Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Saeed Ansari; Hassan Azari; Kenneth J. Caldwell; Robert W. Regenhardt; Vishnumurthy S. Hedna; Micheal F. Waters; Brian L. Hoh; Adam P. Mecca

doi:10.3791/50014

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

19.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50014

⸱

16 lutego 2013

Saeed Ansari¹ , Hassan Azari² , Kenneth J. Caldwell¹ , Robert W. Regenhardt³ , Vishnumurthy S. Hedna⁴ , Micheal F. Waters⁴ , Brian L. Hoh¹ , Adam P. Mecca³

¹Department of Neurosurgery, University of Florida , ²Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran , ³Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida , ⁴Department of Neurology, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Kilka zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu zostało opracowanych w celu symulacji ludzkiego stanu udaru. Protokół ten opisuje model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej indukowanej endoteliną-1 (ET-1) (MCAO) dla udaru niedokrwiennego u szczurów. Ponadto omówiono ważne względy, zalety i wady tego modelu.

Streszczenie

Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie, kosztując szacunkowo 70 miliardów dolarów w Stanach Zjednoczonych w 2009 roku^{1, 2}. Opracowano kilka modeli niedokrwienia mózgu, aby naśladować ludzki stan udaru. Sugeruje się, że do 80% wszystkich udarów wynika z uszkodzenia niedokrwiennego w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA)³. Na początku lat dziewięćdziesiątych XX wieku endotelina-1 (ET-1) ⁴ była stosowana do wywoływania niedokrwienia poprzez nakładanie jej bezpośrednio przylegającej do powierzchni MCA po kraniotomii. Później model ten został zmodyfikowany ⁵ poprzez użycie stereotaktycznego wstrzyknięcia ET-1 w sąsiedztwie MCA w celu wytworzenia ogniskowego niedokrwienia mózgu. Do głównych zalet tego modelu należy możliwość szybkiego wykonania zabiegu, możliwość kontrolowania zwężenia tętnicy poprzez zmianę dawki dostarczanego ET-1, brak konieczności manipulowania naczyniami pozaczaszkowymi dostarczającymi krew do mózgu, a także stopniowe tempo reperfuzji, które bardziej naśladuje reperfuzję u ludzi^5-7. Z drugiej strony model ET-1 ma wady, do których należy konieczność wykonania kraniotomii, a także większa zmienność objętości wyrzutu⁸. Zmienność tę można zmniejszyć za pomocą laserowej przepływomierzy dopplerowskiej (LDF) w celu weryfikacji niedokrwienia mózgu podczas infuzji ET-1. Czynniki wpływające na zmienność udaru obejmują precyzję infuzji i partię użytego ET-1⁶. Inną ważną kwestią jest to, że chociaż reperfuzja jest częstym zjawiskiem w udarze mózgu, czas trwania okluzji dla MCAO indukowanego przez ET-1 może nie naśladować ściśle udaru ludzkiego, w którym wielu pacjentów ma częściową reperfuzję w okresie od kilku godzin do dni po okluzji^{9, 10}. Protokół ten szczegółowo oopisuje model MCAO indukowany ET-1 dla udaru niedokrwiennego u szczurów. Zwróci również uwagę na szczególne względy i potencjalne wady w trakcie całej procedury.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" (ósme wydanie, National Academy of Sciences, 2011).

Materiały

Zwierzęta: Ośmiotygodniowy samiec szczura Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) o wadze 250-300 g w momencie operacji.
znieczulenie
1. System znieczulenia wziewnego (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
2. Znieczulenie izofluranem (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
System stereotaktyczny (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
1. System stereotaktyczny dla małych zwierząt
2. Niepękające nauszniki dla szczurów
3. Uchwyt na głowicę do znieczulenia gazowego dla szczurów
Regulacja temperatury
1. Termometr z mikrosondą BAT-12 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Floryda, USA)
2. T/PUMP, koc termiczny TP600 (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
Chirurgicznych
1. Rękojeść skalpela i ostrze #11, kleszczyki do przysłony, kleszcze Graefe, zwijacze zacisków bulldog, śrubokręt, strzykawka 10 μl z igłą skośną o rozmiarze 26 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
2. Wiertarka mikrosilnikowa i uchwyt stereotaktyczny, Quintessential Stereotaxic Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
3. Wiertło okrągłe 1,0 mm, wiertło z odwróconym stożkiem 1,0 mm (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
Materiały chirurgiczne
1. montażowe 0-80 X 3/32 o długości trzpienia 2,4 mm, kaniula prowadząca o rozmiarze 21 [długość 4 mm poniżej cokołu] i atrapa kaniuli (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
2. Proteza strumieniowa, akryl i płyn (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
3. Szew nylonowy 3.0 (Oasis, Mettawa, IL, USA)
4. Waciki, maść do oczu Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
5. Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów (Oster, Providence, RI, USA)
chemikalia
1. Endothelin-1 (amerykański peptyd, Sunnyvale, CA, USA)
2. Chlorheksydyna 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
3. Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, Stany Zjednoczone)
Sprzęt do wizualizacji
1. Mikroskop chirurgiczny (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
2. Oświetlacz światłowodowy (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
Laserowy system przepływomierza dopplerowskiego (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
1. Standardowa sonda ołówkowa
2. Uchwyt sondy
3. Miernik przepływu krwi
4. Powerlab 4/30 z wykresem LabChart 7
Pomiar objętości zawału
1. Macierz mózgu szczura (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
2. Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) rozcieńczony do 0,05% w PBS
3. Skaner płaski (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
4. Oprogramowanie Image J (oprogramowanie ImageJ 1.42q, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Kroki przedoperacyjne

Przed zabiegiem szczury są trzymane w cyklu światło/ciemność 12:12 ze swobodnym dostępem do wody i karmy dla gryzoni.
Znieczulenie indukuje się za pomocą 4% izofluranu w mieszaninie 100% gazów_O2 w komorze indukcyjnej, aż szczur przestanie się wycofywać, aby uszczypnąć tylną łapę.
Podczas tego zabiegu należy zachować technikę aseptyczną, w tym stosowanie sterylnych rękawiczek, sterylnych narzędzi chirurgicznych i sterylnej serwety^{chirurgicznej 11}.
Czubek głowy jest golony elektrycznymi maszynkami do strzyżenia włosów.
Szczura umieszcza się w pozycji leżącej na podkładce chłonnej leżącej na powierzchni roboczej o kontrolowanej temperaturze (kocu termicznym).
Głowę umieszcza się w aparacie stereotaktycznym, rozpoczynając od założenia maski znieczulającego gazem.
Następnie wkładane i dokręcane są nauszniki.
Podczas zabiegu znieczulenie jest utrzymywane 2% izofluranem w mieszaninie 100%_O2 gazów.
Smarującą maść okulistyczną nakłada się na oba oczy, a powieki są zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu chirurgicznego.
Sonda temperatury doodbytniczej jest wprowadzana w celu utrzymania stałej temperatury ciała zwierzęcia wynoszącej 37±0,5 °C.
Przy mocno trzymanej głowie w urządzeniu stereotaktycznym, obszar operacyjny jest oczyszczany naprzemiennie 2% chlorheksydyną i trzykrotnym roztworem soli fizjologicznej.

2. Kroki chirurgiczne

Za pomocą skalpela wykonuje się nacięcie w linii środkowej na skórze pokrywającej calvarium od najbardziej ogonowych aspektów oczu (nasion) do między uszami (linia karkowa górna).
Skóra jest następnie cofana na boki za pomocą 3 zacisków buldoga.
Tkanka łączna jest usuwana z czaszki za pomocą suchych wacików, dzięki czemu można wyraźnie zobaczyć wiele struktur. Należą do nich bregma, szew koronalny i prawy boczny grzbiet czaszki. Waciki bawełniane służą do usuwania krwi z pola operacyjnego.
Za pomocą mikroskopu chirurgicznego lokalizuje się bregmę, a manipulatory stereotaktyczne są regulowane, aż okrągłe wiertło 1,0 mm zostanie wyzerowane w bregmie.
Wiertło jest następnie przesuwane na 1,6 mm do przodu i 5,2 mm na bok do bregmy.
Otwór na wiertło, który penetruje czaszkę, jest wiercony w celu umieszczenia kaniuli (ryc. 1). Nadmiar gruzu i krwi jest stale usuwany za pomocą bawełnianych wacików.

W tym momencie można wprowadzić kaniulę prowadzącą (krok 7) lub wykonać bezpośrednie wstrzyknięcie ET-1 przez otwór wiertła (przejdź bezpośrednio do kroku 16).

Następnie wierci się otwory na 3 mocujące przez częściową grubość czaszki za pomocą wiertła z odwróconym stożkiem o średnicy 1,0 mm (rysunek 1). W każdej kości czołowej wierci się po jednym otworze około 1-2 mm przed szwem koronalnym i 1-2 mm bocznie do szwu strzałkowego. Jeden otwór wierci się w kości ciemieniowej około 2-3 mm za szwem koronalnym i 2-3 mm bocznie do szwu strzałkowego ipsilateralnie do otworu wiertła kaniuli prowadzącej. Trzy montażowe 0-80 x 3/32 są umieszczone w tych otworach na wiertła i zapewniają podparcie dla cementu utrzymującego się w kaniuli. należy przesuwać tylko o 2 lub 3 obroty, aby nie uszkodzić opony twardej.
Kaniulę prowadzącą umieszcza się w stereotaktycznym uchwycie kaniuli i znajduje się bregma.
Manipulatory stereotaktyczne są regulowane do momentu, aż kaniula prowadząca zostanie wyzerowana w punkcie bregma. Kaniulę przenosi się do otworu wiertła znajdującego się 1,6 mm z przodu i 5,2 mm z boku do bregmy.
Na koniec kaniula prowadząca jest opuszczana do otworu wiertła z końcową pozycją końcówki 4,5 mm brzusznie do bregmy.
Umieszczenie laserowej sondy przepływu Dopplera (opcjonalnie)
1. W celu monitorowania przepływu krwi w mózgu za pomocą LDF, uchwyt sondy można umieścić w odpowiednim miejscu przed przymocowaniem kaniuli prowadzącej do cementu dentystycznego.
2. Podstawa uchwytu sondy jest przycięta równo z cokołem, z wyjątkiem małej wypustki w kształcie klina.
3. Uchwyt sondy jest następnie umieszczany z tyłu kaniuli prowadzącej i tylko przyśrodkowo do bocznego grzbietu czaszki z zakładką skierowaną przyśrodkowo (ryc. 1).
4. Uchwyt sondy i kaniula prowadząca są mocowane razem za pomocą cementu dentystycznego.
Cement dentystyczny jest następnie używany do zabezpieczenia kaniuli na miejscu. Cement styka się ze wszystkimi trzema i otacza całą podstawę kaniuli.
Cement powinien być całkowicie suchy przed usunięciem uchwytu kaniuli. Trwa to około 5 minut.

Po tych krokach, nacięcie chirurgiczne może zostać zamknięte, a manekin kaniuli może zostać wkręcony w kaniulę prowadzącą. Alternatywnie, MCAO indukowane ET-1 można wykonać na szczurze po okresie rekonwalescencji po operacji implantacji kaniuli. W przypadku tej metody krok 19 należy wykonać jako następny, a kroki 14-18 można wykonać w późniejszym czasie. Aby wykonać implantację kaniuli prowadzącej i wstrzyknięcie ET-1 podczas tego samego zabiegu, należy wykonać krok 14.

Strzykawkę infuzyjną napełnia się ET-1 (rozcieńczonym do 80 μM w PBS), a następnie umieszcza w wstrzykiwaczu stereotaktycznym.
Manipulatory stereotaktyczne są regulowane do momentu, aż końcówka igły zostanie wyzerowana na krawędzi kaniuli prowadzącej.
Końcówka igły jest opuszczana przez kaniulę prowadzącą do pozycji 17,2 mm brzusznej do krawędzi kaniuli prowadzącej. Jeśli kaniula prowadząca nie jest używana, końcówka igły jest zerowana w bregma i opuszczana przez otwór wiertła do pozycji 8,7 mm brzusznej do bregma.
3 μl 80 μM ET1 podaje się w infuzji z szybkością 1 μl na minutę.
Strzykawkę pozostawia się na miejscu przez 3 minuty po zakończeniu infuzji, a następnie powoli wyjmuje.
Nacięcie zamyka się nylonowym szwem 3,0, a manekin kaniuli wkręca się w kaniulę.
Po zabiegu należy zastosować odpowiednią dawkę leku przeciwbólowego (tj. buprenorfiny w dawce 0,05-0,1 mg/kg), aby zminimalizować ból i dyskomfort w okresie rekonwalescencji.
Szczur jest usuwany z sali operacyjnej i umieszczany w ciepłym, suchym miejscu do rekonwalescencji, aby zapobiec hipotermii, z bezpłatnym, łatwym dostępem do miękkiego pokarmu i wody.