Artykuł metodologiczny

Wizualny opis rozwarstwienia naczyń naczyniowych powierzchni mózgu i związanych z nim opon mózgowych oraz splotu naczyniówkowego z mózgu szczura

DOI:

10.3791/4285

⸱

14 listopada 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neurotoxicology, National Center for Toxicological Research, 2Division of Personalized Nutrition and Medicine, National Center for Toxicological Research, 3Office of Planning, Finance, and Information Technology, National Center for Toxicological Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta prezentacja wideo pokazuje metodę pozyskiwania dwóch najważniejszych wysoce unaczynionych struktur, które wspierają funkcjonowanie przodomózgowia. Są to unaczynienie powierzchni mózgu (powierzchowne) wraz z powiązanymi oponami mózgowymi (MAV) i splotem naczyniówkowym, które są niezbędne do przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta prezentacja wideo została stworzona, aby pokazać metodę zbierania dwóch najważniejszych wysoce unaczynionych struktur, nie znajdujących się w mózgu właściwym, które wspierają funkcjonowanie przodomózgowia. Są to unaczynienie powierzchni mózgu (powierzchowne) wraz z powiązanymi oponami mózgowymi (MAV) i splotem naczyniówkowym, które są niezbędne do przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Pobrana tkanka nadaje się do analizy biochemicznej i fizjologicznej, a MAV okazał się wrażliwy na uszkodzenia spowodowane przez amfetaminę i hipertermię 1,2. Również główne i mniejsze naczynia krwionośne mózgu pobrane w MAV są potencjalnie bardzo interesujące podczas badania wstrząsowych rodzajów urazów głowy. MAV wypreparowany w tej prezentacji składa się z błony pajęczynówki i części błony pajęczynówki (mniej opony twardej) opon mózgowych oraz głównego i mniejszego unaczynienia powierzchni mózgu. Wycięty splot naczyniówkowy to struktura, która znajduje się w komorach bocznych, jak opisali Oldfield i McKinley3,4,5,6. Metody stosowane do pobierania tych dwóch tkanek ułatwiają również pobieranie regionalnej tkanki korowej pozbawionej opon mózgowych i większego unaczynienia powierzchni mózgu i są kompatybilne z pobieraniem innych tkanek mózgowych, takich jak prążkowie, podwzgórze, hipokamp itp. Rozwarstwienie dwóch tkanek trwa łącznie od 5 do 10 minut. Poziomy ekspresji genów dla wypreparowanego MAV i splotu naczyniówkowego, jak pokazano i opisano w tej prezentacji, można znaleźć w GSE23093 (MAV) i GSE29733 (splot naczyniówkowy) w repozytorium NCBI GEO. Dane te były i są wykorzystywane do lepszego zrozumienia funkcjonowania MAV i splotu naczyniówkowego oraz tego, jak zdarzenia neurotoksyczne, takie jak ciężka hipertermia i AMPH, niekorzystnie wpływają na ich funkcję.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż nie pokazano tego w filmie, szczury najpierw otrzymały przedawkowanie 300 mg/kg pentobarbitalu, co spowodowało znieczulenie w czasie krótszym niż 3 minuty, a następnie zostały zabite przez ścięcie. Ich mózgi zostały następnie szybko, ale ostrożnie usunięte z czaszki i schłodzone w lodowatej soli fizjologicznej przez 5 minut. Ważne jest, aby pozwolić mózgowi ostygnąć przez ten czas przed preparacją MAV, tak aby MAV mógł zostać oddzielony od powierzchni kory mózgowej (górna część warstwy I). Mózg umieszczono następnie na dnie szklanej szalki Petriego spoczywającej na lodzie, który był pełen (1 cm głębokości) lodowatej normalnej soli fizjologicznej lub 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu pH = 7,4. Cała sekcja odbywa się z mózgiem w większości zanurzonym w soli fizjologicznej.

1. Usunięcie szyszynki

  1. Ułóż mózg grzbietową stroną do góry (względem dna szalki Petriego). Szyszynka znajduje się w najbardziej ogonowym obszarze brzusznym między dwiema półkulami, tuż rostralnie do móżdżku (zachyłka szyszynki) i znajduje się tuż poniżej lub na powierzchni opon mózgowych nad szyszką. Najpierw usuń szyszynkę za pomocą dwóch małych kleszczyków z wygiętą końcówką. Ma różowy kolor jak kora mózgowa, ale często jest otoczony resztkami krwi i naczyń krwionośnych pozostałościami po usunięciu mózgu.

2. Usunięcie MAV

  1. Odwróć mózg "do góry nogami" i oddziel tętnicę kręgową, mniejsze tętnice i opony mózgowe pokrywające most od opon mózgowych i naczyń krwionośnych przodomózgowia. Następnie rozpoczyna się usuwanie MAV przodomózgowia.
    Ważne jest, aby rozpocząć proces rozwarstwiania brzusznie. Duże główne tętnice koła Willisa, tętnice środkowe mózgu (MCA) i tętnice przednie są najsilniejsze i służą jako "rusztowanie", za pomocą którego mniejsze tętnice powierzchowne i tętniczki błony błony włosowej mogą być następnie usunięte z kory mózgowej wraz z pozostałą częścią opon mózgowych. Zobacz recenzję Scremin7, aby uzyskać więcej wizualnych reprezentacji i szczegółów dotyczących unaczynienia powierzchni mózgu.
  2. Zaczynając od dowolnej półkuli, użyj małych kleszczyków z wygiętą końcówką, aby przeciąć tylną tętnicę łączącą tuż za połączeniem tętnicy szyjnej wewnętrznej. W ten sposób oddziela się bardziej przednie i tylne drzewa tętnicze przodomózgowia. Powtórz ten sam proces dla przeciwległej półkuli.
  3. Chwytając kleszczem MCA i tętnicę przednią, delikatnie pociągnij w kierunku przednio-grzbietowym, tak aby MAV pokrywający brzuszną korę przednią (gruszkowaty, węchowy) został uniesiony nad i wokół przewodu węchowego. Powoduje to usunięcie dużej części MAV pokrywającej korę przednią (obręcz i oczodoł).
  4. Obróć mózg pod kątem od 45 do 90° do szalki Petriego. Boczne, bardziej przednie obszary MAV otaczające boczne obszary kory (ziarnista wyspowa, wtórna kora somatosensoryczna i kora słuchowa) można uwolnić od kory, chwytając MCA i powiązane tętnice i delikatnie ciągnąc grzbietowo wzdłuż kory. W razie potrzeby końce kleszczy mogą być użyte do podniesienia i uwolnienia głównych tętnic z kory podczas sekcji.
  5. Teraz usuń bardziej tylne boczne obszary MAV. (Należy pamiętać, że podczas tego procesu zbioru najlepiej jest przełączać się z jednej półkuli na drugą, aby upewnić się, że MAV pozostaje zimny i nawodniony. Ponadto, jeśli napotkasz opór w uwolnieniu MAV z kory mózgowej na jednej półkuli, tymczasowo przełącz się na półkulę przeciwległą, a następnie wróć do pierwotnej półkuli później.)
  6. Aby usunąć większość grzbietowych obszarów MAV otaczających pierwotną korę somatosensoryczną i ruchową, odwróć mózg grzbietową stroną do góry (w stosunku do dna szalki Petriego). Aby w końcu uwolnić MAV z mózgu, użyj końców kleszczy wzdłuż zatoki strzałkowej.
    Ta część zebranego MAV może być tymczasowo przechowywana w lodowatym roztworze soli do czasu przeprowadzenia testów i analizy lub zamrożona w celu późniejszego przetworzenia. Często MAV obejmujący najbardziej tylne/ogonowe obszary kory (śródwęchowe, wzrokowe i większość ogonowych kory słuchowej) pozostaje przyczepiony do kory. Jego usunięcie jest pokazane w dalszej części filmu, gdy MAV między korą zaśledzioną a leżącymi nad nią wzgórkami są preparowane.

3. Usunięcie splotu naczyniówkowego

  1. Ustaw mózg grzbietową stroną do góry i przytrzymaj w miejscu większymi kleszczami Wepchnij mniejsze kleszcze w dół przez linię środkową między półkulami, a następnie użyj końców do przebicia kory i ciała modzelowatego (≈-3,3 mm od bregmy) do górnej części linii środkowej hipokampa.
  2. Użyj kleszczy, aby odciągnąć korę z modzelem od grzbietowego hipokampa i przegrody, odsłaniając większość komory bocznej. Splot naczyniówkowy można zlokalizować i zidentyfikować za pomocą falistej czerwonej linii wyznaczającej główną tętnicę biegnącą na jego długości. Użyj dwóch końców kleszczy, aby podważyć boczne ściany trzeciej komory i powiększyć ją na najbardziej ogonowym końcu (≈-4,3 mm od bregmy8).
  3. Za pomocą małych kleszczy wyciągnij ten koniec splotu naczyniówkowego z powrotem. Następnie przejdź do bardzo przedniego obszaru między przegrodą a jądrem ogoniastym/skorupą (najbardziej rostralna rozciągłość, ≈+1,6 mm od Bregmy) i za pomocą kleszczy powiększ ten odcinek komory i uwolnij splot naczyniówkowy. Wykonaj tę samą procedurę na przeciwległej półkuli, aby uzyskać drugi pozostały splot naczyniówkowy.
    Również w tym przypadku tkanka ta może być tymczasowo przechowywana w lodowatej soli fizjologicznej do czasu przeprowadzenia testów i analiz lub zamrożona do późniejszego przetworzenia.

4. Usunięcie pozostałego MAV w 3komorze pokrywającej wzgórze i wzgórki, jak również w bardziej ogonowych obszarach kory mózgowej, w tym w korze retrosplenialnej, słuchowej i wzrokowej

  1. Usuń cały hipokamp z obu półkul, odsłaniając MAV nad wzgórzem i colliculi. Usunięcie tej części MAV jest znacznie mniej trudne niż usunięcie MAV przez korę mózgową.
  2. Wyciągnij tę część MAV wolno, chwytając większy układ krwionośny leżący nad przednią częścią wzgórza i delikatnie ciągnąc doogonowo. To unaczynienie jest połączone z siecią nadkolkularną i dostarcza krew do grzbietowego hipokampa i sieci grzbietowego wzgórza. Odciągnij go doogonowo i stopniowo uwalniaj sieć nadokrzemkową, aż do osiągnięcia ostatnich części naczynia krwionośnego koła tętniczego ogona.
    W tym momencie należy zachować większą ostrożność, aby usunąć wszelkie pozostałe tylne brzuszne MAV na powierzchni ziarnistej kory zaśledzionowej, pierwotnej słuchowej i wzrokowej. Podobnie jak w przypadku innej części MAV obejmującej bardziej przednie części kory, tkanka ta może być tymczasowo przechowywana w lodowatym roztworze soli fizjologicznej do czasu badania i analizy lub zamrożona do późniejszego przetworzenia. Wszelkie pozostałe tylne brzuszne MAV pobrane za pomocą tego drugiego odcinka MAV powinny zostać usunięte i dodane do pierwszego wypreparowanego odcinka MAV pokrywającego korę, jeśli mają być analizowane oddzielnie.

5. Reprezentatywne wyniki

Gdy sekcja zostanie przeprowadzona poprawnie, powstałe tkanki MAV powinny znajdować się w dwóch nienaruszonych jednostkach o łącznej wadze około 35 do 45 mg. Początkowo wypreparowany MAV otaczający większość kory powinien ważyć około 25 mg, a MAV obejmujący wzgórze, wzgórki i korę potyliczną powinien ważyć około 15 mg. Powinien mieć lekko różowawy kolor od resztkowej krwi w naczyniach krwionośnych. Pobrany obustronny splot naczyniówkowy powinien znajdować się w dwóch nienaruszonych próbkach tkankowych, z których każda waży od 1 do 2 mg. Chociaż nadmiar wody można usunąć z MAV przed przechowywaniem lub przetwarzaniem za pomocą bibuły, takiej jak ta używana do czyszczenia soczewek, aby uniknąć utraty tkanki, nie jest dobrym pomysłem usuwanie nadmiaru wody z wypreparowanego splotu naczyniówkowego. Rysunek 1 został wygenerowany w celu porównania profili ekspresji w trzech regionach (prążkowie, kora ciemieniowa i MAV) w warunkach kontrolnych przy użyciu 60-merowych macierzy oligonukleotydowych Agilent-014879 Whole Rat Genome 4x44K (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; Akcesja NCBI GEO # GPL7294; GSE23093 i GSE29733, które znajdują się w repozytorium NCBI GEO). Dwa wykresy na rysunku obrazowo pokazują wyrażenie w 1) prążkowiu w porównaniu z korą ciemieniową i 2) MAV w porównaniu z korą ciemieniową. Oczywiste jest, że prążkowie i kora ciemieniowa są znacznie ściślej ze sobą związane niż MAV. Dane porównujące splot naczyniówkowy z MAV zostaną przedstawione w przyszłej publikacji. Jest jednak prawdopodobne, że profile ekspresji w MAV i splocie naczyniówkowym są bliżej związane ze sobą niż z prążkowiem i korą ciemieniową. Rycina 2 przedstawia różnicową odpowiedź ekspresji genów na hipertermię (EIH) w porównaniu z AMPH w MAV w porównaniu z grupą kontrolną i sobą nawzajem.

Ekspresja genów ponad 11 000 genów z oficjalnymi symbolami genów NCBI w MAV zwierząt kontrolnych została porównana z tymi zarejestrowanymi w prążkowiu i korze ciemieniowej. Ponad 2000 z tych genów miało 2,5-krotnie lub więcej różniącą się ekspresję w MAV w porównaniu z dwiema tkankami bogatymi w neurony, a 550 genów miało 10-krotnie większą różnicę w ekspresji. Nieco ponad 40% (253) z nich to geny o zmniejszonej ekspresji 10-krotnie lub więcej w MAV i były związane z funkcją neuronów. Stwierdzono 343 geny z ponad 10-krotną lub większą ekspresją w MAV w porównaniu z korą ciemieniową i prążkowiem. Ta lista genów została wykorzystana jako punkt wyjścia do określenia genów o bardzo wysokim wzbogaceniu w MAV. Tabela 1 zawiera listę genów o ponad 15-krotnej ekspresji MAV w porównaniu z korą ciemieniową i prążkowiem oraz kategoryzuje je pod względem funkcji. Wiele z tych genów było związanych z układem naczyniowym i/lub układem odpornościowym. Tego typu geny powinny być wzbogacone około 5 do 10 razy ze względu na zwiększone unaczynienie i krew w nim obecną. Jednak nawet w przypadku genów o znanych ogólnych funkcjach naczyniowych wzrost powyżej 15-krotności wskazuje na wzbogacenie w MAV. Istniała również liczba genów z bardzo dużymi zmianami fałdowania, które były; 1) białka macierzy zewnątrzkomórkowej (niespecyficznie związane z naczynieniem), 2) transportery substancji rozpuszczonych oraz 3) metabolizm lipidów i kwasów retinowych. Znaleziono również niewiele genów wzrostu i różnicowania lub czynników transkrypcyjnych.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Porównanie ekspresji genów w MAV z korą ciemieniową i prążkowiem. Wykres wulkaniczny porównujący poziomy ekspresji genów kory ciemieniowej i prążkowia (wykres górny) oraz kory ciemieniowej i MAV (wykres dolny). Czerwone symbole oznaczają geny, które znacząco różnią się między regionami na poziomie p <0,05 i mają 1,5-krotną lub większą różnicę ekspresji między regionami. Czarne symbole reprezentują geny, które nie różnią się znacząco między regionami (p >0,05) i różnią się ekspresją mniej niż 1,5-krotnie. Różowe symbole oznaczają geny o mniej niż 1,5-krotnej różnicy w ekspresji, ale statystycznie istotnie różniące się przy p<0,05. Żółte symbole identyfikują geny, które mają 1,5-krotną lub większą ekspresję, ale zmiana ta nie jest statystycznie istotna przy p<0,05.

Skróty

AMPH amfetamina
EIH Hipertermia indukowana przez środowisko
Opony mózgowe MAV i związane z nimi naczynia krwionośne mózgu
Normy normotermiczne

figure-protocol-2
Rysunek 2. Wpływ hipertermii i amfetaminy na ekspresję genów w MAV. Wykresy wulkaniczne porównujące poziomy ekspresji genów w MAV po soli fizjologicznej, EIH lub AMPH w 3-godzinnym punkcie czasowym. Czerwone symbole oznaczają geny, które uważa się za znacząco różne, podczas gdy czarne kropki/kółka reprezentują geny, które nie różnią się znacząco między regionami. Zastosowano dodatkową analizę statystyczną w celu sprawdzenia, które różnice w ekspresji między grupą kontrolną a leczeniem były w rzeczywistości statystycznie istotne.

Ekspresja MAV Ekspresja mózgu Symbole genów NCBI Specyficzność tkankowa lub zgłoszona funkcja (funkcje) > 50-krotnie Anxa2a, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kla, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, Ogn, Tagln, Thbs2, Tnnt2 Unaczynienie i serce > 50-krotnie Ccl19, Cd74a, Defb1, Lrrc21, MGL1, Mrc1, Msln, Pla2G5, Prg4, RT1-BB, RT1-DA Układ odpornościowy > 50-krotnie Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów > 50-krotnie cdh1, col3a1, col1a2, colec12, cpxm2, cpz, dcn, emp3, gpc3, nupr1, omd, pcolce slamf9, tmem27, tspan8 Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia komórka-komórka > 50-krotnie aqp1, asgr1, kcnj13, slc5a5, slc6a13, slc6a20, slc22a6, sned1, ttr Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych > 50-krotnie alx3, cdkn1c, foxc2, igfbp2, ifitm1, ifitm2, nkx6-1, osr1, prrx2, sfrp1, tbx15. upk1b, wis2, wnt6 Regulacje dotyczące rozwoju i transkrypcji > 50-krotnie gpha2, mfap5, mpzl2 plac8, scgb1c1, sostdc1, steap1 Nieznane i różne Od 30 do 50-krotnie anxa1a , angpt2, c6a, gjb2, ptgis, thbd, timep1 Unaczynienie i serce Od 30 do 50-krotnie Casp12, Ccl2, Ccr1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 Układ odpornościowy Od 30 do 50-krotnie Col6a3, cpxm1, efemp1, fmod, mgp, nid2 Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia komórka-komórka Od 30 do 50-krotnie cp, cubn, gcgr, s100a6, scn7a, sct, slc4a5, slc16a11, slco1a5 Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych Od 30 do 50-krotnie Cfd, Ch25H, Krab2, Rarres2 Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów Od 30 do 50-krotnie bmp6, csp12, dab2, folr1, igf2, msx1, tbx18, twist1, wnt5b Regulacje dotyczące rozwoju i transkrypcji Od 30 do 50-krotnie cela3b, cln6, c1qtnf7, copz2, dhrs7c, gng11, prss23, srpx, vim Nieznane i różne Od 15 do 30-krotnie adm, angpt1, angptl2, bgn, cklfa, cnn1,cox8h, ctsk, f13a1, gja5, klf4, lox, lyz, myl9, procr, pros1, RT1-ba, serpinb10, serping1, serpinf1, tgm2, tnmd, trim63, txnipa, vamp5, vtn Unaczynienie i serce Od 15 do 30-krotnie Adaa, bst2, ccl6, cd40, cd68, ctsc, dap, faim3, fkbp9, fxyd5, fmo1, glipr1, ier3, ifi47, igsf6, msc, nfatc4, RT1-db1, serpinb1a, tir4, tubb6 Układ odpornościowy Od 15 do 30-krotnie Adamtsl4, Col1a1, crb3, dpt, egfl3, fbn1, fbln1, fbln5, fn1, itgb4, lama2, lgals3bp, loxl1, mfap4, mmp14, mmp23, ppic, serpinh1, timep3 Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia komórka-komórka Od 15 do 30-krotnie cybrd1, selenbp1, slc2a4, slc9a2, slc13a3, slc16a4, slc22a8, slc22a18 Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych Od 15 do 30-krotnie Agpat2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, Rbp4 Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów Od 15 do 30-krotnie atf3, dkk4, eya2, ifitm7, ltbp1, mustn1, nr2f2, ptrf, sphk1, tgfbi, tcea3 tcfap2b, wnt2b, wnt5a, zic1 Regulacje dotyczące rozwoju i transkrypcji Od 15 do 30-krotnie Adamts12, Adamtsl3, C1R, Crispld2, Crygn, Cyp1b1, Dse, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, Fmo3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, krt18, krt19, mdk, mesp1, ms4a6a, ms4a6b, ms4a11, net1, pdlim2, phactr2, plp2, pp1r3b, pqlc3, rin3, spag11, sult1a1, tmem106a, wfikkn2 Nieznane i różne

*Geny uwzględnione w tabeli muszą być zarówno ponad 15-krotnie powyżej ekspresji w prążkowiu i korze ciemieniowej, jak i 5-krotnie powyżej poziomów tła. Do grupowania wykorzystano niższy z dwóch współczynników (MAV/prążkowie lub MAV/kora ciemieniowa) dla każdego genu.

aGeny znajdują się w komórkach śródbłonka, ale prawdopodobnie odgrywają również główną rolę w pośredniczeniu w odpowiedziach immunologicznych.

Tabela 1. Geny o 15-krotnej* lub większej zwiększonej ekspresji MAV w porównaniu z prążkowiem i korą ciemieniową.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniczne aspekty MAV i rozwarstwienia splotu naczyniówkowego

Podczas sekcji MAV bardzo ważne jest, aby mózg był przez większość czasu "zanurzony" w normalnej soli fizjologicznej lub roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu. Pozwolenie na odwodnienie MAV i kory podczas sekcji spowoduje, że MAV będzie ściśle przylegał do warstwy korowej I. Zwiększy to ilość tkanki korowej pobranej za pomocą MAV i/lub spowoduje niemożność usunięcia tych przylegających odcinków MAV z kory. Konieczna jest również cierpliwość podczas sekcji. Ponownie, jeśli ktoś napotka pewien opór w usuwaniu MAV z kory mózgowej w jednej półkuli podczas sekcji, przełącz się na drugą półkulę i wróć później na stronę, w której napotkano opór. Udoskonalenie tej metody wymaga pewnej praktyki i wymaga około 5 do 15 "praktycznych" sekcji, zanim zostanie osiągnięte konsekwentnie jednolite pobieranie tkanki MAV. Metoda rozpoczęcia sekcji i usunięcia MAV w kole tętniczym u podstawy mózgu ułatwia usunięcie opon mózgowych poprzez wykorzystanie większego naczynia krwionośnego jako "rusztowania" podporowego.

Znaczna część krwi pierwotnie znajdującej się w układzie naczyniowym MAV po uśmierceniu powinna zostać wyrzucona podczas sekcji, a mniej niż 5% RNA pobranego z MAV powinno być pochodzenia krwionośnego. Możliwe jest usunięcie prawie całej krwi poprzez perfuzję zwierzęcia za pomocą 50 do 70 ml soli fizjologicznej, przy użyciu technik histologicznych, przed dekapitacją i usunięciem mózgu. Jednak wtedy znacznie trudniej jest uwidocznić tkanki MAV podczas sekcji. Trzy najbardziej prawdopodobne źródła "zanieczyszczenia" tkanek MAV to szyszynka, tkanka I warstwy korowej oraz resztkowa tkanka opuszki węchowej, ale możliwe jest również uzyskanie w preparacie tkanki przysadki mózgowej. Zanieczyszczenie szyszynką w MAV jest wykrywane przez MAV zawierający okrągłą kulę o średnicy od 1 do 2 mm w kolorze ciemnoczerwonym. Podstawowa funkcja szyszynki jest zwykle uważana za zupełnie inną niż MAV. Jego podstawową funkcją jest produkcja melatoniny, która reguluje aspekty rytmu okołodobowego9, a w lipooksygenacji10 prekursorów lipidowych. Chociaż uważa się, że gen Lox, który reguluje aktywność lipooksygenazy, jest obecny u dorosłych głównie w szyszynce10, nasze wyniki wskazują, że jest on również stale obecny w znacznych poziomach w MAV. Szczątkowe zanieczyszczenie opuszki korowej lub węchowej powoduje, że różowawa tkanka MAV przypominająca pajęczynę ma zamknięte w niej gęstsze tkanki o około 1 do 2 mm, które są znacznie jaśniejsze. Można to zauważyć poprzez "unoszenie się" MAV na powierzchni buforu, a następnie usuwanie cięższych tkanek korowych lub opuszkowych za pomocą dwóch kleszczy preparacyjnych.

Jeśli obecne jest zanieczyszczenie MAV tkanką warstwy korowej I, tkanką podwzgórza lub szyszynką, wówczas kilka genów będzie miało znacznie większą ekspresję niż to, co jest normalnie obecne w "czystej" sekcji. Zanieczyszczenie MAV szyszynką spowoduje większą ekspresję N-acetylotransferazy arylalkyloaminy (Aanat), która jest niezbędna do syntezy melatoniny. Niestety, jeśli do zakażenia szyszynką dojdzie podczas rozwarstwienia MAV, nie będzie można dokładnie określić poziomu Lox w MAV. Zanieczyszczenie MAV tkanką korową spowoduje wyższą ekspresję genów specyficznych dla neuronów, takich jak hippokalcyna (Hpca), parwalbumina (Pvalb) i/lub neuronalny receptor pentraksyny (Nptxr). Zanieczyszczenie MAV tkanką podwzgórza spowoduje wyższą ekspresję hormonu wzrostu 1 (Gh1), proopiomelanokortyny (Pomc). W przypadku, gdy w pobranych tkankach występuje pewne zanieczyszczenie, większość tych genów można zidentyfikować i nie wykorzystywać ich w analizie ekspresji genów. Jest to szczególnie ważne w przypadku genów obecnych we krwi krążącej, które mogą być nadal obecne w MAV lub splocie naczyniówkowym.

Interpretacja danych dotyczących ekspresji genów z pobranego MAV i splotu naczyniówkowego

Unaczynienie powierzchni mózgu (powierzchowne) wraz z towarzyszącymi oponami mózgowymi (MAV) i splotem naczyniówkowym są niezbędne do przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)4,11,12,13,14,15,16,17 . Pobrana tkanka nadaje się do analizy biochemicznej i fizjologicznej, a MAV okazał się wrażliwy na uszkodzenia spowodowane przez amfetaminę i hipertermię1,2 poprzez analizę ekspresji genów. Wyniki te są współmierne do tego, co wiadomo również o ciężkiej hipertermii i narażeniu na amfetaminy na naczynia naczyniowe mózgu w ogóle 18,19,20 . Dane kliniczne z badań klinicznych u ludzi potwierdzają przekonanie, że unaczynienie podtwardówkowe jest wrażliwe na uszkodzenia powodowane przez amfetaminę i metamfetaminę 21,22 . Również główne i mniejsze naczynia krwionośne mózgu, w tym te w warstwie opon mózgowych, które są zbierane w MAV, są potencjalnie bardzo interesujące podczas badania wstrząsowych typów urazów głowy 23,24 25 . Obecny profil ekspresji genów uzyskany z MAV wskazuje, że błony oponowo-rdzeniowe pial i prawdopodobnie pajęczynówka mogą odgrywać większą rolę niż oczekiwano w regulacji składu płynu mózgowo-rdzeniowego. W przyszłości, dzięki zastosowaniu technik mikroskopu preparacyjnego, możliwe będzie dalsze oddzielanie tkanek składających się na MAV, tak aby błony pial i arjęczynówka mogły zostać oddzielone od obecnych większych naczyń tętniczych i być może od siebie nawzajem. Umożliwi to lepszą interpretację funkcji każdego z tych 3 składników zebranego MAV.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia. Przedstawione tutaj prace niekoniecznie muszą reprezentować poglądy Agencji ds. Żywności i Leków.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez NCTR/FDA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna (9 gramów soli fizjologicznej / 1 litr H2O)Własnybufor preparacyjny
0,1 M Fosforan sodu pH 7,4Własnybufor preparacyjny
Bone RongeursRobozRS-8300Usuwanie kości czaszki
Końcówka wygięta przez kleszcze (końcówka o długości 4 cali i szerokości 0,8 mm)RobozRS-5135 lub RS-5137Kleszcze preparacyjne
Kleszcze z prostą końcówką (o długości 5,5 cala)RobozRS-8124 lub RS-8104Szczypce do opatrunku kciuka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomas, M., George, N. I., Patterson, T. A., Bowyer, J. F. Amphetamine and environmentally induced hyperthermia differentially alter the expression of genes regulating vascular tone and angiogenesis in the meninges and associated vasculature. Synapse. 63, 881-894 (2009).
  2. Thomas, M., et al. Endoplasmic reticulum stress responses differ in meninges and associated vasculature, striatum, and parietal cortex after a neurotoxic amphetamine exposure. Synapse. 64, 579-593 (2010).
  3. Ek, C. J., Dziegielewska, K. M., Habgood, M. D., Saunders, N. R. Barriers in the developing brain and Neurotoxicology. Neurotoxicology. , (2012).
  4. Oldfield, B. J. M., Michael, J. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 391(1995).
  5. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods Mol. Biol. 686, 101-131 (2011).
  6. Johanson, C. E. Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: ? challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Res. 5, (2008).
  7. Scremin, O. U. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 3(1995).
  8. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1995).
  9. Johnston, J. D. Photoperiodic regulation of prolactin secretion: changes in intra-pituitary signalling and lactotroph heterogeneity. J. Endocrinol. 180, 351-356 (2004).
  10. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 95-99 (2010).
  11. Burnstock, G. Neurogenic control of cerebral circulation. Cephalalgia. 5, Suppl 2. 25-33 (1985).
  12. Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. J. Appl. Physiol. 100, 1059-1064 (2006).
  13. Johanson, C. E., et al. Cognitive function and nigrostriatal markers in abstinent methamphetamine abusers. Psychopharmacology (Berl). 185, 327-338 (2006).
  14. Johnston, M., Papaiconomou, C. Cerebrospinal Fluid Transport: a Lymphatic Perspective. News Physiol. Sci. 17, 227-230 (2002).
  15. Johnston, M., Zakharov, A., Koh, L., Armstrong, D. Subarachnoid injection of Microfil reveals connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatics in the non-human primate. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 31, 632-640 (2005).
  16. Johnston, M., et al. Evidence of connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatic vessels in humans, non-human primates and other mammalian species. Cerebrospinal Fluid Res. 1, 2(2004).
  17. Kulik, T., et al. Regulation of cerebral vasculature in normal and ischemic brain. Neuropharmacol. 55, 281-288 (2008).
  18. Bowyer, J. F., Ali, S. F. High doses of methamphetamine that cause disruption of the blood-brain barrier in limbic regions produce extensive neuronal degeneration in mouse hippocampus. Synapse. 60, 521-532 (2006).
  19. Sharma, H. S., Westman, J., Nyberg, F. Pathophysiology of brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury. Prog. Brain Res. 115, 351-412 (1998).
  20. Sharma, H. S., Sjoquist, P. O., Ali, S. F. Drugs of abuse-induced hyperthermia, blood-brain barrier dysfunction and neurotoxicity: neuroprotective effects of a new antioxidant compound H-290/51. 13, 1903-1923 (2007).
  21. Ho, E. L., Josephson, S. A., Lee, H. S., Smith, W. S. Cerebrovascular complications of methamphetamine abuse. Neurocrit. Care. 10, 295-305 (2009).
  22. Ohta, K., et al. Delayed ischemic stroke associated with methamphetamine use. J. Emerg. Med. 28, 165-167 (2005).
  23. Brenner, L. A. Neuropsychological and neuroimaging findings in traumatic brain injury and post-traumatic stress disorder. Dialogues Clin. Neurosci. 13, 311-323 (2011).
  24. Case, M. E. Inflicted traumatic brain injury in infants and young children. Brain Pathol. 18, 571-582 (2008).
  25. Maas, A. I., et al. Prognostic value of computerized tomography scan characteristics in traumatic brain injury: results from the IMPACT study. J. Neurotrauma. 24, 303-314 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cerebral Surface VasculatureChoroid PlexusMeninges DissectionRat BrainTissue HarvestingGene Expression AnalysisMAV IsolationLateral VentriclesCircle of WillisCortical Surface

Powiązane artykuły