37528 | Rozcieńczyć równą objętością 1M buforu fosforanowego o pH 7,2, przechowywać w 4 °C |
| Tabela 1. Odczynniki i sprzęt. |
Bibliografia
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
