Artykuł metodologiczny

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

DOI:

10.3791/50025

⸱

12 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W głównej korze wzrokowej ssaków innych niż gryzonie, neurony są grupowane zgodnie z ich preferencjami dla cech bodźców, takich jak orientacja1-4, kierunek5-7, dominacja oka8,9 i różnica obuoczna9. Selektywność orientacji jest najczęściej badaną cechą, a ciągła mapa z quasi-okresowym układem preferowanej orientacji jest obecna w całej pierwszorzędowej korze wzrokowej10,11. Zintegrowanie wkładów synaptycznych, komórkowych i sieciowych, które prowadzą do selektywnych odpowiedzi na bodźce w tych mapach funkcjonalnych, wymaga hybrydyzacji technik obrazowania, które obejmują skale przestrzenne od submikronów do milimetrów. Dzięki konwencjonalnemu obrazowaniu optycznemu sygnału wewnętrznego można określić ogólny układ map funkcjonalnych na całej powierzchni kory wzrokowej12. Opracowanie mikroskopii dwufotonowej in vivo z wykorzystaniem barwników wrażliwych na wapń umożliwia określenie danych synaptycznych docierających do poszczególnych kolców dendrytycznych13 lub jednoczesne rejestrowanie aktywności z setek pojedynczych ciał komórek nerwowych6,14. W związku z tym połączenie obrazowania sygnału wewnętrznego z submikronową rozdzielczością przestrzenną mikroskopii dwufotonowej daje możliwość dokładnego określenia, które segmenty i komórki dendrytyczne przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej w korze nowej. Tutaj demonstrujemy wysokowydajną metodę szybkiego uzyskiwania mapy orientacji kory mózgowej i celowania w określoną mikrodomenę w tej funkcjonalnej mapie do znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi u ssaków innych niż gryzonie. Za pomocą tego samego mikroskopu, który jest używany do obrazowania dwufotonowego, najpierw generujemy mapę orientacji za pomocą obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego. Następnie pokazujemy, jak celować w mikrodomenę zainteresowania za pomocą mikropipety wypełnionej barwnikiem, aby oznaczyć populację ciał komórek nerwowych lub oznaczyć pojedynczy neuron tak, aby dendryty, kolce i aksony były widoczne in vivo. Nasze udoskonalenia w stosunku do poprzednich metod ułatwiają badanie relacji struktura-funkcja neuronów z rozdzielczością subkomórkową w ramach funkcjonalnych architektur kory nowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Wywołaj znieczulenie i stale monitoruj tętno, koniec oddechowego CO2, EEG i temperaturę. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie i były oparte na tych, które opublikowaliśmy wcześniej9,15.
  2. Odsłoń grzbietową powierzchnię czaszki, przecinając skórę ostrzem skalpela. Wypreparuj tkanki łączne pokrywające kość za pomocą kirety Brudon. Oczyść kość za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i bawełnianej gazy. Nałóż wosk kostny (w razie potrzeby) na czaszkę, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie przez małe żyły emisariusza.
  3. Przymocuj tytanową lub stalową płytkę głowy do czaszki (nad obszarem zainteresowania, w którym zostanie wykonana kraniotomia) za pomocą cementu dentystycznego zmieszanego z czarną farbą (patrz Materiały). Prostokątny otwór pośrodku płyty głowy zapewnia dostęp do kraniotomii i obrazowania optycznego. Zamocuj metalową komorę na górze płyty czołowej. Komora ta będzie służyć jako zbiornik płynu do obrazowania za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie.
  4. Przymocuj płytę czołową do stolika xy za pomocą metalowych słupków.
  5. Rozrzedzić duży obszar kości w prostokątnym otworze płyty głowy za pomocą wiertła dentystycznego. Obszar, który ma zostać przerzedzony, musi wykraczać daleko poza granice planowanej kraniotomii. Grube czaszki ssaków innych niż gryzonie muszą zostać przerzedzone, jeśli mają być uzyskane obrazy o wysokiej rozdzielczości z kory nowej, ponieważ w miejscu kraniotomii grubość kości będzie dyktować grubość agarozy między szkłem nakrywkowym a powierzchnią kory nowej (patrz poniżej).
  6. Wywierć kwadratowy kontur o wymiarach 2 x 2 mm w kości do kraniotomii. Okresowo płukaj komorę świeżym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), aby usunąć odłamki kości i zminimalizować rozpraszanie ciepła do leżącej poniżej kory. W razie potrzeby nałóż wosk kostny, aby zatrzymać sporadyczne krwawienie.
  7. Podnieś płat kostny za pomocą kleszczy #3.
  8. Usuń całą warstwę opony twardej oprócz dolnej za pomocą cienkich kleszczyków (#5CO) i nożyczek sprężynowych Vannas. Opona twarda u ssaków innych niż gryzonie jest gruba i nieprzezroczysta, ale można ją usunąć w odrębnych warstwach. Krwawienie występuje rzadko, ale można je zatamować za pomocą pianki żelowej, a wszelkie pozostałości krwi należy delikatnie usunąć z pozostałej warstwy opony twardej za pomocą kleszczy i spłukać ACSF. Ostatnia warstwa opony twardej jest przezroczysta i naczynia opony twardej powinny być przez nią wyraźnie widoczne. Pozostawienie tej ostatniej warstwy opony twardej nienaruszonej podczas obrazowania sygnału wewnętrznego zwiększy wskaźnik sukcesu masowego ładowania fluorescencyjnych wskaźników wapnia w kolejnej fazie obrazowania dwufotonowego eksperymentu (patrz Dyskusja).
  9. Nałóż kroplę ciepłej 2% agarozy (rozpuszczonej w ACSF) i natychmiast umieść szklankę nakrywkową na kraniotomii. Sprawdź kraniotomię, aby upewnić się, że pulsacje oddechowe i sercowo-naczyniowe są minimalne, używając chirurgicznego mikroskopu preparacyjnego lub okularów mikroskopu dwufotonowego w trybie jasnego pola.

2. Obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego

  1. Dodaj żelową piankę nasączoną ACSF wokół zewnętrznej strony szkła nakrywkowego, aby zapobiec wysychaniu agarozy podczas obrazowania sygnału wewnętrznego.
  2. Podłącz kamerę CCD do obrazowania sygnału wewnętrznego do standardowego portu C-mount na górze mikroskopu dwufotonowego (Rysunek 1). Umieść oświetlające źródło światła na stole powietrznym w pobliżu xy stage (Rysunek 1A). Umieść i zabezpiecz światłowody nad kraniotomią i płytą główną/komorą (Rysunek 1B). Cofnij główny dichroik i lustro poniżej portu C-mount, tak aby odbite czerwone światło potrzebne do sygnałów wewnętrznych przeszło bezpośrednio z kraniotomii do kamery CCD (rysunek 1C-D). Za pomocą obiektywu pneumatycznego 4x (0,13 NA, 17 mm WD) dostępne jest pole widzenia 2 x 2 mm do obrazowania sygnału wewnętrznego.
  3. Umieść filtr ciepła w ścieżce światła, aby zapobiec nagrzewaniu się kory. Użyj filtra, który przepuszcza zielone światło (546 nm w środku λ) i zapisz cyfrowy obraz referencyjny naczyń krwionośnych na powierzchni kory mózgowej.
  4. Przesuń ostrość z na 500 μm poniżej powierzchni kory mózgowej. Użyj czerwonego filtra (630 nm w środku λ), aby oświetlić korę mózgową do pomiaru sygnałów wewnętrznych. Umieść światłowody w taki sposób, aby powierzchnia kory mózgowej była równomiernie oświetlona. Osłoń kraniotomię przed światłem wytwarzanym przez bodźce wzrokowe. Przedstaw sekwencję bodźców wizualnych i zapisz obrazy danych odbicia. Aby w ciągu 10 minut wygenerować mapę orientacyjną, należy zebrać dane odpowiadające 4 powtórzeniom sekwencji 8 bodźców (4 orientacje i dwa kierunki dla każdej orientacji).
  5. Przeanalizuj dane sygnału wewnętrznego, aby wygenerować mapę orientacji w fałszywych kolorach. Wybierz potencjalne regiony docelowe do dwufotonowego znakowania neuronów, np. osobliwości wiatraczka orientacji - punkty na mapie, w których zbiegają się wszystkie preferowane orientacje (Rysunek 2A). Nałóż mapę orientacyjną i obraz unaczynienia powierzchni kory mózgowej (ryc. 2B-C). Użyj układu domen funkcjonalnych i lokalizacji dużych naczyń powierzchniowych, aby wybrać cel, unikając miejsc z dużymi naczyniami krwionośnymi i tętniczkami15.

3. Masowe ładowanie fluorescencyjnych wskaźników wapnia

  1. Przygotować roztwór 20% Pluronic/DMSO, dodając 1 g Pluronic w 5 μl DMSO. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić Pluronic. Pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 4 μl mieszaniny Pluronic/DMSO do 50 μg fiolki fluorescencyjnego wskaźnika wapnia Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Następnie dodać 1 μl czerwonego barwnika (Alexa Fluor 594, 2 mM roztwór podstawowy) i 35 μl roztworu pipet (patrz Materiały) do uzyskania końcowego stężenia 1 mM OGB-1 AM. Sonikować roztwór przez 1/2 godziny w łaźni wodnej ze schłodzonym stanem, a następnie odwirować z filtrem 0,45 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń.
  2. Wyciągnąć długą pipetę stożkową o zewnętrznej średnicy końcówki 2,0-2,5 μm. Załadować do niej 5 μl mieszaniny barwników.
  3. Usuń ostatnią warstwę opony twardej, aby ułatwić wprowadzenie pipety i uzyskać najwyższej jakości obrazy dwufotonowe.
  4. Określ dokładne miejsce na powierzchni kory mózgowej, w którym należy umieścić pipetę, aby dotrzeć do celu w warstwie korowej 2/3. Naszym z góry określonym celem korowym jest osobliwość wiatraczka na mapie orientacji (ryc. 2). Pipeta musi być wprowadzona do kory pod kątem 30°, aby przejść między ścianą komory a obiektywem. Tak więc, aby oznaczyć obszar docelowy znajdujący się 200 μm poniżej powierzchni kory mózgowej, pozycja wejściowa pipety na powierzchni kory będzie znajdować się około 350 μm w bok od pozycji docelowej (rysunek 3 A-B).
  5. Przesunąć stolik xy (na którym umieszczone jest zwierzę i mikromanipulator pipety), aby wyśrodkować pozycję wejścia powierzchni kory mózgowej pod obiektywem (Rysunek 3C). Użyj obiektywu 20x lub 40x z odległością roboczą (WD) co najmniej 3 mm (patrz Materiały), aby upewnić się, że pipeta łatwo dostanie się do kory mózgowej bez dotykania obiektywu lub kości wzdłuż ściany kraniotomii. Gdy pozycja wejściowa zostanie wyśrodkowana pod obiektywem, podnieś pozycję Z obiektywu o 2 mm (Rysunek 3D). Przy włączonym zielonym świetle epifluorescencyjnym w celu wizualizacji czerwonego barwnika Alexa w pipecie, użyj osi przekątnej mikromanipulatora, aby przesunąć pipetę, aż jej końcówka zostanie wyśrodkowana (i skupiona) pod obiektywem bezpośrednio nad pozycją wejścia na powierzchnię kory mózgowej (rysunek 3E).
  6. Opuść pipetę pionowo (wzdłuż osi z), aż dotrze do powierzchni kory mózgowej (Rysunek 3F), cały czas obserwując końcówkę pipety przez okulary mikroskopu. Dzięki oświetleniu jasnym polem naczynia krwionośne na powierzchni kory mózgowej i pozostałe błony oponowe (pia i pajęczynówka) są łatwo widoczne, gdy pipeta zbliża się do powierzchni kory. Jeśli pipeta nie osiągnie żądanej pozycji wejściowej, podnieś pipetę i ponownie skalibruj celowanie na podstawie punktów orientacyjnych naczyń krwionośnych na powierzchni kory mózgowej.
  7. Usuń obiektyw, odsuń nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego z kraniotomii i osusz sąsiednią kość za pomocą niestrzępiących się włóczni absorpcyjnych. Zastosuj kroplę ciepłej 3% agarozy (rozpuszczonej w ACSF), aby ustabilizować korę widoczną przez kraniotomię (ryc. 3G). U zwierząt niebędących gryzoniami 3% agaroza jest niezbędna do tłumienia pulsacji w celu pomyślnego wychwytu barwników fluorescencyjnych przez neurony. Do obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego potrzebne jest tylko 2% agarozy, ponieważ połączenie 2% agarozy i szkła nakrywkowego zapewnia niezbędną stabilność. W tym przypadku do etapu ładowania barwnika nie jest używane szkło nakrywkowe, więc konieczne jest 3% agarozy. Po zastygnięciu agarozy włóż obiektyw 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) i ponownie napełnij komorę ACSF.
  8. Przełącz się z patrzenia w jasnym polu na widok dwóch fotonów i znajdź końcówkę pipety. Używając osi ukośnej mikromanipulatora, przesuwaj pipetę, aż jej końcówka osiągnie żądaną głębokość w korze mózgowej (ryc. 3H). Sporadyczne zaciągnięcia mieszaniny barwników (kilka psi, każdy impuls 0,1 sekundy) pomogą zapobiec zatykaniu się końcówki pipety. Ponieważ OGB-1 AM staje się widoczny dopiero po wejściu do komórek, czerwony barwnik Alexa ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji końcówki pipety wewnątrz kory
    9. mózgowej.
  9. Przed próbą załadowania neuronów w warstwie korowej 2/3 pełną dawką barwnika, ponownie ustaw ostrość obiektyw na powierzchni kory mózgowej, aby potwierdzić głębokość końcówki pipety i upewnić się, że końcówka znajduje się w docelowym miejscu w oparciu o układ powierzchniowych naczyń krwionośnych. Jeśli pipeta znajduje się w warstwie 2/3, małe zaciągnięcia mieszaniny barwników powinny oświetlić przestrzeń zewnątrzkomórkową i ujawnić gęste zgromadzenie okrągłych ciał komórkowych jako ciemne cienie.
  10. Aby załadować ciała komórek nerwowych w kulę o średnicy kory 300-600 μm, wstrzyknij mieszaninę barwników do przestrzeni zewnątrzkomórkowej za pomocą 30-90 impulsów, każdy impuls 1,0 sek., 2-10 psi. Impulsy ciśnienia nie powinny być tak silne, aby tkanka się poruszała. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać kilka minut, a następnie wyjąć pipetę i obiektyw. Odczekaj 1 godzinę, aby OGB-1 AM został w pełni wchłonięty przez neurony.
  11. Usuń agarozę użytą do nałożenia barwnika i wypłucz komorę nagrywania. Nałóż małą kroplę 2-3% agarozy na powierzchnię i szybko umieść szkło nakrywkowe na kraniotomii. Ponieważ barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło, unikaj nadmiernego wystawiania kory na działanie jasnego pola lub światła epifluorescencyjnego. Włóż obiektyw o wysokim NA (1,0) 20x do uchwytu obiektywu i ponownie wyśrodkuj oznaczony obszar korowy pod obiektywem za pomocą stolika xy. Osłoń kraniotomię przed zewnętrznymi źródłami światła, np. wyświetlaniem bodźców wizualnych, używając wielu warstw materiału zaciemniającego.

4. Jednoogniwowa elektroporacja barwników fluorescencyjnych

  1. Do badania morfologii dendrytycznej należy przygotować roztwór 100 μM Alexa Fluor 594 (rozcieńczenie 1:20 w ACSF 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Do funkcjonalnego obrazowania dendrytów można użyć soli OGB16,17.
  2. Wyciągnąć długą pipetę stożkową z końcówką o rozmiarze 1 μm i wsypać do niej 5 μl barwnika. Wszystkie inne etapy kierowania na domenę funkcjonalną są identyczne z metodą ładowania zbiorczego (rysunki 1-3). Aby ustawić końcówkę pipety w pobliżu błony ciała komórki neuronalnej, monitoruj wzrost impedancji elektrody i zastosuj ciśnieniowe wciągnięcia barwnika, aby oświetlić przestrzeń zewnątrzkomórkową i zobaczyć ciała komórek jako cienie podczas obrazowania dwufotonowego.
  3. Gdy końcówka pipety przylega do błony ciała komórki neuronalnej, użyj Axoporator 800A, aby zastosować 1-3 impulsy (od -8 do -10 V, impuls 10 ms). Natychmiastowe wypełnienie neuronu barwnikiem można łatwo uwidocznić za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Wyjmij pipetę i zbierz obrazy dendrytów i aksonów w wysokiej rozdzielczości in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować precyzję naszych metod znakowania barwników, skupiliśmy się na najmniejszej mikrodomenie spośród wszystkich znanych map funkcjonalnych w korze nowej nienależącej do gryzoni. Słabo interpunkcyjne na całej mapie orientacji w pierwszorzędowej korze wzrokowej są osobliwości. Występują one w punktach, w których wszystkie preferowane orientacje zbiegają się tak, że na mapach o fałszywej kolorystyce preferowanej orientacji obszary wokół osobliwości wyglądają jak "wiatraczki" (Rysunek 2A-B). Do o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę celowania w znakowanie ciał komórek neuronalnych (lub dendrytów i aksonów) w określonych wcześniej funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Połączenie obrazowania optycznego sygnału wewnętrznego z mikroskopią dwufotonową daje możliwość określenia, które synapsy i komórki przyczyniają się do mikrodomeny dowolnej mapy funkcjonalnej, czy selektywność neuronalna koreluje z lokalizacją neuronu na mapie funkcjonalnej oraz jakie składniki obwodu neuronalnego zmieniają się wraz z doświadczeniem wzrokowym

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Eye Institute R01EY017925 i R21EY020985 oraz fundusze z Fundacji Dana & Whitehall dla P.K. Dziękujemy również Mateuszowi Petrelli za pomoc w zabiegach chirurgicznych; Grace Dion za śledzenie dendrytów pokazanych na rysunku 5A; oraz Pratikowi Chhatbarowi za komentarze do rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Przygotowanie do podtrzymywania życia/eksperymentu
IsofluraneWebster VetNDC 57319-474-05
Waporyzator izofluranowyMidmarkVIP 3000
Koc grzewczy regulowany sprzężeniem zwrotnymHarvard Apparatus50-7079F
Monitor EKGDigicare BiomedicalLifeWindow Lite
Wzmacniacz EEGA-M Systems1800
Monitor EEGHewlett Packard78304A
Monitor końca pływów CO2RespironicsNovametrix Capnoguard 1265Zoptymalizuj wentylację
Frezy z węglików spiekanych do wiercenia w kościHenry Scheindrobne (końcówka 0,5 mm) i grube (końcówka 1,25 mm)
Cement do płyty czołowej/komoryDentsply675571, 675572
farba temperowa proszkowaSargent Art Inc.22-7185Dodaj do cementu, aby poprawić osłonę światła i zmniejszyć odbicia
Agaroza - Typ III-ASigmaA9793Do minimalizacji pulsacji podczas obrazowania sygnału wewnętrznego i dwufotonowego
Szkło nakrywkowe: średnica 5 lub 8 mm, grubość 0,17 mmPrecision Instruments502040, 502041W celu zminimalizowania pulsacji podczas obrazowania, szkło nakrywcowe można przyciąć w razie potrzeby
Łyżeczki BrudonGeorge Tiemann105-715-0, 105-715-3Czyszczenie powierzchni czaszki
Wosk kostnyEthiconW31GSzybko zatrzymuje krwawienie
Aplikator z bawełnianą końcówkąMikroskopia elektronowaNauki 72308-05Czysta i sucha powierzchnia kości
Dumont #5CO KleszczeNarzędzia do nauki11295-20Chwyć pojedyncze warstwy opony twardej lub pia
Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki15000-03Cut
dura GelfoamPfizer09-0396-05Aby zatrzymać krwawienie na oponie twardej
Włócznie absorpcyjneFine Science Tools18105-01Ultraszybkie i niestrzępiące się odprowadzanie płynu słuchowego
Materiał zaciemniającyThorlabsBK5Kraniotomia tarczowa
2. Przygotowanie / wtrysk barwnika
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)SigmaD2650
PluronicSigmaP2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AMInvitrogenO6807Wskaźnik wapnia
Alexa Fluor 594InvitrogenA10438
Filtr odśrodkowy (0,45 μ m wielkość porów)MilliporeUFC30HV00Do usuwania zanieczyszczeń przed wstrzyknięciem
Ściągacz do pipetszklanych Sutter InstrumentsP97
Kapilara z włókna ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,5 mm)World Precision Instruments1B150F-4Pipeta do wyrzucania barwnika
Mikroładowarka Eppendorf5242 956 003Do ładowania barwnika do pipety
MikromanipulatorSutter InstrumentsMP-285Do pozycjonowania pipety
Regulator impulsów ciśnieniaParker HannifinPicoSpritzer IIIDo wtryskiwania barwnika pod ciśnieniem
Elektroporator jednoogniwowyUrządzenia molekularneAxoporator 800ADo elektroporacji barwnika
3. Obrazowanie wewnętrzne
4-krotny obiektyw (0,13 NA, 17 mm WD)OlympusUPLFLN4X
Wewnętrzny sprzęt / oprogramowanieOptical Imaging Inc.Imager 3001 / VDAQOprogramowanie VDAQ służy do obrazowania epizodycznego
Kamera CCDAdimecAdimec-1000
Źródło światła ZasilaczKEPCOATE 15-15M
Źródło światłaOptical Imaging Inc.HAL 100Natężenie światła na powierzchni kory wynosi 3-5 mW
Zielony filtr (do obrazu naczyniowego)Optical Imaging Inc.λ = 546 nm (pasmo przepustowe 30 nm)Dla obrazu referencyjnego unaczynienia powierzchniowego
Filtr czerwony (dla sygnału wewnętrznego)Optical Imaging Inc.λ = 630 nm (pasmo przepustowe 30 nm)Do zbierania sygnałów wewnętrznych
Filtr ciepłaOptical Imaging Inc.KG-1
4. Dwufotonowy aparat/obrazowanie
Mikroskop dwufotonowy i oprogramowaniePrairie TechnologiesZobacz Shen et al. 2012 dla ścieżki światła, filtrów i mocy lasera
Ti:Szafirowy laserSpectra-PhysicsMai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 mm WD)Obiektyw OlympusUMPLFLN20X0,5 NA służy tylko do ustawiania pipety nad kraniotomią (nie do obrazowania dwufotonowego)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)OlympusXLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)OlympusLUMPLFLN40X/IR
NewportST-200Izoluje przygotowanie od wibracji zewnętrznych
xy stageMike’ s Machine Co. (Attleboro, MA)Obiekt eksperymentalny i mikromanipulator Sutter umieszczony na xy stage
Recipes
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowyNaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Pipeta Solution14NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4
World Stół powietrzny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

Powiązane artykuły