Niniejsza prezentacja wideo przedstawia metodę pozyskiwania dwóch najważniejszych, silnie unaczynionych struktur wspierających funkcje przedmózgowia. Są to naczynia powierzchniowe kory mózgowej wraz z powiązanymi z nimi oponami (MAV) oraz sploty naczyniowe, które są niezbędne dla przepływu krwi mózgowej i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
Artykuł metodologiczny
Wizualny opis sekcji naczyń powierzchniowych mózgowia oraz powiązanych opon mózgowych i splotów naczyniowych z mózgu szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejsza prezentacja wideo została stworzona, aby przedstawić metodę pozyskiwania dwóch najważniejszych, silnie unaczynionych struktur znajdujących się poza właściwym mózgiem, które wspierają funkcje przedmózgowia. Są to naczynia powierzchniowe (płytkie) mózgowia wraz z powiązanymi oponami (MAV) oraz sploty naczyniowe, które są niezbędne dla przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Pozyskana tkanka nadaje się do analiz biochemicznych i fizjologicznych, a wykazano, że MAV jest wrażliwe na uszkodzenia wywołane amfetaminą i hipertermią 1,2. Ponadto główne i poboczne naczynia mózgowe pozyskiwane w ramach MAV mogą być szczególnie interesujące podczas badania wstrząsowych urazów głowy. MAV wypreparowane w tej prezentacji składa się z opony miękkiej i części opony pajęczynowej (z mniejszą ilością opony twardej) oraz głównych i pobocznych naczyń powierzchniowych mózgowia. Wypreparowany splot naczyniowy to struktura znajdująca się w komorach bocznych, opisana przez Oldfielda i McKinleya3,4,5,6. Metody stosowane do pozyskiwania tych dwóch tkanek ułatwiają również pobieranie regionalnej tkanki korowej pozbawionej opon i większych naczyń powierzchniowych mózgowia oraz są kompatybilne z pozyskiwaniem innych tkanek mózgowych, takich jak prążkowie, podwzgórze, hipokamp itp. Disekcja obu tkanek zajmuje łącznie od 5 do 10 min. Poziomy ekspresji genów dla wypreparowanych MAV i splotów naczyniowych, przedstawione i opisane w tej prezentacji, można znaleźć pod numerami GSE23093 (MAV) oraz GSE29733 (splot naczyniowy) w repozytorium NCBI GEO. Dane te były i są wykorzystywane do dalszego zrozumienia funkcjonowania MAV i splotów naczyniowych oraz tego, jak zdarzenia neurotoksyczne, takie jak ciężka hipertermia i AMPH, niekorzystnie wpływają na ich funkcję.
Protokół
Choć nie pokazano tego w filmie, szczurom podano najpierw dawkę przedawkowania pentobarbitalu w ilości 300 mg/kg, co doprowadziło do znieczulenia w czasie krótszym niż 3 min, a następnie uśmiercono je poprzez dekapitację. Ich mózgi zostały następnie szybko, lecz ostrożnie usunięte z czaszki i schłodzone w lodowatej soli fizjologicznej przez 5 min. Ważne jest, aby pozwolić mózgowi schłodzić się przez ten czas przed wypreparowaniem MAV, aby MAV można było oddzielić od powierzchni kory (górna część warstwy I). Mózg umieszczono następnie na dnie szklanej szalki Petriego spoczywającej na lodzie, która była wypełniona (do głębokości 1 cm) lodowatą solą fizjologiczną lub 0,1 M roztworem soli fosforanowej w soli fizjologicznej o pH=7,4. Cała procedura preparowania była wykonywana w taki sposób, aby mózg w przeważającej mierze pozostawał zanurzony w soli fizjologicznej.
1. Usunięcie szyszynki
- Umieść mózg stroną grzbietową do góry (względem dna szalki Petriego). Szyszynka znajduje się w najbardziej kaudalnym regionie brzusznym między dwiema półkulami, tuż rostralnie w stosunku do móżdżku (recessus pinealis), i znajduje się tuż pod powierzchnią lub na powierzchni opon mózgowych nad wzgórzami. Najpierw usuń szyszynkę, używając dwóch małych pęset z wygiętymi końcami. Ma ona różowy kolor, podobnie jak kora, ale często jest otoczona pozostałościami krwi i naczyń krwionośnych pozostałymi po usunięciu mózgu.
2. Usunięcie MAV
- Odwróć mózg „do góry nogami” i oddziel tętnicę kręgową, mniejsze tętnice oraz opony przykrywające mosty od opon i naczyń krwionośnych przedmózgowia. Następnie rozpocznij usuwanie MAV z przedmózgowia.
Ważne jest, aby proces sekcji rozpocząć od strony brzusznej. Duże główne tętnice kręgu Willisa, tętnice środkowe mózgu (MCA) i tętnice przednie są najsilniejsze i służą jako „rusztowanie”, dzięki któremu mniejsze powierzchowne tętnice i tętniczki błony oponowej mogą zostać usunięte z kory wraz z pozostałością opon. Przedstawienia wizualne i szczegóły dotyczące naczyń powierzchni kory mózgowej znajdują się w przeglądzie autorstwa Scremina7. - Zaczynając od jednej z półkul, użyj pęsety z małą zagiętą końcówką, aby przeciąć tętnicę łączącą tylną tuż za połączeniem z wewnętrzną tętnicą szyjną. W ten sposób oddzielone zostaną przednie i tylne drzewa tętnicze przedmózgowia. Powtórz ten proces dla przeciwległej półkuli.
- Chwytając MCA i tętnicę przednią pęsetą, delikatnie pociągnij w kierunku przednio-grzbietowym, tak aby MAV pokrywająca przednią korę brzuszną (ciało gruszkowate, guzek węchowy) została uniesiona nad i wokół drogi węchowej. Pozwala to usunąć znaczną część MAV pokrywającej korę przednią (zakręt obręczy i korę orbitalną).
- Obróć mózg pod kątem od 45 do 90° względem szalki Petriego. Boczne, bardziej przednie obszary MAV otaczające boczne regiony korowe (korę wyspy ziarnistej, wtórną korę somatosensoryczną i słuchową) można oddzielić od kory, chwytając MCA i powiązane tętnice i delikatnie ciągnąc w kierunku grzbietowym wzdłuż kory. W razie potrzeby końcówki pęsety mogą posłużyć do uniesienia i oddzielenia głównych tętnic od kory podczas sekcji.
- Teraz usuń bardziej tylne boczne obszary MAV. (Uwaga: podczas tego procesu zbioru najlepiej przełączać się z jednej półkuli na drugą, aby zapewnić, że MAV pozostanie zimna i nawilżona. Ponadto, jeśli napotkany zostanie opór podczas oddzielania MAV od kory w jednej półkuli, należy tymczasowo przejść do półkuli przeciwległej, a następnie wrócić do pierwotnej półkuli w późniejszym czasie).
- Aby usunąć najbardziej grzbietowe obszary MAV otaczające pierwotną korę somatosensoryczną i ruchową, odwróć mózg stroną grzbietową do góry (względem dna szalki Petriego). Aby ostatecznie oddzielić MAV od mózgu, użyj końcówek pęsety wzdłuż zatoki strzałkowej.
Tę część pobranego MAV można tymczasowo przechowywać w lodowatej soli fizjologicznej do czasu testów i analizy lub zamrozić do późniejszego przetworzenia. Często MAV pokrywająca najbardziej tylne/ogonowe regiony kory (korę entorynalną, wzrokową i najbardziej ogonową korę słuchową) pozostaje przytwierdzona do kory. Jej usuwanie zostanie pokazane później w filmie, podczas sekcji MAV między korą retrosplenialną a obszarem nad wzgórkami).
3. Usunięcie splotu naczyniowego
- Ustaw mózg grzbietem do góry i przytrzymaj go większą pęsetą. Wsuń mniejszą pęsetę wzdłuż linii środkowej między półkulami, a następnie użyj jej końcówek, aby przebić się przez korę i ciało modzelowate (≈-3,3 mm od bregmy) do górnej części linii środkowej hipokampa.
- Użyj pęsety, aby odsunąć korę wraz z ciałem modzelowatym od grzbietowej części hipokampa i przegrody, odsłaniając większość komory bocznej. Splot naczyniowy można zlokalizować i zidentyfikować po falistej czerwonej linii wyznaczającej główną tętnicę biegnącą wzdłuż jego długości. Użyj obu końcówek pęsety, aby rozsunąć boczne ściany trzeciej komory i poszerzyć ją na najbardziej kaudalnym końcu (≈-4,3 mm od bregmy8).
- Za pomocą małej pęsety odciągnij ten koniec splotu naczyniowego. Następnie przejdź do najbardziej przedniego regionu między przegrodą a jądrem ogonowym i skorupą (najbardziej rostralny zasięg, ≈+1,6 mm od bregmy) i za pomocą pęsety poszerz ten odcinek komory oraz odseparuj splot naczyniowy. Przeprowadź tę samą procedurę w przeciwległej półkuli, aby pobrać drugi pozostały splot naczyniowy.
Tkanina ta może być ponownie przechowywana tymczasowo w lodowatej soli fizjologicznej do czasu testów i analizy lub zamrożona do późniejszego przetworzenia.
4. Usunięcie pozostałego MAV w 3B&R Komora nadwzgórzowa i komora nad wzgórzami oraz komora w bardziej kaudalnych obszarach kory, w tym w korze retrosplenialnej, słuchowej i wzrokowej
- Usuń cały hipokamp z obu półkul, odsłaniając MAV nad wzgórzami i wzgórkami. Usunięcie tej części MAV jest znacznie łatwiejsze niż usunięcie MAV nad korą.
- Uwolnij tę część MAV, chwytając większe naczynia krwionośne znajdujące się nad przednią częścią wzgórza i delikatnie pociągając w kierunku ogonowym. Naczynia te są połączone z siecią nadwzgórkową i zaopatrują w krew grzbietowy hipokamp oraz sieć grzbietowego wzgórza. Odciągnij je w kierunku ogonowym i stopniowo uwalniaj sieć nadwzgórkową, aż do osiągnięcia ostatnich fragmentów naczyń krwionośnych ogonowego kręgu tętniczego.
Na tym etapie należy zachować większą ostrożność podczas usuwania pozostałej tylnej brzusznej części MAV z powierzchni graniastej kory retrosplenialnej oraz pierwotnych kory słuchowej i wzrokowej. Podobnie jak w przypadku innego fragmentu MAV pokrywającego przednie części kory, tkankę tę można tymczasowo przechowywać w lodowatej soli fizjologicznej do momentu testów i analizy lub zamrozić do późniejszego przetworzenia. Wszelkie pozostałości tylnej brzusznej części MAV pobrane wraz z tą drugą sekcją MAV powinny zostać usunięte i dodane do pierwszej wypreparowanej sekcji MAV pokrywającej korę, jeśli mają być one analizowane osobno.
5. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym przeprowadzeniu sekcji uzyskane tkanki MAV powinny stanowić dwie nienaruszone jednostki o łącznej masie od około 35 do 45 mg. Wstępnie wycięta część MAV otaczająca większość kory powinna ważyć około 25 mg, natomiast MAV pokrywająca wzgórze, wzgórka i korę potyliczną powinna ważyć około 15 mg. Ze względu na pozostałą w naczyniach krew, tkanka powinna mieć lekko różowy kolor. Pobranymi obustronnymi splotami naczyniówkowymi powinny być dwie nienaruszone próbki tkanki, z których każda waży od 1 do 2 mg. Choć nadmiar wody z MAV można usunąć przed przechowywaniem lub przetwarzaniem za pomocą papieru do tkanek (takiego jak ten stosowany do czyszczenia soczewek), w celu uniknięcia utraty materiału nie zaleca się usuwania nadmiaru wody z wyciętych splotów naczyniówkowych. Rysunek 1 został przygotowany w celu porównania profili ekspresji w trzech obszarach (prążkowiu, korze ciemieniowej i MAV) w warunkach kontrolnych przy użyciu macierzy oligonukleotydowych Agilent-014879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Accession # GPL7294; GSE23093 oraz GSE29733 dostępnych w repozytorium NCBI GEO). Dwa wykresy na rysunku obrazują ekspresję w: 1) prążkowiu w porównaniu z korą ciemieniową oraz 2) MAV w porównaniu z korą ciemieniową. Wyraźnie widać, że prążkowie i kora ciemieniowa są ze sobą znacznie bardziej powiązane niż z MAV. Dane porównujące splot naczyniówkowy z MAV zostaną przedstawione w przyszłej publikacji. Prawdopodobnie jednak profile ekspresji w MAV i splotach naczyniówkowych są bardziej zbliżone do siebie niż do prążkowia i kory ciemieniowej. Rysunek 2 przedstawia zróżnicowaną odpowiedź ekspresji genów na hipertermię (EIH) w porównaniu z AMPH w MAV względem grupy kontrolnej oraz wzajemnie.
Ekspresję genów ponad 11 000 genów z oficjalnymi symbolami NCBI w MAV zwierząt kontrolnych porównano z ekspresją odnotowaną w prążkowiu i korze ciemieniowej. Ponad 2000 z tych genów wykazywało różnicę w ekspresji w MAV wynoszącą 2,5-krotność lub więcej w porównaniu do dwóch tkanek bogatych w neurony, a 550 genów wykazywało różnicę w ekspresji ponad 10-krotnej. Nieco ponad 40% (253) z nich stanowiły geny o ekspresji obniżonej 10-krotnie lub więcej w MAV, które były powiązane z funkcjami neuronalnymi. Odnotowano 343 geny o ekspresji ponad 10-krotnie większej w MAV w porównaniu do kory ciemieniowej i prążkowia. Listę genów tę wykorzystano jako punkt wyjścia do określenia genów o bardzo wysokim wzbogaceniu w MAV. Tabela 1 wymienia geny o ekspresji ponad 15-krotnie większej w MAV w porównaniu do kory ciemieniowej i prążkowia oraz kategoryzuje je ze względu na funkcję. Wiele z tych genów było powiązanych z układem naczyniowym i/lub układem odpornościowym. Tego typu geny powinny być wzbogacone około 5- do 10-krotnie ze względu na samą zwiększoną unaczynienie oraz obecną w nim krew. Jednak nawet w przypadku genów o znanych ogólnych funkcjach naczyniowych, wzrost powyżej 15-krotności wskazuje na wzbogacenie w MAV. Stwierdzono również liczne geny o bardzo dużych zmianach krotności, które były: 1) białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (niepowiązanymi specyficznie z naczyniami), 2) transporterami rozpuszczalnymi oraz 3) genami metabolizmu lipidów i kwasu retinowego. Ponadto zidentyfikowano kilka czynników transkrypcyjnych lub genów wzrostu i różnicowania.
Rycina 1. Porównanie ekspresji genów w MAV z korą ciemieniową i prążkowiem. Wykres wulkaniczny porównujący poziomy ekspresji genów w korze ciemieniowej i prążkowiu (wykres górny) oraz w korze ciemieniowej i MAV (wykres dolny). Czerwone symbole oznaczają geny, których ekspresja różni się istotnie między regionami przy p <0.05 i wykazuje różnicę w ekspresji między regionami wynoszącą 1,5-krotność lub więcej. Czarne symbole reprezentują geny, które nie różnią się istotnie między regionami (p >0.05) i których różnica w ekspresji jest mniejsza niż 1,5-krotność. Różowe symbole wskazują geny z różnicą w ekspresji mniejszą niż 1,5-krotność, ale statystycznie istotnie różniącą się przy p<0.05. Żółte symbole identyfikują geny, które wykazują ekspresję 1,5-krotność lub większą, lecz zmiana ta nie jest istotna statystycznie przy p<0.05.
Skróty
AMPH amfetamina
EIH hipertermia indukowana środowiskowo
MAV opony mózgowe i powiązane naczynia krwionośne mózgu
Norm kontrole normotermiczne
Rysunek 2. Wpływ hipertermii i amfetaminy na ekspresję genów w MAV. Wykresy wulkaniczne porównujące poziomy ekspresji genów w MAV po podaniu soli fizjologicznej, EIH lub AMPH w punkcie czasowym 3 h. Czerwone symbole oznaczają geny uznane za istotnie różne, natomiast czarne kropki/okręgi reprezentują geny, które nie wykazują istotnych różnic między regionami. Do weryfikacji, które różnice w ekspresji między grupą kontrolną a grupami traktowanymi były w rzeczywistości istotne statystycznie, zastosowano dodatkową analizę statystyczną.
| Ekspresja MAV w mózgu | Symbole genów NCBI | Specyficzność tkankowa lub zgłoszone funkcje |
| > 50-krotna | Anxa2a, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kla, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, Ogn, Tagln, Thbs2, Tnnt2 | Układ naczyniowy i serce |
| > 50-krotna | Ccl19, Cd74a, Defb1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da | Układ odpornościowy |
| > 50-krotna | Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 | Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów |
| > 50-krotna | Cdh1, Col3a1, Col1a2, Colec12, Cpxm2, Cpz, Dcn, Emp3, Gpc3, Nupr1, Omd, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 | Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia międzykomórkowe |
| > 50-krotna | Aqp1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr | Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych |
| > 50-krotna | Alx3, Cdkn1c, Foxc2, Igfbp2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, Osr1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 | Rozwój i regulacja transkrypcji |
| > 50-krotna | Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 | Nieznane i różne |
| od 30 do 50-krotna | Anxa1a , Angpt2, C6a, Gjb2, Ptgis, Thbd, Timp1 | Układ naczyniowy i serce |
| od 30 do 50-krotna | Casp12, Ccl2, Ccr1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 | Układ odpornościowy |
| od 30 do 50-krotna | Col6a3, Cpxm1, Efemp1, Fmod, Mgp, Nid2 | Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia międzykomórkowe |
| od 30 do 50-krotna | Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 | Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych |
| od 30 do 50-krotna | Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 | Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów |
| od 30 do 50-krotna | Bmp6, Casp12, Dab2, Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b | Rozwój i regulacja transkrypcji |
| od 30 do 50-krotna | Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim | Nieznane i różne |
| od 15 do 30-krotna | Adm, Angpt1, Angptl2, Bgn, Cklfa, Cnn1,Cox8h, Ctsk, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, Pros1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnipa, Vamp5, Vtn | Układ naczyniowy i serce |
| od 15 do 30-krotna | Adaa, Bst2, Ccl6, Cd40, Cd68, Ctsc, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, Tir4, Tubb6 | Układ odpornościowy |
| od 15 do 30-krotna | Adamtsl4, Col1a1, Crb3, Dpt, Egfl3, Fbn1, Fbln1, Fbln5, Fn1, Itgb4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, Ppic, Serpinh1, Timp3 | Macierz zewnątrzkomórkowa i połączenia międzykomórkowe |
| od 15 do 30-krotna | Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 | Homeostaza jonów i substancji rozpuszczonych |
| od 15 do 30-krotna | Agpat2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, Rbp4 | Przetwarzanie kwasu retinowego i lipidów |
| od 15 do 30-krotna | Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, Ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 | Rozwój i regulacja transkrypcji |
| od 15 do 30-krotna | Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, Cyp1b1, Dse, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, Fmo3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, Mdk, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, Plp2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 | Nieznane i różne |
*Geny uwzględnione w tabeli muszą wykazywać poziom ekspresji ponad 15-krotnie wyższy w prążkowiu i korze ciemieniowej oraz ponad 5-krotnie wyższy od poziomów tła. Do grupowania każdego genu wykorzystano niższy z dwóch współczynników (MAV/prążkowie lub MAV/kora ciemieniowa).
aGeny te występują w komórkach śródbłonka, ale prawdopodobnie odgrywają również główną rolę w pośredniczeniu w odpowiedziach odpornościowych.
Tabela 1. Geny o ekspresji zwiększonej 15-krotnie* lub bardziej w MAV w porównaniu do prążkowia i kory ciemieniowej.
Dyskusja
Aspekty techniczne sekcji MAV i splotu naczyniowego
Podczas sekcji MAV kluczowe jest, aby mózg pozostawał przez większość czasu „zanurzony” w soli fizjologicznej lub roztworze soli fosforowej (PBS). Doprowadzenie do odwodnienia MAV i kory podczas sekcji spowoduje silne przyleganie MAV do warstwy I kory. Zwiększy to ilość tkanki korowej pobieranej wraz z MAV i/lub uniemożliwi oddzielenie tych przylegających fragmentów MAV od kory. Ponadto podczas sekcji niezbędna jest cierpliwość. Jeśli podczas usuwania MAV z kory w jednej półkuli napotkano opór, należy przejść do drugiej półkuli i wrócić później do strony, w której wystąpiły trudności. Opanowanie tej metody wymaga praktyki; zazwyczaj potrzeba od 5 do 15 „próbnych” sekcji, aby uzyskać konsekwentnie jednolity materiał z tkanek MAV. Sposób rozpoczęcia sekcji i usuwania MAV od kręgu tętniczego u podstawy mózgu ułatwia usunięcie opon mózgowych, wykorzystując większe naczynia krwionośne jako swoiste „rusztowanie” wspierające.
Większość krwi znajdującej się pierwotnie w naczyniach MAV po uboju powinna zostać usunięta podczas sekcji, a mniej niż 5% RNA pozyskanego z MAV powinno pochodzić z krwi. Możliwe jest usunięcie niemal całej krwi poprzez perfuzję zwierzęcia 50 do 70 ml soli fizjologicznej przy użyciu technik histologicznych przed odcięciem głowy i wyjęciem mózgu. Jednak w takim przypadku znacznie trudniej jest zwizualizować tkanki MAV podczas sekcji. Trzema najbardziej prawdopodobnymi źródłami „zanieczyszczenia” tkanek MAV są szyszynka, tkanka warstwy I kory oraz resztkowa tkanka opuszki węchowej, lecz w preparacie może pojawić się również tkanka przysadki mózgowej. Zanieczyszczenie MAV szyszynką rozpoznaje się po obecności w MAV okrągłej sfery o średnicy od 1 do 2 mm, która ma ciemnoczerwony kolor. Główną funkcję szyszynki zwykle uznaje się za całkowicie odmienną od funkcji MAV. Jej podstawową rolą jest produkcja melatoniny, która reguluje aspekty rytmu okołodobowego9, oraz udział w lipooksygenacji10 prekursorów lipidowych. Chociaż uważano, że gen Lox, regulujący aktywność lipoksygenazy, występuje u dorosłych głównie w szyszynce10, nasze wyniki wskazują, że jest on również konsekwentnie obecny na znaczącym poziomie w MAV. Resztkowe zanieczyszczenie korą lub opuszką węchową objawia się obecnością w różowawej, sieciowatej tkance MAV gęstszych fragmentów tkanek o wielkości od 1 do 2 mm, które mają znacznie jaśniejszy kolor. Można to zauważyć, „floatując” MAV na powierzchni buforu, a następnie usuwając cięższe tkanki kory lub opuszki za pomocą dwóch pincet sekcyjnych.
Jeśli występuje zanieczyszczenie MAV tkanką z warstwy I kory, tkanką podwzgórza lub szyszynką, kilka genów będzie wykazywać znacznie silniejszą ekspresję niż ta zazwyczaj obecna w „czystej” sekcji. Zanieczyszczenie MAV szyszynką spowoduje wyższą ekspresję arylalkilaminy N-acetylotransferazy (Aanat), która jest niezbędna do syntezy melatoniny. Niestety, jeśli podczas sekcji MAV dojdzie do zanieczyszczenia szyszynką, poziomy Lox w MAV nie będą mogły zostać dokładnie określone. Zanieczyszczenie MAV tkanką korową spowoduje wyższą ekspresję genów specyficznych dla neuronów, takich jak hippokalcyna (Hpca), parwalbumina (Pvalb) i/lub neuronalny receptor pentraksyny (Nptxr). Zanieczyszczenie MAV tkanką podwzgórza spowoduje wyższą ekspresję hormonu wzrostu 1 (Gh1) oraz proopiomelanokortyny (Pomc). W przypadku wystąpienia zanieczyszczeń w pobranych tkankach, większość z tych genów można zidentyfikować i wykluczyć z analizy ekspresji genów. Jest to szczególnie istotne w przypadku genów obecnych we krwi obiegowej, które mogą nadal występować w MAV lub splotach naczyniówkowych.
Interpretacja danych dotyczących ekspresji genów z pobranych MAV i splotów naczyniówkowych
Powierzchowne naczynia krwionośne kory mózgu wraz z powiązanymi z nimi oponami (MAV) oraz splot choroidalny są niezbędne dla przepływu krwi w mózgu i homeostazy płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)4,11 ,12 ,13 ,14 ,15 ,16 ,17. Pobrana tkanka nadaje się do analizy biochemicznej i fizjologicznej, a analiza ekspresji genów wykazała, że MAV wykazuje wrażliwość na uszkodzenia wywołane amfetaminą i hipertermią1,2. Wyniki te są zgodne z wiedzą na temat wpływu ciężkiej hipertermii i ekspozycji na amfetaminy na naczynia krwionośne mózgu w ogóle 18,19,20. Ludzkie dane kliniczne potwierdzają przekonanie, że naczynia podtwardówkowe są podatne na uszkodzenia spowodowane amfetaminą i metamfetaminą 21,22. Ponadto główne i poboczne naczynia krwionośne mózgu, w tym te znajdujące się w warstwie pialnej opon, które są pobierane w ramach MAV, mogą być szczególnie interesujące podczas badania wstrząśnienia mózgu i innych urazów głowy 23,24 25. Obecny profil ekspresji genów uzyskany z MAV wskazuje, że pialna, a być może również pajęczynicza błona oponowa mogą odgrywać większą niż oczekiwano rolę w regulacji składu CSF. W przyszłości, dzięki zastosowaniu technik mikroskopii stereoskopowej, możliwe może być dalsze rozdzielenie tkanek tworzących MAV, tak aby błonę pialną i pajęczyniczą można było oddzielić od większych naczyń tętniczych, a potencjalnie także od siebie nawzajem. Umożliwi to lepszą interpretację funkcji każdego z tych trzech komponentów pobranego MAV.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia. Przedstawiona tutaj praca nie musikoniecznie odzwierciedlać opinii amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration).
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez NCTR/FDA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól fizjologiczna (9 g soli/1 l H2O)2O) | Własny | Bufor do sekcji | |
| 0,1 M fosforan sodu pH 7,4 | Wewnętrzny | Bufor do sekcji | |
| Keszery do kości | Roboz | RS-8300 | Usunięcie kości czaszki |
| Pinceta z zakrzywioną końcówką (4" długi & końcówka o szerokości 0,8 mm) | Roboz | RS-5135 lub RS-5137 | Pinceta anatomiczna |
| Pinceta z prostym końcem (5,5" długi ) | Roboz | RS-8124 lub RS-8104 | Kleszczyki chirurgiczne do opatrunków (typu thumb)* |
Bibliografia
- Thomas, M., George, N. I., Patterson, T. A., Bowyer, J. F. Amphetamine and environmentally induced hyperthermia differentially alter the expression of genes regulating vascular tone and angiogenesis in the meninges and associated vasculature. Synapse. 63, 881-894 (2009).
- Thomas, M., et al. Endoplasmic reticulum stress responses differ in meninges and associated vasculature, striatum, and parietal cortex after a neurotoxic amphetamine exposure. Synapse. 64, 579-593 (2010).
- Ek, C. J., Dziegielewska, K. M., Habgood, M. D., Saunders, N. R. Barriers in the developing brain and Neurotoxicology. Neurotoxicology. , (2012).
- Oldfield, B. J. M., Michael, J. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 391(1995).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods Mol. Biol. 686, 101-131 (2011).
- Johanson, C. E. Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: ? challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Res. 5, (2008).
- Scremin, O. U. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 3(1995).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Johnston, J. D. Photoperiodic regulation of prolactin secretion: changes in intra-pituitary signalling and lactotroph heterogeneity. J. Endocrinol. 180, 351-356 (2004).
- Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 95-99 (2010).
- Burnstock, G. Neurogenic control of cerebral circulation. Cephalalgia. 5, Suppl 2. 25-33 (1985).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. J. Appl. Physiol. 100, 1059-1064 (2006).
- Johanson, C. E., et al. Cognitive function and nigrostriatal markers in abstinent methamphetamine abusers. Psychopharmacology (Berl). 185, 327-338 (2006).
- Johnston, M., Papaiconomou, C. Cerebrospinal Fluid Transport: a Lymphatic Perspective. News Physiol. Sci. 17, 227-230 (2002).
- Johnston, M., Zakharov, A., Koh, L., Armstrong, D. Subarachnoid injection of Microfil reveals connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatics in the non-human primate. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 31, 632-640 (2005).
- Johnston, M., et al. Evidence of connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatic vessels in humans, non-human primates and other mammalian species. Cerebrospinal Fluid Res. 1, 2(2004).
- Kulik, T., et al. Regulation of cerebral vasculature in normal and ischemic brain. Neuropharmacol. 55, 281-288 (2008).
- Bowyer, J. F., Ali, S. F. High doses of methamphetamine that cause disruption of the blood-brain barrier in limbic regions produce extensive neuronal degeneration in mouse hippocampus. Synapse. 60, 521-532 (2006).
- Sharma, H. S., Westman, J., Nyberg, F. Pathophysiology of brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury. Prog. Brain Res. 115, 351-412 (1998).
- Sharma, H. S., Sjoquist, P. O., Ali, S. F. Drugs of abuse-induced hyperthermia, blood-brain barrier dysfunction and neurotoxicity: neuroprotective effects of a new antioxidant compound H-290/51. 13, 1903-1923 (2007).
- Ho, E. L., Josephson, S. A., Lee, H. S., Smith, W. S. Cerebrovascular complications of methamphetamine abuse. Neurocrit. Care. 10, 295-305 (2009).
- Ohta, K., et al. Delayed ischemic stroke associated with methamphetamine use. J. Emerg. Med. 28, 165-167 (2005).
- Brenner, L. A. Neuropsychological and neuroimaging findings in traumatic brain injury and post-traumatic stress disorder. Dialogues Clin. Neurosci. 13, 311-323 (2011).
- Case, M. E. Inflicted traumatic brain injury in infants and young children. Brain Pathol. 18, 571-582 (2008).
- Maas, A. I., et al. Prognostic value of computerized tomography scan characteristics in traumatic brain injury: results from the IMPACT study. J. Neurotrauma. 24, 303-314 (2007).
Przedruki i uprawnienia
