Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Podsumowanie

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Streszczenie

Morfogeneza rozgałęzień zachodzi podczas rozwoju wielu organów, a embrionalny gruczoł podżuchwowy myszy (SMG) jest klasycznym modelem do badania rozgałęzionej morfogenezy. W rozwijającym się SMG proces ten obejmuje iteracyjne etapy tworzenia pąków i przewodów nabłonkowych, aby ostatecznie doprowadzić do powstania złożonej rozgałęzionej sieci acini i przewodów, które służą odpowiednio do produkcji i modyfikacji/transportu śliny do jamy ustnej^1-3. Błona podstawna związana z nabłonkiem i aspekty przedziału mezenchymalnego, w tym komórki mezenchymiczne, czynniki wzrostu i macierz zewnątrzkomórkowa, wytwarzane przez te komórki, mają kluczowe znaczenie dla mechanizmu rozgałęziania, chociaż sposób koordynowania zdarzeń komórkowych i molekularnych pozostaje słabo poznany ⁴. Badanie mechanizmów molekularnych kierujących morfogenezą nabłonka pogłębia naszą wiedzę na temat mechanizmów rozwojowych i dostarcza informacji na temat możliwych podejść medycyny regeneracyjnej. Takie badania były utrudnione ze względu na brak skutecznych metod genetycznej manipulacji nabłonka śliny. Obecnie transdukcja adenowirusowa stanowi najskuteczniejszą metodę celowania w komórki nabłonkowe w dorosłych gruczołach in vivo⁵. Jednak w eksplantatach embrionalnych gęsta mezenchyma i błona podstawna otaczająca komórki nabłonkowe utrudniają wirusowi dostęp do komórek nabłonkowych. Jeśli mezenchyma zostanie usunięta, nabłonek może zostać transfekowany za pomocą adenowirusów, a podstawy nabłonka mogą wznowić rozgałęzioną morfogenezę w obecności Matrigelu lub lamininy-111^6,7. Wzrost zaczątków nabłonka bez mezenchymów wymaga również dodatkowej suplementacji rozpuszczalnymi czynnikami wzrostu i nie podsumowuje w pełni morfogenezy rozgałęzień, ponieważ zachodzi ona w nienaruszonych gruczołach⁸. W tym miejscu opisano technikę, która ułatwia adenowirusową transdukcję komórek nabłonka i hodowlę transfekowanego nabłonka z towarzyszącą mezenchymą. Po mikrodysekcji embrionalnych SMG, usunięciu mezenchymy i wirusowym zakażeniu nabłonka adenowirusem zawierającym GFP, pokazujemy, że nabłonek spontanicznie rekombinuje z niezakażonym mezenchymem, rekapitulując nienaruszoną strukturę gruczołową SMG i rozgałęzioną morfogenezę. Genetycznie zmodyfikowaną populację komórek nabłonkowych można łatwo monitorować za pomocą standardowych metod mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli stosuje się fluorescencyjnie znakowane konstrukty adenowirusowe. Opisana tutaj metoda rekombinacji tkanek jest obecnie najskuteczniejszą i najbardziej dostępną metodą transfekcji komórek nabłonkowych z wektorem typu dzikiego lub zmutowanego w złożonym konstrukcie tkankowym 3D, który nie wymaga generowania zwierząt transgenicznych.

Protokół

Protokół zawiera cztery główne kroki, jak pokazano na rysunku 1. Wszystkie kroki są szczegółowo opisane. Budowa adenowirusa i oczyszczanie wirusa powinny być przeprowadzone przed pobraniem narządów w celu zastosowania w transdukcji genetycznej wypreparowanych zaczątków nabłonka. Podczas pracy z adenowirusami należy przestrzegać wszystkich standardowych środków ostrożności BSL-2.

1. Pobieranie i mikrodysekcja embrionalnego gruczołu podżuchwowego myszy (SMG)

1. Eutanazja samic myszy w ciąży w czasie (szczep niekrewniaczy CD-1 lub ICR) przy użyciu narkozy CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobranie ciągów zarodków myszy w 13 dniu embrionalnym (E13, 3-5 pąków nabłonkowych) zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet IACUC. Dzień odkrycia czopa dopochwowego jest oznaczony jako E0. Gruczoły ślinowe można również zbierać i hodować na etapie E12, kiedy występuje pojedynczy pierwotny pączek i łodyga, a szczeliny dopiero zaczynają się inicjować. Pistolety maszynowe przed tym etapem wymagają innych warunków hodowli niż te wskazane tutaj.
2. Przenieś łańcuchy zarodków do sterylnych 10 cm naczyń do hodowli tkankowych wypełnionych 25 ml pożywki DMEM/Ham's F12 Medium (F12) bez czerwieni fenolowej (Life Technologies) i uzupełnione 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pen-strep, Life Technologies).
3. Za pomocą sterylnego skalpela (#11 ostrzy) i kleszczy (#5, Fine Science Tools, 11252-20) usuń zarodki z worków do osobnego 10-centymetrowego naczynia zawierającego 25 ml DMEM/F12 + paciorkowce.
4. Odetnij główki zarodków z ukośnym nacięciem tuż pod dolną szczęką.
5. Odizoluj dolne żuchwy od głów pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym z podstawą światła przechodzącego (Nikon SMZ645 lub odpowiednik), używając nacięcia poniżej górnej szczęki. Umieść chusteczki na dodatkowym kawałku szkła, a nie bezpośrednio na szklanym elemencie podstawy mikroskopu.
6. Zebrać dolne żuchwy do 3 ml DMEM/F12 + pen-strep w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
7. Umieść plasterek żuchwy na stoliku mikroskopu preparacyjnego tak, aby język znajdował się na dole plastra, ale był skierowany w stronę godziny 12:00.
8. Używając jednej strony dwóch skrzyżowanych kleszczy ruchem nożycowym, usuń i wyrzuć dolną 1/3 plasterka żuchwy.
9. Obróć plasterek o 90 ° w prawo (jeśli jesteś praworęczny) i za pomocą nożyc naciętych kleszczami odetnij górną część plastra żuchwy (bez przecinania języka) do połowy w plastrze.
10. Oderwij nadmiar tkanki i usuń ją, aby odsłonić pistolety maszynowe znajdujące się pod spodem. Będzie po jednym z każdej strony w pobliżu podstawy języka.
11. Używając jednej pary kleszczy do przytrzymania tkanki za język, użyj drugich kleszczy, aby odciągnąć pistolet maszynowy od języka. Powtórz dla drugiego gruczołu.
12. Zebrać mikrowypreparowane gruczoły ślinowe do 3 ml DMEM/F12 + pen-strep do nowego sterylnego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Uwaga: większe gruczoły podżuchwowe (3-5 pąków nabłonkowych) wraz z połączonym mniejszym gruczołem podjęzykowym (1 pączek) można hodować w stanie nienaruszonym, przeskakując do kroku 4 i wykonując kroki 4.1, 4.3 i 4.4, jak opisano wcześniej ^2,8.

2. Separacja podstaw nabłonka SMG

1. Umieść 5 (lub więcej) gruczołów ślinowych w szklanym naczyniu mikrostudzienkowym o średnicy 50 mm (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) zawierającym 200 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS bez Ca^{++lub Mg++,} Life Technologies) zawierającego 0,4% (v/v) dypazy (Life Technologies, nr kat. 17105-041) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
2. Po inkubacji, za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl, ostrożnie odessać roztwór dypazy, nie naruszając pracy gruczołów. Natychmiast dodać 200 μl pożywki DMEM/F12 zawierającej 5% (w/v) BSA (DMEM/F12-BSA, wstępnie wysterylizowane filtrem 0,22 μm) w celu zneutralizowania dypazy.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym, używając kleszczy z cienkimi końcówkami (#5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), delikatnie oddziel rozluźnioną mezenchymę od okolic pąków i przewodów nabłonkowych SMG, uważając, aby nabłonek pozostał nienaruszony.
4. Wstępnie zwilżyć sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl pożywką DMEM/F12-BSA i delikatnie odpipetować zaczątki nabłonka do nowego naczynia mikrostudzienkowego o średnicy 50 mm zawierającego 200 μl DMEM/F12 + paciorkowcowiec. Używaj wysokiej jakości końcówki do pipet o pojemności 200 μl z gładką krawędzią.
5. W naczyniu zawierającym kawałki mezenchymy wyrzuć wszelkie tkanki niemezenchymalne, w tym gruczoły podjęzykowe i wszelkie oderwane pąki gruczołów podżuchwowych.

3. Adenowirusowe zakażenie podstaw nabłonka

1. Przygotować 200 μl pożywki do infekcji wirusowych, rozcieńczając adenowirusa będącego przedmiotem zainteresowania w DMEM/F12 + pen-strep w probówce do mikrowirówki, tak aby miano otrzymanego roztworu wynosiło 1x10^{8-10 9} PFUs. Optymalna wartość miana wymagana dla różnych wirusów może się różnić. Ważne jest, aby stosować preparaty wirusowe oczyszczone chlorkiem cezu (CsCl) w celu uzyskania optymalnej wydajności wchłaniania.
2. Usuń pożywkę z naczynia zawierającego pięć podstaw nabłonka. Szybko dodaj 200 μl pożywki infekcyjnej, utrzymując podstawy w stanie mokrym przez cały czas. Należy podjąć niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z wirusem i wyrzucania zanieczyszczonych końcówek pipet. Zdezynfekuj wszelkie powierzchnie skażone wirusami za pomocą 10% roztworu wybielacza.
3. Odsuń podstawy nabłonka daleko od siebie za pomocą kleszczy, aby zapobiec ich sklejaniu się i pozwolić im osiąść na dnie płytki. Inkubuj rudymenty w pożywce wirusowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji oddziel podstawy, jeśli poruszają się blisko siebie. Nadmierne kołysanie lub ruch pozwoli gruczołom się zbrylić.
4. Po inkubacji delikatnie usuń pożywkę zawierającą wirusa i odpowiednio wyrzuć, uważając, aby nie naruszyć podstaw. Dodać 200 μl DMEM/F12 + pen-strep. Powtórz to płukanie jeszcze co najmniej dwa razy i zastąp 200 μl pożywki DMEM/F12 + pen-strep. Te płukanie ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wirusa, który nie jest silnie przyczepiony do nabłonka i zapobieżenia infekcji mezenchymy.
5. Inkubować podstawy nabłonka z 200 ml DMEM/F12 zawierającego 2% (v/v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) przez 20 minut. Stwierdzamy, że ta krótka inkubacja w Matrigel minimalizuje regresję istniejących szczelin w początkowym okresie hodowli, ale z tego kroku można zrezygnować, jeśli ekspozycja na Matrigel nie jest pożądana.

4. Kultura ex vivo rekombinowanych pistoletów maszynowych

1. Umieść każdy zaczątek, pojedynczo, za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki pipety o pojemności 200 μl, na karbowanym (małym nacięciu) filtrze membranowym Nuclepore Track-Etch o średnicy 13 mm i 0,1 μm (Whatman) unoszącym się na 200 μl pożywki hodowlanej (5 rudymentów / filtr) w płytce mikrodołkowej ze szklanym dnem. Pożywką hodowlaną są: DMEM/F12 + pen-strep zawierający 50 μg/ml transferyny i 150 μg/ml kwasu askorbinowego, jak opisano wcześniej^2,8. Wiadomo, że transferyna stymuluje przeżycie i rozgałęziającą się morfogenezę gruczołów ślinowych i innych eksplantatów narządowych⁹. Wykazano, że dodatek kwasu askorbinowego stymuluje rozgałęzianie się SMG. ¹⁰ Wiadomo, że działa jako kofaktor w wielu reakcjach hydroksylacji szlaków metabolicznych (takich jak hydroksylacja proliny podczas tworzenia włókien kolagenowych¹¹), a także stymuluje produkcję fibronektyny i lamininy w eksplantatach innych narządów¹².
2. Usuń jak najwięcej mediów z filtra po dodaniu każdego podstawowego nabłonka. Zbyt duża ilość mediów na górze filtra może spowodować zatonięcie filtra, podczas gdy mniejsza ilość mediów znacznie ułatwia umieszczanie rudymentów i mezenchymy. Nadmiar podłoża można usunąć za pomocą końcówki do pipet lub za pomocą kleszczy do chwytania podłoża między końcówkami.
3. Umieść kawałki mezenchymy pochodzące z trzech do czterech gruczołów na górze i/lub wokół każdego podstawowego nabłonka. Usuń wszelkie dodatkowe podłoża otaczające gruczoły, aby uniknąć przemieszczania się mezenchymy z dala od podstaw. Mezenchyma pochodząca z większej liczby gruczołów nie jest korzystna, ale mniejsza może być szkodliwa dla wzrostu podstaw nabłonka.
4. Inkubować rekombinowane pistolety maszynowe w wilgotnym inkubatorze (95% powietrza/5% CO₂) w temperaturze 37 °C przez 48 -72 godzin, zgodnie z życzeniem.
5. Uzyskaj obrazy jasnego pola i/lub fluorescencyjne żywych gruczołów po 0 godzinach (w razie potrzeby), 2 godziny po rekombinacji, a następnie co 24 godziny na odwróconym, pionowym lub stereoskopowym mikroskopie świetlnym wyposażonym w kamerę cyfrową przy użyciu obiektywu o powiększeniu 4X lub 5X, aby uchwycić cały zrekombinowany gruczoł w jednej klatce widzenia. Obrazy gruczołu ślinowego wykazują najlepszy kontrast przy użyciu ustawienia jasnego pola lub odpowiedniego pierścienia fazowego umieszczonego w połowie ścieżki światła (co nie jest możliwe w pełni zautomatyzowanych mikroskopach). Standardowy kontrast fazowy nie jest konieczny, ponieważ gruczoł jest gruby i tworzy kontrast.
6. W pożądanych punktach czasowych rekombinowane SMG można utrwalać przez 20 minut roztworem utrwalającym wykonanym z 2% paraformaldehydu (PFA) w 1X PBS zawierającym 5% (w/v) sacharozy (w celu lepszego zachowania wewnętrznej struktury komórkowej poprzez utrzymanie komórek w stanie izosmotycznym). W przeciwieństwie do 4% PFA, 2% PFA zachowa znaczną ilość sygnału GFP, jeśli utrwalacz zostanie całkowicie usunięty po utrwaleniu. Gruczoły mogą być przechowywane przez okres do 1 tygodnia w 1X PBS w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu wykonania całej immunocytochemii i obrazowania konfokalnego, jak opisano wcześniej^3,6,13-15. Idealnie byłoby, gdyby immunocytochemia i obrazowanie były wykonywane wkrótce po utrwaleniu, aby uzyskać obrazy o najlepszej jakości. Gruczoły mogą być również poddawane lizie w buforze RIPA dla SDS-PAGE, a następnie analizie Western blot.

Wyniki

Przebieg głównych etapów eksperymentalnych przedstawiono na Rysunku 1. Przykład nienaruszonego SMG, wyizolowanego zalążka nabłonkowego oraz odpowiadającego mu mezenchymu pokazano na Rysunku 2. Obrazy w jasnym polu zrekonstruowanych SMG, które kontynuują morfogenezę rozgałęzioną podczas hodowli ex vivo przez wskazany czas, przedstawiono na Rysunku 3. Zrekonstruowane gruczoły hodowane przez 48 h, wykazujące ekspresję GFP w nabłonku, pokazano na Rysunku 4. ...

Dyskusja

Technika rekombinacji nabłonkowo-mezenchymalnej ex vivo została po raz pierwszy opublikowana dla podżuchwowych gruczołów ślinowych w 1981 roku,¹⁶. W tym protokole rozszerzamy oryginalną metodę, wykorzystując infekcję adenowirusową do manipulowania ekspresją genów komórek nabłonkowych w kontekście zrekombinowanego gruczołu. Pokazujemy, że pewien procent komórek nabłonka jest zakażony adenowirusem, podczas gdy odsetek zakażonych komórek zależy od właściwości promotora wirusa, miana wirusa i czystości w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/Ham's F12 Medium bez czerwieni fenolowej	Life Technologies	21041-025
Penicylina i Streptomycyna	Life Technologies	15070-163	10X zapas
Dispase	Life Technologies	17105-041	Zamrażanie jednorazowych podwielokrotności w temperaturze -20C
BSA		Sigma A2934-100G	Frakcja V, niska endotoksyna
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Powinien mieć wysokie miano (1x1010 pfu/ml). Wirusy oczyszczone CsCl są w tym teście bardziej skuteczne niż wirusy oczyszczone kolumnowo.
16% Paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710	Rozcieńczony do 2% w PBS z 5% sacharozą (w/v)
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Life Technologies	70011-044	Przygotowany z 10X
zapasów Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	bez wapnia, bez magnezu, bez fenolu Czerwona
transferyna	Sigma	T8158	25 mg/ml roztworu podstawowego w pożywce DMEM/F12. Zamrażać jednorazowe podwielokrotności w temperaturze -20C
kwasu L-askorbinowego (witamina C)	Sigma	A4403	75 mg/ml roztworu podstawowego w pożywce DMEM/F12. Zamroź jednorazowe podwielokrotności w temperaturze -20C
Tabela 1. Lista odczynników wymaganych do protokołu rekombinacji SMG.
sterylnych naczyń plastikowych o średnicy 10 cm	Corning	430167	również użyć płytek niepoddanych hodowli tkankowej.
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny z podstawą światła przechodzącego	Nikon	SMZ645	Można użyć dowolnego stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, który ma podstawę światła przechodzącego.
płytki do hodowli tkankowych 35 mm	Falcon	353001	Płytki niepoddane hodowli tkankowej.
Talerze mikrodołkowe o średnicy 50 mm	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Filtry membranowe Nuclepore Track-Etch	Whatman	110405	Średnica 13 mm, wielkość porów 0,1 mm
Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Każdy mikroskop fluorescencyjny (pionowy, odwrócony lub stereoskopowy) może być używany do monitorowania ekspresji GFP przy małym powiększeniu za pomocą dołączonego aparat cyfrowy.
Mikroskop konfokalny	Leica Microsystems	TCS SP5	Mikroskopia konfokalna jest niezbędna, aby zobaczyć szczegółowe struktury komórkowe. Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego.
Samice myszy w ciąży w czasie, szczep CD-1 lub ICR	Charles River Labs		Embryos są zbierane w dniu 13 (z dniem wykrycia czopa wyznaczonym jako dzień 0).
Ostrze skalpela #11	Fine Science Tools	10011-00
Rękojeść skalpela #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 Kleszcze ze stopu inox, 0,05 mm x 0,02 mm	Narzędzia do nauki o nasadzach	11252-20	Idealny do pobierania gruczołów z zarodków
Dumont #5 Kleszcze Dumostar ze stopu dumostar, 0,05 mm x 0,01 mm	Narzędzia do nauki	11295-20	Do usunięcia mezenchymy z nabłonka potrzebne są cienkie końcówki. Można również użyć igieł wolframowych.
Tabela 2. Sprzęt używany w protokole rekombinacji SMG.

Można również użyć Można Można również stosować precyzyjnej