Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Philip O'Herron; Zhiming Shen; Zhongyang Lu; Adrien E. Schramm; Manuel Levy; Prakash Kara

doi:10.3791/50025

Artykuł metodologiczny

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

DOI:

10.3791/50025

⸱

12 grudnia 2012

Philip O'Herron¹ , Zhiming Shen¹ , Zhongyang Lu¹ , Adrien E. Schramm¹ , Manuel Levy¹ , Prakash Kara¹

¹Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W głównej korze wzrokowej ssaków innych niż gryzonie, neurony są grupowane zgodnie z ich preferencjami dla cech bodźców, takich jak orientacja^1-4, kierunek^5-7, dominacja oka^8,9 i różnica obuoczna⁹. Selektywność orientacji jest najczęściej badaną cechą, a ciągła mapa z quasi-okresowym układem preferowanej orientacji jest obecna w całej pierwszorzędowej korze wzrokowej^10,11. Zintegrowanie wkładów synaptycznych, komórkowych i sieciowych, które prowadzą do selektywnych odpowiedzi na bodźce w tych mapach funkcjonalnych, wymaga hybrydyzacji technik obrazowania, które obejmują skale przestrzenne od submikronów do milimetrów. Dzięki konwencjonalnemu obrazowaniu optycznemu sygnału wewnętrznego można określić ogólny układ map funkcjonalnych na całej powierzchni kory wzrokowej¹². Opracowanie mikroskopii dwufotonowej in vivo z wykorzystaniem barwników wrażliwych na wapń umożliwia określenie danych synaptycznych docierających do poszczególnych kolców dendrytycznych¹³ lub jednoczesne rejestrowanie aktywności z setek pojedynczych ciał komórek nerwowych^6,14. W związku z tym połączenie obrazowania sygnału wewnętrznego z submikronową rozdzielczością przestrzenną mikroskopii dwufotonowej daje możliwość dokładnego określenia, które segmenty i komórki dendrytyczne przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej w korze nowej. Tutaj demonstrujemy wysokowydajną metodę szybkiego uzyskiwania mapy orientacji kory mózgowej i celowania w określoną mikrodomenę w tej funkcjonalnej mapie do znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi u ssaków innych niż gryzonie. Za pomocą tego samego mikroskopu, który jest używany do obrazowania dwufotonowego, najpierw generujemy mapę orientacji za pomocą obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego. Następnie pokazujemy, jak celować w mikrodomenę zainteresowania za pomocą mikropipety wypełnionej barwnikiem, aby oznaczyć populację ciał komórek nerwowych lub oznaczyć pojedynczy neuron tak, aby dendryty, kolce i aksony były widoczne in vivo. Nasze udoskonalenia w stosunku do poprzednich metod ułatwiają badanie relacji struktura-funkcja neuronów z rozdzielczością subkomórkową w ramach funkcjonalnych architektur kory nowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie chirurgiczne

Wywołaj znieczulenie i stale monitoruj tętno, koniec oddechowego CO₂, EEG i temperaturę. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie i były oparte na tych, które opublikowaliśmy wcześniej^9,15.
Odsłoń grzbietową powierzchnię czaszki, przecinając skórę ostrzem skalpela. Wypreparuj tkanki łączne pokrywające kość za pomocą kirety Brudon. Oczyść kość za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i bawełnianej gazy. Nałóż wosk kostny (w razie potrzeby) na czaszkę, aby zatrzymać sporadyczne krwawi....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować precyzję naszych metod znakowania barwników, skupiliśmy się na najmniejszej mikrodomenie spośród wszystkich znanych map funkcjonalnych w korze nowej nienależącej do gryzoni. Słabo interpunkcyjne na całej mapie orientacji w pierwszorzędowej korze wzrokowej są osobliwości. Występują one w punktach, w których wszystkie preferowane orientacje zbiegają się tak, że na mapach o fałszywej kolorystyce preferowanej orientacji obszary wokół osobliwości wyglądają jak "wiatraczki" (Rysunek 2A-B). Do o.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę celowania w znakowanie ciał komórek neuronalnych (lub dendrytów i aksonów) w określonych wcześniej funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Połączenie obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego z mikroskopią dwufotonową daje możliwość określenia, które synapsy i komórki przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej, czy selektywność neuronalna koreluje z lokalizacją neuronu na mapie funkcjonalnej oraz jakie składniki obwodu neuronalnego zmieniają się wraz z doświadczeniem wzrokowym

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Eye Institute R01EY017925 i R21EY020985 oraz fundusze z Fundacji Dana & Whitehall dla P.K. Dziękujemy również Mateuszowi Petrelli za pomoc w zabiegach chirurgicznych; Grace Dion za śledzenie dendrytów pokazanych na rysunku 5A; oraz Pratikowi Chhatbarowi za komentarze do rękopisu.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa

Firma

Numer katalogowy

Komentarze

1. Przygotowanie do podtrzymywania życia/eksperymentu

Isoflurane

Webster Vet

NDC 57319-474-05

Waporyzator izofluranowy

Midmark

VIP 3000

Koc grzewczy regulowany sprzężeniem zwrotnym

Harvard Apparatus

50-7079F

Monitor EKG

Digicare Biomedical

LifeWindow Lite

Wzmacniacz EEG

A-M Systems

1800

Monitor EEG

Hewlett Packard

78304A

Monitor końca pływów CO₂

Respironics

Novametrix Capnoguard 1265

Zoptymalizuj wentylację

Frezy z węglików spiekanych do wiercenia w kości

Henry Schein

drobne (końcówka 0,5 mm) i grube (końcówka 1,25 mm)

Cement do płyty czołowej/komory

Dentsply

675571, 675572

farba temperowa proszkowa

Sargent Art Inc.

22-7185

Dodaj do cementu, aby poprawić osłonę światła i zmniejszyć odbicia

Agaroza - Typ III-A

Sigma

A9793

Do minimalizacji pulsacji podczas obrazowania sygnału wewnętrznego i dwufotonowego

Szkło nakrywkowe: średnica 5 lub 8 mm, grubość 0,17 mm

Precision Instruments

502040, 502041

W celu zminimalizowania pulsacji podczas obrazowania, szkło nakrywcowe można przyciąć w razie potrzeby

Łyżeczki Brudon

George Tiemann

105-715-0, 105-715-3

Czyszczenie powierzchni czaszki

Wosk kostny

Ethicon

W31G

Szybko zatrzymuje krwawienie

Aplikator z bawełnianą końcówką

Mikroskopia elektronowa

Nauki 72308-05

Czysta i sucha powierzchnia kości

Dumont #5CO Kleszcze

Narzędzia do nauki

11295-20

Chwyć pojedyncze warstwy opony twardej lub pia

Vannas Nożyczki sprężynowe

Narzędzia do nauki

15000-03

Cut

dura Gelfoam

Pfizer

09-0396-05

Aby zatrzymać krwawienie na oponie twardej

Włócznie absorpcyjne

Fine Science Tools

18105-01

Ultraszybkie i niestrzępiące się odprowadzanie płynu słuchowego

Materiał zaciemniający

Thorlabs

BK5

Kraniotomia tarczowa

2. Przygotowanie / wtrysk barwnika

Dimethyl Sulphoxide (DMSO)

Sigma

D2650

Pluronic

Sigma

P2443

Oregon Green 488 Bapta-1 AM

Invitrogen

O6807

Wskaźnik wapnia

Alexa Fluor 594

Invitrogen

A10438

Filtr odśrodkowy (0,45 μ m wielkość porów)

Millipore

UFC30HV00

Do usuwania zanieczyszczeń przed wstrzyknięciem

Ściągacz do pipet

szklanych Sutter Instruments

P97

Kapilara z włókna ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,5 mm)

World Precision Instruments

1B150F-4

Pipeta do wyrzucania barwnika

Mikroładowarka Eppendorf

5242 956 003

Do ładowania barwnika do pipety

Mikromanipulator

Sutter Instruments

MP-285

Do pozycjonowania pipety

Regulator impulsów ciśnienia

Parker Hannifin

PicoSpritzer III

Do wtryskiwania barwnika pod ciśnieniem

Elektroporator jednoogniwowy

Urządzenia molekularne

Axoporator 800A

Do elektroporacji barwnika

3. Obrazowanie wewnętrzne

4-krotny obiektyw (0,13 NA, 17 mm WD)

Olympus

UPLFLN4X

Wewnętrzny sprzęt / oprogramowanie

Optical Imaging Inc.

Imager 3001 / VDAQ

Oprogramowanie VDAQ służy do obrazowania epizodycznego

Kamera CCD

Adimec

Adimec-1000

Źródło światła Zasilacz

KEPCO

ATE 15-15M

Źródło światła

Optical Imaging Inc.

HAL 100

Natężenie światła na powierzchni kory wynosi 3-5 mW

Zielony filtr (do obrazu naczyniowego)

Optical Imaging Inc.

λ = 546 nm (pasmo przepustowe 30 nm)

Dla obrazu referencyjnego unaczynienia powierzchniowego

Filtr czerwony (dla sygnału wewnętrznego)

Optical Imaging Inc.

λ = 630 nm (pasmo przepustowe 30 nm)

Do zbierania sygnałów wewnętrznych

Filtr ciepła

Optical Imaging Inc.

KG-1

4. Dwufotonowy aparat/obrazowanie

Mikroskop dwufotonowy i oprogramowanie

Prairie Technologies

Zobacz Shen et al. 2012 dla ścieżki światła, filtrów i mocy lasera

Ti:Szafirowy laser

Spectra-Physics

Mai Tai XF

20x (0,5 NA; 3,5 mm WD)

Obiektyw Olympus

UMPLFLN20X

0,5 NA służy tylko do ustawiania pipety nad kraniotomią (nie do obrazowania dwufotonowego)

20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)

Olympus

XLUMPLFLN20X

40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)

Olympus

LUMPLFLN40X/IR

Newport

ST-200

Izoluje przygotowanie od wibracji zewnętrznych

xy stage

Mike’ s Machine Co. (Attleboro, MA)

Obiekt eksperymentalny i mikromanipulator Sutter umieszczony na xy stage

Recipes
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy	NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl₂ (1,0 mM), CaCl₂ (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Pipeta Solution¹⁴	NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4

World Stół powietrzny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intrinsic Signal Imaging Two photon Microscopy Orientation Map Neuron Labeling Functional Micro domain Cortical Imaging Fluorescent Dye Single Neuron Resolution Visual Cortex Sub cellular Resolution

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły