Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Kelly Gutpell; Rebecca McGirr; Lisa Hoffman

doi:10.3791/50119

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50119

⸱

27 marca 2013

Kelly Gutpell¹^,² , Rebecca McGirr¹ , Lisa Hoffman¹^,²^,³

¹Imaging Program, Lawson Health Research Institute, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Western University, ³Department of Medical Biophysics, Western University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężką genetyczną chorobą nerwowo-mięśniową, która dotyka 1 na 3 500 chłopców i charakteryzuje się postępującym zwyrodnieniem mięśni^{1, 2}. U pacjentów zdolność rezydentnych komórek satelitarnych mięśni (SC) do regeneracji uszkodzonych włókien mięśniowych staje się coraz mniej efektywna⁴. Dlatego przeszczep komórek progenitorowych mięśni (MPC)/mioblastów od zdrowych osób jest obiecującym podejściem terapeutycznym do DMD. Głównym ograniczeniem w stosowaniu terapii komórkami macierzystymi jest jednak brak wiarygodnych technologii obrazowania do długoterminowego monitorowania wszczepionych komórek i oceny jej skuteczności. W tym miejscu opisujemy nieinwazyjne podejście w czasie rzeczywistym do oceny powodzenia przeszczepu mioblastów. Metoda ta wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów (lucyferazy świetlika [fluc], monomerycznego białka czerwonej fluorescencji [MRFP] i kinazy tymidynowej sr39 [sr39tk]), których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania^{9, 10}. Obecnie dostępnych jest wiele metod obrazowania, w tym pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), obrazowanie optyczne i ultrasonografia 3D o wysokiej częstotliwości, z których każda ma unikalne zalety i ograniczenia¹¹. Na przykład badania obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) mają tę zaletę, że są stosunkowo tanie i wysokoprzepustowe. Z tego powodu w tym badaniu wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego lucyferazy świetlika (fluc) zawartą w genie fuzyjnym i obrazowaniu bioluminescencyjnym (BLI) do krótkoterminowej lokalizacji żywotnych mioblastów C2C12 po implantacji do mysiego modelu DMD (dystrofia mięśniowa na chromosomie X [mdx] myszy)^12-14. Co ważne, BLI dostarcza nam środków do badania kinetyki znakowanych MPC po implantacji i będzie przydatny do wielokrotnego śledzenia komórek w czasie i po migracji. Nasze podejście oparte na genach reporterowych pozwala nam dodatkowo połączyć wiele modalności obrazowania u jednego żywego pacjenta; Biorąc pod uwagę tomograficzny charakter, precyzyjną rozdzielczość przestrzenną i zdolność do skalowania do większych zwierząt i ludzi^10,11, PET będzie stanowić podstawę przyszłych prac, które, jak sugerujemy, mogą ułatwić szybkie przełożenie metod opracowanych w komórkach na modele przedkliniczne i do zastosowań klinicznych.

Protokół

1. Utrzymanie i rozprzestrzenianie się mioblastów C2C12

Umieść mioblasty C2C12 w kolbie o średnicy 75^cm2 i utrzymuj komórki w zmodyfikowanej surowicy orła o wysokim poziomie glukozy Dulbecco (HG-DMEM) uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 10%. Nie pozwól, aby komórki zlały się w dowolnym momencie, ponieważ spowoduje to uszczuplenie populacji mioblastów. Pożywkę należy zmieniać co drugi dzień. Uwaga: przed użyciem zawsze podgrzewaj medium do 37 °C w łaźni wodnej.
Kiedy mioblasty stają się w około 80% zlewne, przejdź komórki do nowej kolby. Aspirować pożywkę hodowlaną. Umyj komórki 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), aby usunąć wszelkie ślady pożywki hodowlanej, która zawiera surowicę hamującą trypsynę. Krótko przepłukać warstwę komórkową 2-3 ml 0,25% (w/v) roztworu trypsyny-EDTA w celu dysocjacji przylegających mioblastów z kolby. Odessać trypsynę i umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
Podczas tej inkubacji przygotować nową kolbę z 9 ml HG-DMEM/10% pożywki FBS. Po trypsynizacji dodaj 10 ml kompletnej pożywki do komórek i pipetuj 4-5 razy, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek w pożywce. Dodać 1 ml zawiesiny komórek do nowej kolby i inkubować w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.

2. Transfekcja komórek C2C12

Gdy komórki osiągną 50% zbieżności, wykonaj transfekcję zgodnie z instrukcjami producenta Invitrogen. Krótko mówiąc, połączyć 90 μl odczynnika Lipofectamine 2000 z 4,5 ml pożywki OPTI-MEM. W innej probówce połącz 36 μg DNA genu reporterowego trifuzji CMV z 4,5 ml OPTI-MEM. Przesuń każdą rurkę, aby się połączyła i odczekaj 5 minut. Połącz zawartość obu probówek, delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzydzieści minut. nuta: Druga kolba powinna być również zainstalowana dla nietransfekowanych komórek, które otrzymują tylko Lipofektaminę i OPTI-MEM jako kontrolę negatywną.
Usunąć pożywkę z komórek C2C12 i dodać 15,5 ml świeżej pożywki HG-DMEM/10% FBS. Dodaj pożywkę do transfekcji, aby uzyskać całkowitą objętość do 20 ml.
Pozostawić komórki do transfekcji przez noc przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C.
Następnego dnia odessać pożywkę do transfekcji i dodać 10 ml HG-DMEM/10%FBS.
Zobacz komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Rejestruj zarówno obrazy w jasnym polu, jak i w czerwonej fluorescencji (przy użyciu kostki filtra TRITC; mrfp ex/em: 584/607 nm). Policz liczbę komórek wyrażających zapytania ofertowe oglądanych we fluorescencji podzieloną przez całkowitą liczbę komórek oglądanych w jasnym polu dla wielu pól widzenia, aby wygenerować wydajność transfekcji.

3. Ocena przeżywalności komórek/test MTT

Na dzień przed transfekcją wprowadzić 1x10⁵ komórek C2C12 do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce. Komórki należy posiać w objętości 500 μl w HG-DMEM/10%FBS.
Następnego dnia transfekuj mioblasty przez noc, jak opisano wcześniej. Postępuj zgodnie z sugestiami producenta dotyczącymi objętości odczynników do transfekcji dla płytki 24-dołkowej. Inkubować zestaw studzienek z samą lipofekcaminą (bez DNA) jako kontrolą. Zobacz komórki pod fluorescencją, aby upewnić się, że nastąpiła prawidłowa transfekcja.
Usunąć pożywkę transfekcyjną i inkubować mioblasty z 5 mg/ml bromku tiazolilu niebieskiego tetrazolu (MTT) w HG-DMEM/10% FBS. Dodać D-lucyferynę do ośmiu transfekowanych studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.
Usuń pożywkę ze studzienek. Rozpuszczaj niebieskie kryształy formazanu, dodając 180 μl izopropanolu do każdego dołka. Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 15 min.
Unikając wytrącania się, odpipetować roztwór do 96-dołkowej płytki i odczytać absorbancję przy 575 nm.

4. Przygotowanie mioblastów do przeszczepu

Usuń pożywkę, umyj mioblasty HBSS i trypsynizuj komórki, jak opisano w 1.1.
Ponownie zawiesić komórki w 4 ml kompletnego podłoża.
Za pomocą hemocytometru policz komórki, aby wygenerować woluminy zawierające 10⁶ mioblastów. Odpipetować objętość do sterylnych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Przy skuteczności transfekcji wynoszącej ~10% wartości te wskazują, że po przeszczepie na skanerze GE ExploreOptix można wykryć 100 000 komórek wykazujących ekspresję lucyferazy.
Osiągnąć końcową objętość wstrzyknięcia wynoszącą 15 μl, zawierającą 10⁶ komórek C2C12. W razie potrzeby odwirować mikroprobówki z prędkością 2 000 obr./min przez jedną minutę. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić komórki w 15 μl HG-DMEM bez FBS.

5. Implantacja komórek

Znieczulić mysz 2% izofluranem/2%O₂. Wyrwij włosy z grzbietowej części kończyny tylnej. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5%izofluranu/2%_O2.
Upewnij się, że mioblasty C2C12 są dobrze zawieszone. Trzymając mysz w pozycji leżącej, wyprostuj tylną kończynę i za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknij komórki bezpośrednio do bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki pod kątem 30 °. Wstrzyknąć transfekowane mioblasty do prawej kończyny tylnej, a nietransfekowane mioblasty do przeciwległej (lewej) kończyny tylnej.
Wykonaj podstawowe skanowanie bioluminescencyjne: Szybko przenieś mysz na stolik w skanerze optycznym, kładąc mysz w pozycji leżącej. Podłącz przewód znieczulający. Aby upewnić się, że mysz pozostaje znieczulona, powinna być obecna druga osoba, która podłączy linię znieczulającą, podczas gdy druga umieszcza zwierzę w skanerze.
Delikatnie wyprostuj kończynę tylną, tak aby miejsce wstrzyknięcia było widoczne. Przyklej tylne kończyny na miejscu delikatnym klejem, takim jak taśma medyczna.
Zamknij komorę i upewnij się, że żadne światło nie ma dostępu do wnętrza skanera, ponieważ zwiększy to wykrywany sygnał tła. Skaner powinien być ustawiony na parametry zawarte w instrukcjach producenta dotyczących obrazowania bioluminescencyjnego. W szczególności upewnij się, że wybrano opcję "brak lasera".
Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół oskubanego obszaru i rozpocznij skanowanie.

6. Wstrzyknięcie substratu fluc, D-lucyferyny, do myszy Mdx

Podczas gdy mysz jest znieczulona dootrzewnowo, wstrzyknąć 150 mg / kg substratu lucyferazy świetlika, D-lucyferyny (z roztworu podstawowego 40 mg / ml, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta).
Odzyskaj mysz i odczekaj 15-minutowy okres pobierania myszy przed przygotowaniem myszy do następnego skanowania.

7. BLI celuje w MPC z ekspresją Luc po wszczepieniu implantu do mysich modeli DMD

Po okresie wchłaniania należy ponownie znieczulić mysz, jak opisano w 5.1.
Przenieś mysz z powrotem do skanera optycznego i wykonaj kolejny skan bioluminescencyjny w taki sam sposób, jak skanowanie w tle.
Chociaż 20-minutowy okres absorpcji powinien zapewnić maksymalną intensywność sygnału, można wykonać kolejne skanowanie.
Po zakończeniu pozyskiwania obrazu poświęć mysz zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt i Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). Wyizoluj mięsień kończyny tylnej i natychmiast umieść w 10% formalinie, aby utrwalić do osadzenia parafiny. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne dla lucyferazy, aby potwierdzić domięśniowe wstrzyknięcie mioblastów.