Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Podsumowanie

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Streszczenie

Tradycyjny podskórny model nowotworowy nie jest optymalny do badania raka jelita grubego. Ortotopowe modele mysie raka jelita grubego, w których komórki nowotworowe rozwijają się w ich naturalnej lokalizacji, z wysoką wiernością odwzorowują przebieg choroby u ludzi. Do stworzenia tego modelu można zastosować dwie techniki. Obie metody są podobne i wymagają znieczulenia myszy oraz laparotomii w celu odsłonięcia kątnicy. Pierwsza technika polega na wstrzyknięciu zawiesiny komórek raka jelita grubego w ścianę kątnicy. Komórki nowotworowe są najpierw hodowane in vitro, zbierane w fazie subkonfluencji i przygotowywane w formie zawiesiny pojedynczych komórek. Małą objętość komórek wstrzykuje się powoli, aby zapobiec wyciekowi. Druga technika polega na przeszczepieniu fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Mysz z wcześniej indukowanym podskórnym nowotworem jelita grubego zostaje uśmiercona, a guz usunięty przy użyciu techniki sterylnej. Fragment guza jest dzielony na mniejsze części w celu przeszczepienia ich innej myszy. Przed transplantacją ścianę kątnicy delikatnie uszkadza się, aby ułatwić infiltrację komórek nowotworowych. Czas rozwoju guzów pierwotnych i przerzutów do wątroby będzie się różnić w zależności od zastosowanej techniki, linii komórkowej oraz gatunku myszy. Ten ortotopowy model mysi jest użyteczny w badaniu naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowaniu nowych środków terapeutycznych przeciwko temu nowotworowi.

Protokół

I. Przygotowanie komórek

1. Komórki raka jelita grubego hoduje się w kulturze i zbiera, gdy są subkonfluentne.
2. Przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przechowuje ją w lodzie.

II. Przygotowanie guza

1. Mysz z wcześniej wywołanym podskórnym guzem jelita grubego zostaje poddana eutanazji.
2. Guz podskórny zostaje usunięty przy użyciu techniki sterylnej i podzielony na fragmenty o wielkości 2-3 mm.
3. Fragmenty guza są przechowywane w soli fizjologicznej fosforanowej w lodzie.

III. Przygotowanie myszy

Uwaga: W naszym laboratorium do znieczulania myszy stosujemy wziewny izofluran; alternatywnie można zastosować środki znieczulające w formie iniekcji, aby uzyskać ten sam efekt

1. Głębokość znieczulenia ocenia się za pomocą ucisku palca u nogi. Odruch wycofania po uciśnięciu palca nie powinien wystąpić.
2. Na tym etapie można podać antybiotyki.
3. Znieczuloną mysz, która została uprzednio ogolona, ustawia się w odpowiedniej pozycji.
4. Brzuch przygotowuje się za pomocą roztworu betadyny.
5. Brzuch oraz miejsce operacyjne zostają obłożone sterylnymi chustami.

IV. Laparotomia

1. W skórze wykonuje się niewielkie nacięcie
2. Mięśnie ściany brzucha zostają chwycone i uniesione
3. Następuje wejście do jam brzusznej, a jedno ostrze nożyczek służy do odsunięcia zawartości jamy brzusznej
4. Nacięcie zostaje rozszerzone do 2-3 cm

V. Odsłonięcie kątnicy

1. Identyfikuje się i wypreżnia kątnicę wraz z jej ślepym workiem
2. Kątnicę izoluje się od reszty organizmu myszy, używając wcześniej dociętej, sterylnej gazy
3. Do utrzymania wilgotności kątnicy stosuje się ciepły roztwór soli fizjologicznej

VI. Wstrzykiwanie komórek do ściany kątnicy

1. Do wstrzyknięcia 50 µL objętości komórek w ścianę kątnicy używa się igły o rozmiarze 27 G lub cieńszej
2. Igłę należy wyjąć
3. Miejsce wstrzyknięcia poddaje się kontroli, aby upewnić się, że nie występuje wyciek
4. Kątnicę wprowadza się z powrotem do jamy brzusznej

VII. Przeszczepienie guza na kątnicę

Uwaga: Oprócz wstrzykiwania komórek w ścianę kątnicy, alternatywnym podejściem jest przeszczepienie guza na kątnicę

1. Na kątnicy wykonuje się szew w kształcie ósemki, używając nici o rozmiarze 6-0 lub 7-0
2. Ścianę kątnicy lekko uszkadza się
3. Następnie umieszcza się fragment guza
4. Szew zostaje zawiązany
5. Kątnica zostaje wprowadzona z powrotem do jamy brzusznej

VIII. Zamknięcie ściany brzusznej i rekonwalescencja myszy

1. Ścianę brzuszną myszy zamyka się za pomocą trzech szwów przerywanych, używając nici chirurgicznej o rozmiarze 3-0 lub 4-0
2. Alternatywnie można zastosować prosty szew ciągły
3. Na tym etapie można podać przeciwbólowe leki pooperacyjne oraz bolus płynowy
4. Pozostawia się mysz do wybudzenia z anestezji.

Uwaga: W przypadku anestetyków wziewnych proces ten trwa zazwyczaj 30 sekund

IX. Wyniki - Guz pierwotny i przerzuty do wątroby

Guz pierwotny – pokazany in situ (A) oraz z dowodami neowaskularyzacji (B); w barwieniu H&E guzy są miejscowo naciekające (C)

 

Przerzuty w wątrobie – widok ex vivo (D)

Dyskusja

Choć mysie modele guzów podskórnych są łatwe do ustanowienia i monitorowania, oczywiste jest, że model ten nie może odtworzyć pierwotnej lokalizacji anatomicznej raka jelita grubego. Ze względu na różnice w mikrośrodowisku wykazano, że komórki raka jelita grubego rosnące pod skórą zmieniają swój fenotyp i prawie zawsze nie ulegają progresji ani nie dają przerzutów ^1,2. W rzeczywistości odpowiedź guza na terapię może drastycznie różnić się w zależności od tego, czy komórki nowotworowe zostały wszczepione w loka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki i komponenty do hodowli komórkowej			będą się różnić w zależności od użytej linii komórkowej
Sól fizjologiczna (PBS)	BioWhittaker	17-512F	dostępna również u wielu innych dostawców
Probówki wirówkowe 15 mL, polipropylenowe	Corning	430790
Płytki 6-dołkowe z pokrywką	BD Biosciences	353046
Pinceta Iris, prosta, z ząbkami	World Precision Instruments, Inc.	15914	zaleca się posiadanie dwóch takich narzędzi
Nożyczki sekcyjne Iris, proste, ostre	World Precision Instruments, Inc.	14393
Igłotrzymacz (standardowy)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Igłotrzymacz (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	narzędzia należy okresowo autoklawować, ale można je również sterylizować poprzez namaczanie w roztworze Cidex
Nici chirurgiczne 6-0 lub 7-0			do ślepego jelita; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Nici chirurgiczne 3-0 lub 4-0			do ściany brzucha; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Aparat do znieczulania / Izofluran	J.A. Baulch and Associates	3206	dostępne również u wielu innych dostawców
Mata grzewcza, jednorazowa, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Taśma, pomarańczowa, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	do unieruchomienia znieczulonej myszy
Trymer Pro-Cord/Cordless	Oster Professional Products	78997-010	do strzyżenia futra myszy
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	można nabyć w każdym sklepie z artykułami medycznymi
Gaza 2 x 2, 3-warstwowa	Johnson & Johnson	7635	można nabyć w każdym sklepie z artykułami medycznymi
Pole sterylne, bariera, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	można nabyć w każdym sklepie z artykułami medycznymi
Aplikatory z końcówką bawełnianą, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	można nabyć w każdym sklepie z artykułami medycznymi
Strzykawka, 10 cc, z końcówką Luer-lock	BD Biosciences	309604
Strzykawka, 1 cc, tuberkulinowa, z końcówką typu slip	BD Biosciences	309602
Igła 27 1/2 G	BD Biosciences	305109
Igła 30 G	BD Biosciences	305106