Generacja ortotopowego mysiego modelu anaplastycznego raka tarczycy jest opisana tutaj. Technika ta polega na chirurgicznym umieszczaniu ludzkich komórek anaplastycznego raka tarczycy w tarczycy myszy z niedoborem odporności, tworząc w ten sposób bardziej istotne klinicznie warunki do badania postępu choroby, a także do badań przesiewowych innowacyjnych interwencji terapeutycznych.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy mysi model anaplastycznego raka tarczycy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli ludzkich nowotworów tarczycy, w tym ksenoprzeszczep podskórny i ortotopowe wszczepianie komórek rakowych myszom z niedoborem odporności. Podskórne modele ksenoprzeszczepów okazały się cenne dla przedklinicznych badań przesiewowych i oceny nowych metod leczenia. Korzystanie z modelu podskórnego ma wiele zalet; 1) szybkie, 2) powtarzalne i 3) powstawanie guza, wzrost i odpowiedź na środki terapeutyczne mogą być monitorowane za pomocą oględzin. Jednak istotne dowody rzuciły światło na wady modeli ksenoprzeszczepów podskórnych1-3. Na przykład terapie medyczne wykazujące właściwości lecznicze w podskórnych modelach ksenoprzeszczepów często nie mają znaczącego wpływu na chorobę u ludzi. U podstaw tej odmienności leży mikrośrodowisko miejsca przeszczepu lub iniekcji ksenograficznej.
Modele ksenoprzeszczepów ortotopowych guzów dostarczają bardziej biologicznie istotnego kontekstu, w którym można badać chorobę. Korzyści płynące z wszczepienia chorych komórek lub tkanek do ich anatomicznego odpowiednika u zwierzęcia gospodarza obejmują odpowiednie miejsce do interakcji guz-gospodarz, rozwój przerzutów związanych z chorobą oraz możliwość zbadania specyficznego dla miejsca wpływu na badane środki terapeutyczne. Dlatego ortotopowe modele ksenoprzeszczepów mają znacznie większą wartość kliniczną, ponieważ ściśle odtwarzają ludzką chorobę. Z tych powodów wiele grup wykorzystało ortotopowy model raka tarczycy jako narzędzie badawcze4-7.
Tutaj opisujemy podejście, które ustanawia model ortotopowy do badania anaplastycznego raka tarczycy (ATC), który jest wysoce inwazyjny, opiera się leczeniu i jest praktycznie śmiertelny u wszystkich zdiagnozowanych pacjentów. Hodowane komórki ATC są przygotowywane jako zdysocjowana zawiesina komórkowa w roztworze zawierającym macierz błony podstawnej. Niewielka objętość jest powoli wstrzykiwana do prawej tarczycy. Ogólny wygląd i stan zdrowia myszy są monitorowane w celu zapewnienia minimalnych powikłań pooperacyjnych i oceny patologicznej penetracji nowotworu. Myszy uśmierca się po 4 tygodniach, a tkankę pobiera się do analizy histologicznej. Zwierzęta mogą być pobierane w późniejszych terminach w celu zbadania bardziej zaawansowanego postępu choroby. Produkcja tego ortotopowego modelu myszy tworzy platformę, która spełnia dwa cele: 1) pogłębienie naszej wiedzy na temat patologii ATC oraz 2) przebadanie obecnych i przyszłych środków terapeutycznych pod kątem skuteczności w zwalczaniu ATC.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
Uwagi: 1) kompletna receptura pożywki hodowlanej na bazie RPMI 1640 (500 ml) zawiera 435 ml RPMI 1640, 50 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml pirogronianu sodu, 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego; 2) umieścić matrigel w temperaturze 4 °C na jeden dzień przed pobraniem komórek.
- Ludzka linia komórkowa ATC THJ-11T8 jest hodowana na 6-dołkowych płytkach hodowlanych i zbierana raz w 80-90% zlewa.
- Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 [płytka 2 ml/6 dołków].
- Weź niewielką objętość zawiesiny komórek, dodaj ją do jednej objętości 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego i określ gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek TC10.
- Oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do uzyskania 5 x 105 komórek/myszy razy liczba wstrzykniętych myszy.
Uwaga: Aby zapewnić odpowiednią zawiesinę komórek do wstrzyknięcia, przygotuj komórki tak, jakbyś wstrzykiwał podwójną liczbę myszy (np. jeśli wstrzykujesz 5 myszy, a następnie przygotuj zawiesinę komórek tak, jakbyś wstrzykiwał 10 myszy).
- Przenieść potrzebną objętość zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Zasysanie pożywki i ponowne zawieszanie komórek w kompletnych nośnikach RPMI 1640.
- Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,6 ml, dodać 1 objętość matrigelu i delikatnie wymieszać, powoli pipetując do wewnątrz i na zewnątrz.
Uwaga: Każda mysz otrzyma 10 μl zawiesiny komórkowej/koktajlu matrygelowego. Ponieważ komórki 5 x 105 zawieszone w objętości iniekcyjnej 10 μl były z powodzeniem stosowane w poprzednich badaniach ortotopowych ATC9-10, użyliśmy tych parametrów w niniejszym raporcie.
- Umieść zawiesinę komórek na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.
2. Przygotowanie myszy
- Oczyść strefę operacyjną, która obejmuje lunetę sekcyjną i okolicę, przecierając wszystkie powierzchnie 70% etanolem.
- Włącz lampy/podkładki grzewcze, w których zwierzęta będą wracać do zdrowia po operacji.
- Podawać 0,1 ml ketaminy/ksylazyny (koktajl lekowy składający się z ketaminy 9 mg/ml i ksylazyny 1 mg/ml) na 10 g masy ciała dootrzewnowo za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml 27 g 1/2".
- Przygotuj mysz do operacji: 1) ogol obszar szyi myszy (od linii żuchwy do górnej części mostka i na zewnątrz), 2) trzykrotnie wyszoruj obszar chirurgiczny kwadratami gazy nasączonej chorheksadyną, 3) końcowy peeling wykonany gazą nasączoną betadyną, 4) delikatnie nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
- Sprawdź odruch pedału, aby upewnić się, że mysz jest odpowiednio uspokojona.
- Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na jednorazowej sterylnej barierze polowej pod lunetą sekcyjną i zabezpiecz zwierzę na miejscu taśmą z tkaniny.
- Szoruj dłonie i paznokcie, a następnie zakładaj sterylne rękawiczki chirurgiczne.
- W sterylny sposób otwórz opakowanie chirurgiczne i ułóż instrumenty.
- Umieść sterylną serwetę na zwierzęciu, pozostawiając odsłonięte tylko pole operacyjne.
3. Chirurgiczny dostęp do iniekcji tarczycy i komórek
- Za pomocą sterylnego, jednorazowego skalpela wykonaj podłużne nacięcie o długości od 1 do 1,5 cm wzdłuż linii środkowej gardła.
Uwaga: Odchylenie od linii środkowej komplikuje głębsze cięcie w celu uzyskania dostępu do tchawicy. Dość precyzyjne nacięcie linii środkowej pozwala na drażnienie i przecinanie tkanki błoniastej utrzymującej razem lewy i prawy gruczoł ślinowy oraz zmniejsza ryzyko nacięcia lub przecięcia dużych tętnic.
- Wykonaj drugie nacięcie w mięśniach paska otaczających tchawicę, a następnie pociągnij prawą stronę naciętego mięśnia w bok, aby odsłonić prawą tarczycę.
- Hemostatyki mogą być używane w tym momencie, aby utrzymać warstwę mięśniową w celu łatwego dostępu do tarczycy (ryc. 1).
Uwaga: Alternatywnie, jeśli zabieg jest wykonywany przez dwóch pracowników chirurgicznych, warstwa mięśniowa może być po prostu przytrzymywana kleszczami, podczas gdy gotowy zastrzyk strzykawki jest podawany chirurgowi przez personel asystujący.
- Powoli wstrzyknąć 10 μl zawiesiny komórkowej do prawej tarczycy za pomocą strzykawki insulinowej 31G 5/16", a następnie delikatnie usunąć igłę.
4. Zamknięcie miejsca operacji i rekonwalescencja myszy
- Zszyj warstwę mięśniową materiałem szwalniczym 6.0 przy użyciu ciągłego lub przerywanego stylu szycia.
- Zszyj skórę w ten sam sposób.
- Nałóż warstwę potrójnej maści z antybiotykiem bezpośrednio na miejsce nacięcia.
- Pozwól zwierzęciu dojść do siebie w pozycji leżącej grzbietowej na ciepłej poduszce grzewczej. Gdy zwierzę osiągnie leżący mostek bez pomocy, można je umieścić z powrotem z innymi myszami.
5. Monitorowanie pooperacyjne i pobieranie tkanek
- Sprawdzaj miejsce nacięcia i ogólny stan zdrowia zwierzęcia codziennie przez tydzień po operacji, a następnie sprawdzaj raz w tygodniu. Jeśli szwy są nadal nienaruszone po 14 dniach, są usuwane.
Uwaga: Zwierzęta wykazujące oznaki pogarszającego się stanu zdrowia (np. znaczna utrata wagi, niechlujna sierść, trudności w oddychaniu) powinny zostać poddane eutanazji i pobrane tkanki.
- Gdy myszy osiągną z góry określony pooperacyjny punkt czasowy, podaj ketaminę/ksylazynę, jak opisano powyżej, aby uspokoić.
- Perfuzję zwierzęcia dosercowo i pobranie tarczycy/tchawicy oraz innych tkanek będących przedmiotem zainteresowania (nie opisanych szczegółowo tutaj).
Wyniki
Po 4 tygodniach wykryto 19 inwazyjnych guzów tarczycy u łącznie 20 myszy, którym wstrzyknięto komórki ATC. Na przykładzie przedstawionym na Rysunku 2A, u myszy, które otrzymały ortotopowy wstrzyknięcie 5X105 komórek ATC hodowanych w warunkach adherentnych, stwierdzono znaczną infiltrację komórek nowotworowych do tarczycy w 4 tygodniu po iniekcji. Charakter inwazyjnych komórek ATC, wykazujących typową wrzecionowatą budowę oraz obecność komórek o średniej i ogromnej wielkości z eozynofilną cytoplazmą i dużymi jądrami, został potwierdzony barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E). Dla porównania, na Rysunku 2B przedstawiono tarczycę i tchawicę zwierzęcia kontrolnego, któremu nie podano wstrzyknięcia. Pęcherzyki tarczycy u nieiniekcyjnego zwierzęcia wykazują ścisłe, choć luźne powiązanie i mają w zasadzie okrągłą morfologię.
Ze względu na niewielki rozmiar tarczycy oraz zastosowanie podania drogą wstrzyknięcia, mogą wystąpić niezamierzone skutki. Rycina 3A przedstawia najczęściej obserwowany przypadek, jakim jest rozwój masy guzowej poza tarczycą, lecz nie obejmującej jej. Jest to najprawdopodobniej spowodowane penetracją igły przez tarczycę i poza nią w momencie wypychania komórek. Okazyjnie wykrywane są myszy bez wzrostu guza, zarówno w badaniu makroskopowym, jak i histologicznym, co pokazano na Rycynie 3B. Brak wykrywalnego rozwoju guza może być spowodowany wypłynięciem zawiesiny komórkowej z miejsca wstrzyknięcia i jej rozprzestrzenieniem do sąsiednich tkanek i jam ciała.
Rycina 1. Odsłanianie tarczycy. Etykiety wskazują prawy i lewy płat tarczycy flankujące tchawicę.
Rysunek 2. Badanie histologiczne wzrostu i naciekania guza po pomyślnym wstrzyknięciu do tarczycy. Próbki tkanek pocięto w płaszczyźnie wieńcowej. A) Zdjęcie wykonane przy powiększeniu 200X, przedstawiające mysz z istotnym wzrostem guza z charakterystycznymi komórkami wrzecionowatymi oraz komórkami o rozmiarze od średniego do olbrzymiego z eozynofilną cytoplazmą i dużymi jądrami w barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E)&E) barwienie. Tu wskazuje na pierwotną zmianę, z której komórki nowotworowe naciekają tarczycę. B) Tchawica i tarczyca zwierzęcia kontrolnego (obraz wykonany przy 100-krotnym powiększeniu). Guzy, Nowotwory; Smięśnie gładkie; Tr, tchawica; Thy, tarczyca.
Rycina 3. Niezamierzone skutki wstrzykiwania ortotopowego. Próbki tkanek przekrojono w płaszczyźnie czołowej. A) Obwodowy wzrost guza przy braku widocznego wzrostu w tarczycy (czarna strzałka, obraz wykonany przy powiększeniu 100X). B) Brak wykrycia guza podczas badania makroskopowego (nie pokazano) lub histologicznego (obraz wykonany przy powiększeniu 50X). Thy, gruczoł tarczycy.
Dyskusja
W naszym modelu zwierzęta wykazywały przerzuty do guza tarczycy i związaną z chorobą kacheksję i niewydolność oddechową do 4 tygodni po wstrzyknięciu. Podobnie jak w przypadku większości innych modeli ortotopowych wykorzystujących wstrzykiwanie zawiesiny komórek, możliwe jest wstrzyknięcie do otaczających tkanek i wyciek po wstrzyknięciu, który rozprzestrzenia się poza cel. Mając to na uwadze, jedną z rozpoznawalnych potencjalnych niewiadomych spowodowanych tą procedurą jest efekt ekspozycji poza celem na przerzuty lub powikłania niezwiązane z chorobą. Jest to ogólny problem w przypadku większości przeszczepów ksenograficznych, niezależnie od badanej choroby. Niemniej jednak niezamierzone konsekwencje przerzutów można znacznie zminimalizować, upewniając się, że cały skos końcówki igły wniknął w błonę, ściśle pokrywając tarczycę i powoli wydalając zawiesinę komórkową. W przypadku zaobserwowania wycieku w trakcie lub po wstrzyknięciu, zwierzęta te mogą zostać pominięte w badaniu.
Istotne jest, aby zwierzęta były poddawane perfuzji przed pobraniem tarczycy/tchawicy i innych tkanek. Korzyści są dwojakie: 1) czerwone krwinki są oczyszczane i nie zaśmiecają próbek histologicznych oraz 2) morfologia i integralność tkanek są zachowane. Ponadto wycięta tarczyca/tchawica, która ma przyczepioną masę nowotworową lub jest w niej zanurzona, powinna zostać przecięta w taki sposób, aby można było zidentyfikować anatomiczne punkty orientacyjne przed osadzeniem w celu przygotowania histologicznego. To znacznie skróci czas przygotowania próbki.
W niniejszym raporcie opisano miejscowy wzrost i inwazję zaawansowanego guza tarczycy po ortotopowym wstrzyknięciu komórek ATC. Przerzuty ATC można badać, analizując preparaty histologiczne innych tkanek przy użyciu standardowych barwników histologicznych, takich jak hematoksylina i eozyna, lub przez immunohistochemię z wykorzystaniem markerów istotnych dla komórek lub patologii. System ten może być dalej rozwijany poprzez genetyczną modyfikację komórek raka tarczycy za pomocą reporterów fluorescencyjnych, tak aby obrazowanie na żywo mogło być wykorzystywane do monitorowania przerzutów i skuteczności leczenia terapeutycznego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować doktorom Wenjun Li i Danielowi Kreiselowi (Washington University School of Medicine w St. Louis) za pomoc w szkoleniu chirurgicznym. R.Y.L. jest wspierany przez National Institutes of Health Grant R01 DK068057 oraz President's Research Fund of Saint Louis University.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka do hodowli komórkowych RPMI 1640 | Mediatech | 10-041-CV | Stosowane podłoża i dodatki zależą od linii komórkowej |
| TC10 Automatyczny licznik komórek | Bio-Rad | 145-0001 | |
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company | 354234 | |
| Graefe Kleszcze, ząbkowane; Lekka krzywa, 4" | Roboz | RS-5135 | |
| Jednorazowy skalpel, nr 15 | Feather | 2975#15 | |
| Uchwyt na igłę Olsen Hegar - 4 ½ " delikatny ząbkowany | gSource | gS 21.5400 | |
| 6-0 nylonowy szew monofilamentowy | Surgical Specialties Corporation | 1279B | |
| Poduszka grzewcza, wielokrotnego użytku, 8 "x 12" | |||
| Taśma tkaninowa, 1 "X 10 jardów | Medline | MIINON260101 | Do krępowania znieczulonej myszy |
| Maszynka do strzyżenia/trymer do orzechów ziemnych | Wahl | 8655 | Do usuwania owłosienia z miejsca operowanego |
| ChlorHex-Q SCRUB 2% | Penn Veterinary Supply | VED1222 | |
| Betadine | Henry Schein Company | 6906727 | |
| Wazelina maść oftalmiczna | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 2 x 2 gaza, 12-warstwowa | Butler Animal Health Supply | 6936 | |
| Sterylne pole, bariera, 18" x 26" | Busse | 696 | |
| Zasłony (CSR Wrap) | Cardinal Health | AT 21 412 | |
| 27G ½ " igła | Becton, Dickinson and Company | 309623 | |
| igła 31G 5/16" | Becton, Dickinson and Company | 328438 | |
| Ketamina (9 mg/ml) / ksylazyna (1 mg/ml) roztwór | |||
| Maść z potrójnym antybiotykiem |
Bibliografia
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).
- Kim, S., et al. An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice. Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).
- Todaro, M., et al. Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells. Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).
- Tran Cao, H. S., et al. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).
- Marlow, L. A., et al. Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).
- Nehs, M. A., et al. Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer. Endocrinology. 153, 985-994 (2012).
- Nucera, C., et al. Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer. Oncologist. 16, 296-309 (2011).
Przedruki i uprawnienia
